油莎豆液泡膜内在蛋白基因CeTIP1;1的克隆与分析

液泡膜内在蛋白(TIP)是一类定位在液泡上具有高效水分转运活性的水通道蛋白,其在植物的生长发育及逆境响应中发挥重要作用。油莎豆起源于非洲和地中海沿岸,是迄今唯一已知在块茎中高水平积累油脂的新型草本油料作物。研究基于油莎豆的基因组和转录组数据对一个块茎高水平表达的TIP基因进行了克隆和鉴定。序列分析显示,CeTIP1;1包含2个内含子,编码区长756 bp,编码251个氨基酸,含有一个水通道蛋白特有的MIP结构域,分子量为25.75 kDa、等电点为6.01、不稳定系数为24.90、总平均疏水指数为0.831、脂肪族指数为107.77,属于稳定的酸性疏水型蛋白。进化分析显示,CeTIP1;1与水稻的OsTIP1;1聚在一起,序列相似性高达92.83%,支持其归为TIP1亚类。亚细胞定位分析显示,CeTIP1;1定位在烟草叶片的液泡膜。表达分析显示,CeTIP1;1组成型表达,其在分析的所有组织中均高水平表达;在块茎的发育过程中,基因呈现先升后降的近钟形趋势。这些结果为深入解析油莎豆块茎的水分平衡机制奠定了坚实的基础。

液泡膜水通道蛋白γ-TIP表达载体的构建及其抗体的制备

利用PCR技术，从拟南芥（Arabidopsisthaliana（L．）Heynh．）液泡膜水通道蛋白γ－TIP的cDNA中扩增了含水通道特异保守区的205bp片段，并将其构入pGEX－KG原核表达载体。酶切、测序分析表明构建的重组质粒pGEX-TIP结构正确。0．4mmol/L的IPTG可诱导表达分子量为32kD融合蛋白GST-TIP，表达蛋白以包涵体形式存在，约占菌体总蛋白的50％。实验用SDS-PAGE制备电泳从菌体的超声裂解液中纯化了GST-TIP融合蛋白，以此融合蛋白为抗原制备了高质量的液泡膜水通道蛋白的抗体，为研究水通道蛋白在组织中的定位及生理功能提供了有用的蛋白探针。

红树植物秋茄中液泡膜内在蛋白(TIP)全长cDNA的克隆和表达分析(英文)

利用cDNA快速末端扩增 (RACE )技术获得红树植物秋茄液泡膜内在蛋白 (TIP)的全长cDNA (GenBank登录号 :AF5 2 1135 )。该cDNA全长为 1 1kb ,含有一个 75 6个核苷酸的完整开放阅读框 ,编码 2 5 2个氨基酸 ,等电点为5 77,分子量为 2 6 3kD。该氨基酸序列含有 6个跨膜区和两个高度保守的Asparagine proline alanine (NPA)基序。与冬葡萄、花椰菜、拟南芥的TIP相比 ,氨基酸的一致性达到 77%～ 79%。Northern分析表明盐分抑制该基因在红树 3个种中的表达 ,这种下调表达可能降低液泡膜水分渗透 ,有利于盐胁迫下细胞的保水。

低频脉冲超声干预膝骨关节炎模型兔关节软骨及滑膜水通道蛋白3的表达

背景:研究表明,低频脉冲超声能促进全层关节软骨缺损修复,延缓实验性早期骨关节炎的病变进展。水通道蛋白3存在于关节软骨及滑膜上,并在骨关节炎的发病机制中发挥重要作用。目的:探讨低频脉冲超声对实验性膝骨关节炎兔关节软骨及滑膜水通道蛋白3表达的影响。方法:成年新西兰兔左后膝关节用管型石膏固定于伸直位制动6周制备实验性兔膝关节骨关节炎模型,造模成功后随机分为两组:实验组予以低频脉冲超声治疗(频率为1MHz,功率为2.0W),1次/d,15min/次;对照组不接受超声治疗。分别于治疗后2,4,8周,采用免疫组织化学方法观察兔关节软骨及滑膜水通道蛋白3的表达。结果与结论:随着造模后时间的延长,各组兔关节软骨及滑膜水通道蛋白3的表达均有所增加;与对照组比较,实验组兔关节软骨及滑膜水通道蛋白3表达明显降低(P<0.01)。说明低频脉冲超声能降低实验性兔膝骨关节炎关节软骨及滑膜水通道蛋白3的表达,从而缓解关节肿胀,延缓软骨及滑膜的退变,具有软骨及滑膜保护作用。

麝香百合液泡膜水孔蛋白基因LlTIP2的克隆及生物信息学分析

水孔蛋白是位于质膜和液泡膜等生物膜上主要负责水分跨膜运输的通道蛋白,属于膜主要内在蛋白(major intrinsic proteins,MIP)超家族。采用RT-PCR和RACE法从麝香百合(Lilium longiflorum)叶片克隆得到1个液泡膜内在蛋白(tonoplast intrinsic proteins,TIPs)基因的全长cDNA序列,命名为L1TIP2(GenBank登录号:JN085950)。该基因cDNA全长986 bp,包括208 bp的3'-非翻译区,744 bp开放阅读框以及34 bp的5'-非翻译区,共编码247个氨基酸。由L1TIP2推导的氨基酸序列具有2个高度保守的水孔蛋白NPA(Asn-Pro-Ala)基序以及MIP的特征序列SGGHVNPAVTFG。同源性分析表明,LlTIP2氨基酸序列与陆地棉(Gossypium hirsutum)、大麦(Hordeum vulgare)、黑麦草(Lolium perenne)和小麦(Triticum aestivum)等植物TIP2的同源性分别达77%、74%、73%和72%。系统进化树分析表明LlTIP2属于液泡膜水孔蛋白TIP2亚类新成员。

菜用大豆液泡膜内在蛋白(TIPs)基因鉴定及表达分析

TIPs(tonoplast intrinsic proteins)是一类定位于液泡膜或液泡形成体上的水通道蛋白,在植物响应逆境胁迫中发挥重要作用。本研究利用大豆基因组数据库,在全基因组水平鉴定到23个GmTIPs基因。染色体定位分析发现GmTIPs基因分布在大豆17条染色体上。蛋白多序列比对分析发现所有GmTIPs含有典型的6个保守的跨膜螺旋(TM1 to TM6)和2个保守的氨基酸元件NPA盒(Asp-Pro-Ala box)。蛋白特性分析发现GmTIPs的氨基酸数目在237~255之间,分子量在24.08~27.11k D之间,等电点在5.08~10.01之间。进化关系分析显示,大豆GmTIPs可划分为5个分支(TIP1,TIP2,TIP3,TIP4和TIP5),与拟南芥分类一致,且每个分支均含有这两个物种中的TIPs成员,暗示同一分支TIPs基因成员可能具有相似的基因功能。进一步利用q RT-PCR技术分析了5个GmTIPs候选基因对逆境胁迫(干旱和高盐)及激素信号(脱落酸ABA、乙烯前体ACC)的响应情况。结果显示,这些环境胁迫及外源激素均可以诱导GmTIPs基因在根和叶这两种组织中的上调或下调表达。其中,干旱和高盐两种胁迫诱导GmTIP2;6在根中上调表达最为明显。然而,干旱胁迫分别诱导GmTIP2;1、GmTIP2;2和GmTIP4;1在叶中显著上调表达。激素ACC处理诱导GmTIP2;2在根中明显上调表达。以上结果为进一步探讨GmTIPs基因的抗逆功能、分子机制及其在菜用大豆分子育种中的应用提供重要依据。

正常和膜迷路积水豚鼠内耳水通道蛋白的表达及意义

目的检测正常和膜迷路积水豚鼠内耳水通道蛋白(aquaporins,AQPs)的表达,探讨其机理和意义。方法 20只健康豚鼠随机分为实验组和对照组,每组10只,实验组(膜迷路积水模型组)豚鼠腹腔注射醋酸去氨加压素,4μg·kg-1·d-1,共1周,诱导其内耳膜迷路积水,对照组豚鼠腹腔注射等量生理盐水。用免疫组化方法检测两组豚鼠内耳水通道蛋白的表达,并进行比较。结果对照组豚鼠内耳中有AQP0、1、2、3、5、7、8的表达,其中AQP0仅在血管纹和螺旋神经节细胞有较弱的表达;AQP1分布于包绕骨迷路、内淋巴囊、内淋巴管的纤维细胞,基底膜鼓阶面细胞、螺旋韧带纤维细胞、螺旋缘纤维细胞、Corti’s器、内外螺旋沟、血管纹、椭圆囊壁、球囊壁、螺旋神经节等;AQP2表达在血管纹、Corti’s器、螺旋神经节细胞和内淋巴囊中;AQP3、7、8三者的分布类似,在螺旋神经节和包绕膜迷路的组织中表达,包括Corti’s器、内外螺旋沟、血管纹、螺旋韧带纤维细胞、螺旋缘、椭圆囊壁、球囊壁、内淋巴囊等;AQP5则表达在Corti’s器、内外螺旋沟、螺旋神经节、螺旋韧带纤维细胞。实验组豚鼠内耳中,血管纹AQP2的表达与对照组较正常豚鼠表达增加,其它亚型AQPs的表达与对照组无明显差异。结论正常豚鼠内耳中有多种AQPs表达,膜迷路积水后豚鼠内耳中AQP2的表达增强,提示膜迷路积水可能与AQP2表达上调有关。

乙酰唑胺对类风湿关节炎滑膜细胞水通道蛋白1,3表达的影响

目的观察乙酰唑胺(AZ)对类风湿关节炎成纤维细胞样滑膜细胞(RAFLS)的水通道蛋白1(AQP1)和AQP3表达的影响,与骨关节炎(OA)对比,初步探讨AQP1、AQP3在RA发病中的作用。方法收集12例RA患者和10例OA患者膝关节积液,从关节液中分离RAFLS及OAFLS并行体外培养,(10-4、10-6、10-8)mol/L AZ分别处理RAFLS 24、48、72 h,应用半定量反转录-聚合酶连反应(RT-PCR)方法检测RAFLS和OAFLS中AQP1和AQP3 mRNA的表达;免疫荧光细胞化学染色检测10-4mol/L AZ处理OAFLS和RAFLS 24、48、72 h,AQP1蛋白的表达。结果 RAFLS AQP1 mRNA和RAFLS AQP3 mRNA均有表达。RAFLS AQP1 mRNA表达水平较OAFLS AQP1 mRNA明显增加,差异有统计学意义(P<0.05)。不同浓度AZ处理后RAFLS AQP1 mRNA表达水平较对照组明显减低(P<0.05),呈时间、剂量依赖性。不同浓度AZ处理后,RAFLS AQP3 mRNA表达水平各组间以及与对照组相比差异无统计学意义,与OAFLS AQP3 mRNA表达水平差异也无统计学意义(P>0.05);AQP1蛋白主要分布于RAFLS细胞膜,未经AZ处理的滑膜细胞AQP1蛋白表达阳性明显,AZ处理后的AQP1蛋白表达减弱,且成时间依赖性。结论 AQP1可能与RA关节腔积液形成有一定关系,AZ选择性下调RAFLS中AQP1的表达,对AQP3的表达无明显影响。

小鼠水通道蛋白1基因慢病毒载体构建及其在神经膜细胞中的表达

目的构建表达小鼠水通道蛋白1(AQP1)基因的慢病毒载体,体外感染原代培养的C57BL/6小鼠神经膜细胞,观察是否提高AQP1的表达,为进一步研究AQP1与周围神经系统损伤后水肿的关系奠定基础。方法将小鼠AQP1基因克隆到慢病毒pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP载体,通过PCR和测序鉴定获得连接正确的克隆。将鉴定后的重组表达质粒pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP-AQP1与包装质粒psPAX2、pMD共转染293T细胞,制备携带AQP1基因的慢病毒lentivirus-AQP1。体外培养C57BL/6小鼠的神经膜细胞,将lentivirus-AQP1感染神经膜细胞,RT-PCR和蛋白质印迹法检测感染后神经膜细胞AQP1 mRNA和蛋白的表达情况。结果构建的慢病毒载体pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP-AQP1经PCR鉴定和测序正确。慢病毒lentivirus-AQP1感染神经膜细胞后AQP1表达增加(P<0.05)。结论成功构建了小鼠AQP1基因的慢病毒表达载体,该载体能有效感染神经膜细胞,使AQP1 mRNA和蛋白表达水平增高。

水通道蛋白11在羊水量过少产妇胎盘和胎膜中的表达变化及意义

目的探讨水通道蛋白(AQP)11在特发性羊水过少产妇胎盘和胎膜中定性及相对定量表达情况及其在羊水平衡过程中的作用。方法选择在兰州大学第一医院经剖宫产分娩的55例产妇,其中25例特发性羊水过少者作为实验组,30例羊水量正常的足月产妇为对照组。采用SABC免疫组化法和实时荧光定量PCR技术,检测两组产妇羊膜、绒毛膜、胎盘中AQP11的表达及分布。结果 AQP11在足月妊娠产妇羊膜、绒毛膜及胎盘中均有表达,且在羊膜的表达与羊水量呈正相关,在胎盘的表达与羊水量呈负相关;在不同羊水量的绒毛膜的表达均呈增加趋势。结论AQP11在妊娠晚期羊水量调节中可能发挥着重要作用。

水通道蛋白1、2、5在膜迷路积水豚鼠耳蜗中的分布及表达研究

目的观察水通道蛋白(aquaporin,AQ)1、2、5(AQP1、AQP2、AQP5)三种蛋白在膜迷路积水豚鼠耳蜗的表达及分布情况,探讨其在内淋巴积液中可能的发生机制。方法选择健康红目豚鼠60只,随机分为空白组(30只)和模型组(30只),模型组给予醋酸去氨加压素6μg·kg-1·d-1腹腔注射10 d,空白组以1 ml生理盐水腹腔注射10 d;常规饲养7天后取出耳蜗,通过免疫组化、Western-blot方法观察AQP1、AQP2、AQP5蛋白在豚鼠耳蜗的分布及表达。结果免疫组化示空白组、模型组豚鼠耳蜗组织中AQP1表达的光密度值分别为0.134±0.021、0.273±0.053;AQP2表达分别为0.089±0.013、0.261±0.100;AQP5表达分别为0.264±0.065、0.151±0.098;与空白组比较,模型组AQP1、AQP2蛋白表达明显上调(P<0.01),AQP5蛋白表达明显下调(P<0.05)。Western-blot示空白组、模型组豚鼠耳蜗组织中AQP1表达分别为0.214±0.034、0.313±0.032;AQP2表达分别为0.283±0.050、0.544±0.042;AQP5表达分别为0.291±0.041、0.199±0.033;与空白组比较,模型组AQP1、AQP2蛋白表达上调(P<0.01),AQP5蛋白表达明显下调(P<0.05)。结论AQP1、AQP2、AQP5蛋白均可能参与了豚鼠耳蜗膜迷路积水的发生。

水通道蛋白4与大鼠蛛网膜下腔出血后脑水肿形成的关系及地塞米松的影响

成年Wistar大鼠84只,随机分为对照组(6只)、假手术组(6只)、蛛网膜下腔出血(SAH)组(36只)及地塞米松(DEX)组(36只)。枕大池二次自体注血法制备SAH大鼠模型,Loeffler法进行大鼠神经行为学评分,取出脑组织后用干湿比重法检测脑组织含水量,Western-Blot法检测脑组织水通道蛋白(AQP)4。SAH后1d脑含水量和AQP4表达开始增加,2d即明显增加,之后逐渐递增,至7d达高峰。AQP4蛋白的表达和脑含水量呈正相关,r=0.99,P<0.01。DEX 2 d组脑组织AQP4蛋白表达水平较SAH 2 d组下降,P<0.05。认为AQP4与SAH后脑水肿的形成密切相关,DEX不能明显下调AQP4蛋白的表达而减轻SAH性脑水肿。

膜迷路破坏动物模型中水通道蛋白-1的表达及其意义

目的检测水通道蛋白-1在膜迷路破坏豚鼠耳蜗及内淋巴囊中的表达情况。方法以氯仿鼓室注射制造豚鼠膜迷路破坏的动物模型,运用免疫组化二步法在不同的时间点上检测膜迷路破坏豚鼠耳蜗及内淋巴囊中水通道蛋白-1的表达。结果耳蜗中AQP-1的表达表现出一种波动性过程,即随螺旋韧带细胞形态的破坏出现下调,而后当螺旋韧带细胞出现再生时AQP-1的表达出现上调。在内淋巴囊处水通道蛋白-1的表达则无明显改变。结论水通道蛋白-1可能参与维持耳蜗螺旋韧带处结构的稳定性。

水通道蛋白-4对蛛网膜下隙出血后脑水肿的影响

目的研究大鼠蛛网膜下隙出血(SAH)后脑水肿病理过程中水通道蛋白-4(AQP-4)的表达与脑水肿形成之间的关系。方法采用大鼠断尾取血,枕大池注入自体血的方法制作大鼠SAH模型,用干湿质量法和免疫组化法分别检测SAH后不同时间段脑含水量和AQP-4蛋白表达的变化。结果SAH后8 h,脑组织AQP-4蛋白在脑水肿区表达开始增强,至2 d达到高峰,此时脑组织严重水肿;第7天,AQP-4的表达已减少,脑水肿减轻。结论SAH后AQP-4表达明显增强,与脑水肿呈正相关关系。AQP-4可能在SAH后脑水肿的形成过程中起重要作用。

菠萝液泡膜水通道蛋白基因AcTIP1-1的克隆、重组载体构建

以菠萝(Ananas comosus(Linn.)Merr.)果实为材料,通过RT-PCR分别扩增液泡膜水通道蛋白基因(AcTIP1-1)(GenBank登录号:XM_020238793.1)的开放阅读框(ORF)和编码区(CDS)序列,序列长度分别为753 bp和750 bp.将ORF序列亚克隆到载体pET32a(+)上,CDS序列被亚克隆到载体pSP64 Poly(A)上,构建成重组载体pET32a(+)-AcTIP1-1和pSP64 Poly(A)-AcTIP1-1.pET32a(+)-AcTIP1-1可为诱导表达并纯化融合蛋白制备抗体,pSP64 Poly(A)-AcTIP1-1可为制备含有Poly(A)+的AcTIP1-1转录子奠定基础.

自发性蛛网膜下出血大鼠脑水肿与水通道蛋白-9的表达

目的:旨在探讨自发性蛛网膜下出血大鼠模型中,神经组织内水通道蛋白9(AQP9)表达变化,了解自发性蛛网膜下出血这一病理生理过程中AQP9与脑水肿的变化,并试图揭示出其相关性。方法:健康成年雄性大鼠60只,随机分为假手术组、SAH组,建立大鼠自发性蛛网膜下出血模型。分别建模后24h、48h及72h断头、取脑,测脑含水量,并利用RT-PCR技术检测大鼠脑组织在自发性蛛网膜下出血后AQP9的表达。结果:大鼠自发性蛛网膜下出血后,脑含水量增高,AQP9呈现高表达,且于72h内逐渐递增,明显高于对照组(P<0.05)。结论:自发性蛛网膜下出血后AQP9高表达和脑水肿呈现正相关,二者可能存在相关性,前者或为后者的原因之一,对自发性蛛网膜下出血后脑水肿而言意义重大。

油莎豆水通道蛋白基因CeTIP2;1的克隆与分析

油莎豆起源于非洲和地中海沿岸,是一种在块茎中高水平积累油脂的新型草本油料作物。水分平衡对于块茎的发育与代谢至关重要。液泡膜内在蛋白(TIP)是一类液泡膜定位并具有高效水分转运活性的水通道蛋白,包含TIP1~5等5个亚类。本研究基于油莎豆的基因组和转录组数据,采用RT-PCR技术对1个块茎高水平表达的TIP基因CeTIP2;1进行克隆。序列分析表明:CeTIP2;1的基因全长3323 bp,含有2个内含子,编码区长747 bp,编码248个氨基酸,理论分子量为24.73 kDa,等电点为5.09,总平均疏水指数为0.948,脂肪族指数为114.60,不稳定系数为21.76,属于稳定的酸性疏水型蛋白,与其液泡膜定位一致;该蛋白含有保守的MIP结构域,其中包括6个跨膜螺旋、2个半螺旋以及2个典型的NPA基序。CeTIP2;1与AtTIP2;1的序列相似性高达87.20%,远高于与SoPIP2;1的46.23%。进化分析进一步证实,CeTIP2;1隶属于TIP2亚类,是AtTIP2;1的直系同源基因。进化分析同时显示TIP2亚类早在单、双子叶植物分化之前就已经进化出2个小组。表达分析显示:CeTIP2;1在叶片、叶鞘、根、芽尖、匍匐茎、块茎等主要组织中均有较高水平的表达,丰度最高的是块茎和匍匐茎,最低的为芽尖;在块茎的发育过程中,呈现先升后降的钟形趋势,峰值出现在膨大中期,最低的为成熟期。此外,CeTIP2;1还在块茎的蛋白组中被检测到,表明其功能的重要性。这些结果为进一步揭示油莎豆的块茎水分平衡机制奠定坚实的基础。

HL60细胞质膜上存在水通道蛋白

采用细胞影像系统，测定了HL60细胞转运水分活力．结果表明，HL60细胞在低渗介质中体积迅速增大，且随着渗透梯差的加大而显著增大；在渗透液液的质量摩尔浓度梯差为100，150，200mmol·kg-1下，Pf值分别为0.14×10-3,0.40×10-3，0.43×10-3cm·s-1；并且发现HL60细胞转运水分活力可以被HgCl2抑制．由此可见，HL60细胞转运水分活力表现出典型的水通道蛋白的特征，暗示HL60细胞质膜上存在水通道蛋白．

橡胶树水通道蛋白HbPIP1;4的亚细胞定位与多聚化分析

质膜内在蛋白(PIP)隶属于水通道蛋白家族,其以细胞膜定位并具有高效的水分转运活性而著称。PIP高度保守,主要包含PIP1和PIP2两个亚类。天然橡胶是重要的工业原料和战略物资,其主要来源为巴西橡胶树。作为橡胶合成和储藏的特异组织,乳管与邻近的薄壁细胞之间缺乏胞间连丝,其水分平衡主要由PIP介导。通过前期研究,团队鉴定到一个PIP1亚类成员HbPIP1;4,该基因在乳管中高水平表达,然而,其在蟾蜍卵母细胞中异源表达却无水分转运活性,推测因不能有效定位到细胞膜所致。为探讨HbPIP1;4在植物体内的功能部位及作用模式,本研究构建了其亚细胞定位和双分子荧光互补(BiFC)载体。通过利用农杆菌介导法瞬时转化烟草叶片,再用激光共聚焦显微镜进行观察,发现荧光信号出现在细胞膜,这与生物信息学预测的细胞膜定位结果一致。BiFC实验进一步证实HbPIP1;4定位在细胞膜,结果同时显示,HbPIP1;4可形成同源多聚体,这与3D结构预测结果一致。上述结果为深入揭示乳管的水分平衡机制奠定了坚实的基础。但HbPIP1;4的异源互作模式还有待进一步研究。