液泡膜Na^+/H^+逆向转运蛋白基因沉默对霸王叶气孔特征的影响

以霸王(Zygophyllum xanthoxylum)野生型植株(WT)、液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白基因(Zx NHX)的RNA干扰(Zx NHX-RNAi)株系L2和L7为材料,分析了Zx NHX沉默后霸王叶下表皮气孔特征的变化情况。结果表明,50 mmol·L-1Na Cl处理下,Zx NHX-RNAi株系叶下表皮气孔开度达到峰值的时间比WT延迟了4 h;渗透胁迫下,L7气孔开度的峰值比WT显著下降12%。对照条件下,L7气孔大小显著低于WT,达到峰值的时间比WT延迟6h。无论是对照条件还是盐处理或渗透胁迫下,Zx NHX-RNAi株系叶组织含水量均显著低于WT,尤其是盐处理下,L7比WT低40%。可见,Zx NHX通过调控霸王叶的水分状况,进而影响气孔运动。

黄瓜质膜型Na^+/H^+逆向转运蛋白基因(SOS1)的克隆与序列分析

采用RACE(rapid-amplification of cDNA ends)方法从黄瓜Cucumis sativusL.中克隆出质膜Na+/H+逆向转运蛋白基因的cDNA(CsSOS1),该cDNA全长3 638bp,其中开放阅读框为3 435bp,编码1 145个氨基酸。氨基酸同源性分析表明,CsSOS1氨基酸序列与水稻OsSOS1和拟南芥AtSOS1的氨基酸序列同源性较高,分别为64%和58%,而与液泡型的Na+/H+逆向转运蛋白氨基酸序列亲缘关系较远。蛋白质跨膜结构分析表明CsSOS1包含11个完全跨膜片段。激光共聚焦显微镜显示CsSOS1基因的编码区与YFP基因融合后,定位在细胞膜上。酵母功能互补试验结果显示CsSOS1参与Na+与H+的转运,表明该基因转化酵母后可以补充酵母SOS1的缺失。

植物液泡膜Na^+/H^+逆向转运蛋白的研究与应用

液泡膜Na^+/H^+逆向转运蛋白是植物体内广泛存在的一种跨膜转运蛋白,负责植物体内Na^+、H^+的交换。本文对Na^+/H^+逆向转运蛋白的克隆、分子结构、功能及应用等方面展开论述,旨在为研究者系统的理解Na^+/H^+逆向转运蛋白的研究进展,为调控该蛋白的表达来改进植物的生长发育及抗盐胁迫能力等方面的应用提供参考。

液泡膜Na^+/H^+逆向转运蛋白研究进展

Na+/H+逆向转运蛋白在高等盐生植物中具有重要的价值和意义,本文介绍了Na+/H+逆向转运蛋白的发现、功能、分子特征及其与植物耐盐性的关系。

角碱蓬液泡膜Na^+/H^+逆向转运蛋白基因克隆及表达载体的构建

[目的]克隆角碱蓬液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白基因(ScNHX1),并构建其表达载体。[方法]以用400 mmol/L NaCl处理的角碱蓬为材料,利用RT-PCR技术从中克隆ScNHX1,并通过酶切、连接方法将ScNHX1连接至pCAMBIA1302载体中。[结果]试验成功克隆得到ScNHX1,测序得出该基因片段大小为1 617 bp,并成功构建了含该目的基因的表达载体pCAMBIA-ScNHX1。[结论]该研究为耐盐转基因植株的培育奠定了基础。

长叶红砂液泡膜Na^+/H^+逆向转运蛋白基因的克隆及表达特性

为研究长叶红砂(Reaumuria trigyna)离子转运分子机制,利用RT-PCR和RACE技术,克隆到其液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白基因(NHX1)的全长cDNA片段,命名为RtNHX1(NCBI序列号为KR919802)。结果表明:RtNHX1的cDNA片段全长2 622bp,开放阅读框1 662bp,5′非编码区509bp,3′非编码区451bp,编码553个氨基酸,推测分子量为60.91kD。该蛋白含有12个跨膜结构域,为疏水蛋白,与其他植物液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白NHX1的亲缘关系较近。实时荧光定量PCR对其在NaCl胁迫下的表达检测显示,不同时间和不同浓度NaCl胁迫下,RtNHX1表达量变化均呈先升高后降低趋势,在100mmol/L NaCl胁迫6h和200mmol/L NaCl胁迫后达到最高,表达量分别超过或约是对照的3倍,一定程度反应出RtNHX1参与长叶红砂的盐胁迫应答,是该植物离子转运体系的重要元件。

荷花液泡膜型Na^+/H^+逆向转运蛋白基因NnNHX1的克隆与特性分析

采用简并引物和RACE等技术从荷花中分离出液泡膜型Na+/H+逆向转运蛋白基因NHX1的全长cDNA序列,命名为NnNHX1。该基因全长2237bp,预测其编码一个由538个氨基酸组成的多肽,其N-端是一个由11个跨膜结构组成的疏水区域,C-端是一个亲水的尾巴。序列比对表明,NnNHX1与葡萄NHX1等的同源性较高,并且都具有高度保守的氨氯吡嗪咪结合位点序列LFFIYLLPPI。系统进化树表明NnNHX1与液胞膜型Na+/H+逆向转运蛋白关系较近,而与质膜型Na+/H+逆向转运蛋白关系较远。qRT-PCR结果显示NnNHX1基因在植株中属于组成型表达,但经NaCl诱导后,根中NnNHX1的表达量急剧增高后又迅速下降,而叶中的表达量却先缓慢增加后又剧烈下降。

大叶补血草Na^+/H^+逆向转运蛋白基因(SOS1)的克隆与序列分析

用RT-PCR及RACE方法从盐生植物大叶补血草Limonium gmelinii(Willd.)Kuntze中分离出Na+/H+逆向转运蛋白基因的cDNA(LgSOS1,GenBank登录号EU780458),LgSOS1的cDNA全长为3910bp,5′非翻译区为79bp,3′非翻译区为376bp,开放阅读框为3455bp,编码1151个氨基酸,推测分子量为126kD。氨基酸同源性分析表明,LgSOS1与冰叶午时花、沙拐枣、番茄、盐芥和拟南芥质膜型Na+/H+逆向转运蛋白的一致性分别为69.02%,64.42%,61.96%,60.12%和59.62%。预测分析表明,LgSOS1有12个跨膜结构区域。系统发育分析表明该蛋白与质膜型的Na+/H+逆向转运蛋白的亲缘关系较近,与液泡型的Na+/H+逆向转运蛋白亲缘关系较远。

跨膜逆向转运蛋白NHXFS1多克隆抗体的制备及应用

NHXFS1基因是通过DNA家族改组(DNA family shuffling)技术,以拟南芥、水稻和菊花的液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白基因(NHX1)为亲本获得的活性显著增强的新基因。为制备该蛋白的多克隆抗体,对该蛋白进行跨膜结构分析,选取跨膜蛋白的C末端为靶标,并将其克隆到原核表达载体pET32a中,成功构建了原核融合蛋白pET32a-NHXFS1-抗原表达载体,转化大肠杆菌BL21(DE3)并诱导表达。通过镍柱亲和层析纯化该融合表达蛋白,获得了纯度约为80%的纯化蛋白,用于免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体。ELISA实验表明,该抗体的效价达到1:128 000,提取表达NHXFS1蛋白的酵母液泡经该多克隆抗体Western blot检测,证明该抗体具有较好的NHXFS1蛋白特异性。NHXFS1多克隆抗体的制备为进一步认识NHXFS1新蛋白结构与功能以及植物耐盐分子生物学的研究奠定了基础。

筇竹Na+/H+逆向转运蛋白基因克隆与表达分析

为明确液泡型Na+/H+逆向转运蛋白在竹类植物耐盐中发挥的重要作用。本研究从筇竹中克隆出液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白基因,命名为QtNHX1(基因登录号:MT078987),并分析该基因表达特征。结果表明,QtNHX1基因全长为2075 bp,包含1632 bp的开放阅读框(编码544个氨基酸),其相对分子量为59.43 kD,理论等电点(pI)为8.83。QtNHX1具有10个跨膜区域,且与水稻同源性最高,达到90.59%。另外,QtNHX1基因在在筇竹不同组织器官(竹笋,根,茎,叶)均有表达,说明QtNHX1为组成型表达。筇竹根中QtNHX1基因的表达量最高,在竹笋表达量最低。对筇竹进行不同时间(6,12,24 h)的NaCl胁迫处理,发现QtNHX1基因的表达量随着处理时间的延长而上升,表明QtNHX1基因在调控筇竹耐盐性中发挥着重要作用。

含GmNHX1和LcVP1双价基因植物表达载体构建与转基因棉花的获得

应用DNA重组技术将编码大豆液泡膜Na+/H+反向转运蛋白GmNHX1和百脉根液泡膜H+-PPase LcVP1的开放阅读框片段同时构建在pCambia1301载体中,形成p1301-GmNHX1-LcVP1双价耐盐基因植物表达载体。以Coker 312棉花品种的胚性愈伤组织为外植体,采用根癌农杆菌介导法将其转入棉花中,并利用潮霉素筛选获得抗性植株。对抗性植株的T1幼苗进行分子和生理指标检测,表明外源基因已成功整合到棉花基因组中,并不同程度地提高了转基因株系耐盐能力。

过量表达大叶补血草LgNHX1基因对拟南芥耐盐性的影响

利用植物表达载体pCAMBIA1301和农杆菌GV3101将LgNHX1(全长1 656 bp)基因在拟南芥中过量表达。在含30 mg/L潮霉素的培养基上筛选获得LgNHX1的纯合转化子,并对其进行了分子鉴定和耐盐性分析。结果显示,经PCR和RT-PCR鉴定,野生型植株(对照)没有出现扩增条带,而转基因株系有相应的扩增条带,表明LgNHX1的确已经整合到拟南芥的基因组中,并已正常转录。在不同盐浓度处理下,转基因株系生长情况好于野生型对照;转基因植株地上部分和根的干重、鲜重相对高于野生型对照,但差异没有达到显著水平;当盐浓度达到150-200 mmol/L时,两个转基因株系的Na+含量显著高于野生型,K+含量极显著高于野生型。以上结果表明,过量表达LgNHX1基因可能增强了拟南芥将Na+区隔化至液泡的能力,提高了转基因拟南芥的耐盐能力。

AtNHX5基因过量表达对拟南芥耐盐性的影响

为了研究AtNHX5基因在植物耐盐中的作用,构建了植物过量表达载体pROKⅡ-AtNHX5,并转化拟南芥。结果显示:(1)RT-PCR检测表明,转基因拟南芥中AtNHX5基因的表达大幅提高。(2)对转基因纯合株系进行耐盐性分析显示,AtNHX5过量表达提高了植株在种子萌发和苗期的耐盐性。(3)转基因植株在盐处理下的干重、鲜重以及地上部分Na+、K+含量均高于野生型对照。在200mmol/L NaCl处理下,以转基因株系a1-4为例,其地上部分单株鲜重、单株干重、K+含量分别是野生型的1.27、1.54、1.16倍,较野生型显著升高。研究表明,过量表达AtNHX5基因促进了盐胁迫下转基因植株对K+的吸收,转基因拟南芥的耐盐性明显提高。

过量表达甜菜BvNHX1基因提高拟南芥的耐盐性

Na+/H+逆向转运蛋白调节细胞内的离子平衡,在植物耐盐性起重要的作用。为了研究甜菜液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白BvNHX1基因在植物耐盐中的作用,构建了植物表达载体pROKⅡ-BvNHX1转化拟南芥.在含有卡纳霉素的培养基上筛选转化子,并利用Southern和Northern杂交技术检测,进一步证实BvNHX1基因已整合到拟南芥基因组并能正常转录。选取纯合转基因株系进行耐盐性分析实验表明,过量表达BvN-HX1基因的拟南芥在种子萌发和苗期都提高了植株耐盐性,盐处理下转基因植株的鲜重、干重以及地上部分Na+、K+含量均高于野生型对照。结果表明过量表达BvNHX1基因提高了转基因拟南芥的耐盐能力。

蓖麻RcNHX3基因的克隆与生物信息学分析

液泡膜型Na^+/H^+逆向转运蛋白基因(NHX)是植物抵御盐害的关键基因.本研究利用RACE方法克隆了蓖麻Rc NHX3基因的3'端和5'端片段.最后设计全长引物获得蓖麻RcNHX3全长序列,并对其进行生物信息学分析.结果表明,蓖麻液泡膜型钠氢逆向转运蛋白基因的c DNA完整的开放阅读框序列为1611bp,推测其可编码536个氨基酸;含有Na+/H+交换泵(^(50)NES^(52))是液泡膜型Na^+/H^+逆向转运蛋白重要的特征之一;存在12个跨膜结构域,属于跨膜蛋白;预测NHX3蛋白的二级结构和三级结构.

马蔺NHX基因的克隆与基因表达分析

液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白NHX所特有的液泡Na+区域化功能,在植物耐盐中发挥着极其重要的作用。以马蔺根中总RNA为模板,利用同源克隆方法克隆得到一个NHX基因,命名为IlNHX。序列分析表明该基因的开放阅读框为1 641 bp,编码546个氨基酸,与已知的植物NHX具有较高的同源性(>70%)。预测其蛋白质分子量为60 k Da,等电点为6.67。实时定量PCR分析表明,随着Na Cl浓度的增加,地上部和根中的Il NHX基因表达水平呈增加趋势,且地上部中的表达量显著高于根部,表明Il NHX基因的表达受到盐的诱导和调节。

醋栗番茄NHX4基因及其启动子序列的克隆与分析

本研究在醋栗番茄基因组鸟枪序列的基础上,基于同源序列的保守性,克隆了醋栗番茄液泡膜Na^+/H^+逆向转运蛋白4基因(SpNHX4)的cDNA序列,对其响应盐胁迫的表达模式进行了分析。通过染色体步行法克隆了该基因的启动子区域,并通过生物学软件对该基因编码的蛋白和启动子序列进行分析。结果显示,SpNHX4的c DNA序列包含1 611 bp的开放阅读框,编码536个氨基酸。SpNHX4多肽链中疏水性氨基酸占多数,具有12个明显的跨膜结构区,符合跨膜蛋白的特征。荧光定量PCR结果显示,在NaCl胁迫条件下,SpNHX4在醋栗番茄根、茎和叶中的表达均上调,其中在叶中的表达量变化最为显著。通过PlantCARE软件对SpNHX4上游1 857 bp的启动子序列进行顺式元件预测,发现该启动子区域包含番茄典型的TATA-box"TTTTA"序列和CAAT-box转录增强子序列"CCAAT"。此外,还存在多个与激素、逆境、光诱导相关的元件。这些结果为进一步研究SpNHX4的功能和转录调控机制提供资料。

农杆菌介导马铃薯转化体系的优化及转基因马铃薯的耐盐性研究

通过农杆菌介导的方式将獐茅液泡膜Na^+/H^+逆向转运蛋白基因(AlNHX)表达在马铃薯中,并对影响马铃薯转化的几种因素(抗生素浓度、农杆菌菌液浓度、共培养时间等)进行优化。结果表明:最适农杆菌菌液浓度是OD600=0.6,最适侵染时间是5min,最适共培养时间是2d,马铃薯转化中最适头孢霉素浓度是400mg/L;经PCR检测确认的转基因马铃薯植株在含0.7%NaCl的培养基中可以生长,而野生型马铃薯无法在此培养基中正常生长。在盐胁迫条件下,转基因马铃薯的Na^+、K^+含量及K^+/Na^+的比值均高于野生型马铃薯。研究证实马铃薯植物的的耐盐性可以通过农杆菌转化导入獐茅液泡膜Na^+/H^+逆向转运蛋白基因而得到提高。