蝴蝶兰液泡型ATP酶E亚基基因的克隆及序列分析

E亚基是液泡型ATP酶(V-ATPase)多亚基复合体的重要组成部分,响应植物的非生物胁迫,对其基因的克隆及分析有助于阐释其逆境条件下的分子调节机制。根据蝴蝶兰低温诱导差异蛋白的序列设计简并引物,利用RT-PCR和RACE技术从蝴蝶兰叶片中克隆获得2条V-ATPase E亚基的c DNA序列,分别命名为Ph VHA-Ea和Ph VHA-Eb,Gen Bank登录号分别为KT758849和KT758850。Ph VHA-Ea和Ph VHA-Eb全长分别为960 bp和1 036 bp,二者均具有687 bp的开放阅读框,编码228个氨基酸,包含相同的v ATP-synt_E保守域;生物信息学分析表明,2个序列编码蛋白具有相似的二级结构和相同的亲水性,预测的三级结构也相同。系统进化树分析显示,蝴蝶兰Ph VHA-Ea和Ph VHA-Eb与单子叶植物液泡型ATP酶E亚基距离最近。

沉默液泡型ATP酶c亚基ATP6V0C抑制人前列腺癌细胞侵袭的分子机制

目的:采用RNA干涉技术沉默液泡型ATP酶c亚基ATP6V0C的表达,探索ATP6V0C在前列腺癌侵袭中的分子作用机制,并研究其与LASS2/TMSG1的关系。方法与结果:ATP6V0C在高转移潜能人前列腺癌细胞系(PC-3M-1E8和PC-3M)中的表达明显高于低转移潜能人前列腺癌细胞系(PC-3M-2B4和PC-3),选择ATP6V0C表达量最高的PC-3M-1E8细胞进行基因沉默实验,发现ATP6V0C的siRNA转染PC-3M-1E8后,其基质金属蛋白酶2(matrix metalloprotein-2,MMP-2)和基质金属蛋白酶9(MMP-9)蛋白的表达量及MMP-2的分泌量均无明显变化,但上清液中MMP-9的活性明显减弱,与空白对照组及阴性对照组相比,差异有统计学意义(P<0.05);干扰组细胞外氢离子浓度及液泡型ATPase的活性明显降低(P<0.05);细胞划痕修复实验及transwell体外侵袭实验结果显示ATP6V0C siRNA干扰组细胞的体外迁移及侵袭能力明显减弱(P<0.05)。PC-3M-1E8细胞转染ATP6V0C siRNA后,LASS2/TMSG1的表达明显减弱(P<0.05)。免疫荧光双重染色结果显示ATP6V0C蛋白与LASS2/TMSG1共定位于胞浆和胞膜,干扰组共定位信号与对照组相比明显减弱。结论:特异性siRNA沉默ATP6V0C能抑制人前列腺癌细胞的迁移和侵袭能力,其机制与ATP6V0C沉默后抑制V-ATPase的活性,使细胞外氢离子浓度降低,抑制MMP-9的激活,从而影响细胞外基质的降解和重塑有关。靶向siRNA干扰ATP6V0C的表达后,可能通过反馈调节机制抑制LASS2/TMSG1的表达,但其具体分子机制尚待进一步研究。

液泡型ATP酶C亚基ATP6V0C在人前列腺癌细胞系中的表达及其意义

目的探讨液泡型ATP酶C亚基ATP6V0C在不同转移潜能人前列腺癌细胞系中的表达及其意义。方法采用半定量RT-PCR、荧光实时定量RT-PCR和Western blot法检测ATP6V0C在人不同转移潜能前列腺癌细胞系PC-3M-1E8、PC-3M(高转移潜能)和PC-3M-2B4、PC-3(低转移潜能)中的表达。结果 ATP6V0C在PC-3M-1E8、PC-3M细胞系中的mRNA及蛋白表达量均明显高于在PC-3M-2B4、PC-3细胞系中的表达,其中,ATP6V0C在PC-3M-1E8中的表达最高,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论 ATP6V0C在高转移潜能人前列腺癌细胞系中的表达明显高于低转移潜能人前列腺癌细胞系,证明其和肿瘤的转移密切相关,有可能成为判断人前列腺癌侵袭和转移的重要指标及治疗前列腺癌的新靶点。

肿瘤转移抑制基因LASS2/TMSG1 S248A突变体通过增加ATP6V0C表达促进前列腺癌的侵袭

目的:探讨LASS2/TMSG1及其突变体在前列腺癌细胞增殖、迁移和侵袭中的分子作用机制。方法:构建表达LASS2/TMSG1全长及其4个突变体的pc DNA3真核表达载体,并稳定转染到高转移潜能前列腺癌PC-3M-1E8细胞系中;采用q PCR和Western blot法鉴定稳定转染效果,并分析不同点突变体对LASS2/TMSG1和ATP6V0C表达量的影响;采用生长曲线测定、四甲基偶氮唑蓝(MTT)掺入实验、软琼脂集落形成实验、细胞划痕修复实验、Matrigel穿膜侵袭实验和流式细胞术研究LASS2/TMSG1及其4个点突变体的细胞生物学功能,并通过免疫双重荧光染色分析LASS2/TMSG1不同突变体和ATP6V0C的相互作用情况。结果:q PCR和Western blot检测显示LASS2/TMSG1 S248A组较LASS2/TMSG1野生型组ATP6V0C表达增加了3倍(P<0.05),且免疫双重荧光染色结果显示LASS2/TMSG1 S248A组ATP6V0C表达明显增加;与LASS2/TMSG1野生型组相比,LASS2/TMSG1 S248A组的细胞增殖能力、锚着不依赖生长能力、细胞迁移能力(细胞迁移率从35.3%±3.2%增加到70.3%±3%)和侵袭能力(穿膜细胞数从50.0±3.2增加到203.0±6.5)明显提高(P<0.05),G0/G1期比例增加(从51.0%增加到85.4%,P<0.05),但细胞凋亡率亦明显升高(从7%增加到15.1%,P<0.05)。结论:LASS2/TMSG1第248位丝氨酸突变为丙氨酸后(S248A)能促进前列腺癌细胞增殖、迁移和侵袭能力,其分子机制可能是LASS2/TMSG S248A使ATP6V0C表达量增加,进而促进前列腺癌的侵袭,提示LASS2/TMSG1蛋白第248位丝氨酸是抑制前列腺癌侵袭的重要功能位点。

Ⅱ期结肠癌患者术后化疗后液泡型ATP合酶的表达及临床意义

目的探讨液泡型ATP合酶（V-ATPase）表达与术后辅助化疗的Ⅱ期结肠癌患者临床病理特征关系及其临床意义。方法分别从复发组和未复发组患者中随机选取30例Ⅱ期结肠癌组织和配对癌旁组织，采用反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）和实时定量聚合酶链反应（Real-timePCR）检测V-ATPase基因的mRNA表达量，用免疫组织化学EnVinsion法检测V-ATPase基因在化疗后71例未复发患者和35例复发患者癌组织及相应癌旁正常组织中的蛋白表达量。采用χ2检验比较计数资料之间差异，通过COX比例风险模型评估风险。结果复发组和未复发组癌组织中V-ATPasemRNA的平均表达量分别是7．45、2．52（r=14．39，P〈0．01）。免疫组织化学结果显示V-ATPase在复发和未复发患者癌组织中阳性表达率为分别为94．3％（33／35）、50．7％（36／71）（χ2=19．60，P〈0．01）。V-ATPase过表达者术后化疗后5年无瘤生存率和总体生存率均降低。结论V-ATPase基因是影响Ⅱ期结肠癌术后化疗患者生存率的独立预后因素，可能是评估Ⅱ期结肠癌复发风险的高危因素。

肿瘤转移抑制相关基因1与肿瘤关系的研究进展

肿瘤是威胁人类生命的重要疾病之一,而转移则已成为肿瘤的重要致死原因,因此,与肿瘤转移相关的诊断、治疗及预后判断具有重要意义。肿瘤转移抑制相关基因1(TMSG-1),又称为人源性长寿保障基因2,是近年新发现的一种重要肿瘤转移抑制相关基因,其主要功效是正性调节细胞凋亡以及负性调节肿瘤细胞的侵袭及转移。多种肿瘤的发展均与TMSG-1基因的表达相关,尽早将其影响肿瘤发生、发展的机制研究透彻,对肿瘤的监测和治疗具有深远影响。