小反刍兽疫病毒液滴式数字PCR检测方法的建立及应用

为实现小反刍兽疫病毒(Peste des petits ruminants virus,PPRV)的快速、准确、定量检测,以国内PPRV Clone 9疫苗株N基因为靶位点设计特异性引物及探针,建立了液滴式数字PCR(Droplet digital PCR,ddPCR)方法,并对其特异性、敏感性及重复性进行评价。将所建立的ddPCR方法与实时荧光定量PCR(Fluorescence quantitative PCR,qPCR)方法的灵敏度进行比较分析并应用于PPRV(Clone 9株)核糖核酸标准物质的定量。结果显示,所建立的ddPCR方法特异性好,仅PPRV检测结果为阳性,其他羊源病毒类生物制品及毒种检测结果均为阴性;敏感性高,基因拷贝数检出限度为4.33拷贝/μL,比qPCR方法的灵敏度(57.3拷贝/μL)高10倍;重复性好,重复性试验的变异系数为1.8%;定量准确,具有一定资质的9家单位各组测量数据组间变异系数小于5%。试验建立的ddPCR方法能够有效地对PPRV核酸进行快速检测,为PPRV的诊断及绝对定量提供了有效方法。

液滴式数字PCR与实时荧光定量PCR检测利什曼原虫的方法比较

目的建立内脏利什曼病液滴式数字PCR检测方法,将其与同时建立的实时荧光定量PCR检测方法进行方法学比较,探究其在内脏利什曼病诊断方面的价值。方法以杜氏利什曼原虫小环动基体DNA(kinetoplast DNA,kDNA)为分子靶标,根据其约200 bp的保守片段设计引物和探针,建立内脏利什曼病液滴式数字PCR检测方法,比较其与实时荧光定量PCR检测方法的检测限、精密度以及在不同利什曼原虫虫株中的检测效果。结果液滴式数字PCR检测下限与实时荧光定量PCR检测下限相同,约为1.0×10 copies/μL;随待测样本浓度的降低(1.0×10^(4)copies/μL~1.0×10 copies/μL),液滴式数字PCR检测方法变异系数呈增大趋势(12.07%~62.96%),重复性越差;实时荧光定量PCR变异系数较小(2.96%~4.26%),且不同浓度之间的变异系数差别不大。2种方法在不同利什曼原虫中的检测灵敏度不同。结论和实时荧光定量PCR相比,液滴式数字PCR在利什曼原虫检测中的灵敏度和重复性没有表现出显著的优势,后续还需更多的研究从分子靶标的选择、灵敏度、精密度及特异度等方面进行讨论。

液滴式数字PCR检测晚期非小细胞肺癌血液EGFR突变的应用价值

目的 采用液滴式数字PCR(ddPCR)法检测晚期非小细胞肺癌(NSCLC)患者外周血循环肿瘤DNA(ctDNA) EGFR 基因突变的情况,探讨试剂盒的性能、检测结果的可靠性和准确性以及ddPCR法在外周血ctDNA中的应用价值。方法 使用标准突变比例的模拟cfDNA样本ddPCR法对试剂检测限、准确性、特异性、精密度、抗干扰能力等指标进行分析及评价;使用ddPCR法检测262例NSCLC患者外周血ctDNA,随机选取30例样本同时进行Super-ARMS法检测,并从方法学标准化和检测结果准确性两方面进行统计学分析。结果 检测试剂在检测限以上的准确性、特异性均为100%,定量精密度(突变比例对数的绝对值变异系数 CV )<5%,关键环节质量控制各主要参数的相关性和线性关系均符合要求;Super-ARMS和ddPCR法同步检测30例NSCLC患者外周血ctDNA的结果具有较好的一致性( Kappa =0.783, P =0.000)。结论 ddPCR法灵敏度高,可绝对定量,是血液检测的有效的方法,但其在检测过程中存在较多对检测结果产生影响的环节,故而检测方法标准化至关重要。

牛结节性皮肤病病毒(NMG株)基因组DNA标准物质的研制

为提高牛结节性皮肤病病毒(LSDV)核酸检测结果的准确性,本研究通过病毒核酸提取及质量检测、分装,制备LSDV NMG株基因组DNA标准物质。通过荧光定量PCR(qPCR)检测外源病毒评价其纯净性;采用液滴式数字PCR(ddPCR)方法检测LSDV ORF101基因的拷贝数以评估该标准物质的均匀性、稳定性并与9家实验室协作标定;进一步采用qPCR方法对该标准物质试用。结果显示,本研究制备的标准物质不存在外源病毒污染;组内和组间无显著性差异,均匀性好;标准物质于-20℃稳定保存6个月,4℃稳定保存7d,25℃稳定保存24 h;标准物质ORF101基因最终定值为(8.6±1.3)×10~3拷贝/μL;可以用于qPCR检测。综上,该标准物质定值准确,均匀性好,不仅可以用于LSDV核酸检测相关实验的质量控制、仪器校准、检测方法评价,还可为研制体外诊断试剂提供物质基础。