液相原位反转录PCR:一种研究基因原位表达的有效方法

介绍了液相原位反转录PCR(in wellinsituRT PCR)的操作程序、存在的问题及改良方法 ,最后探讨了原位反转录PCR在研究RNA转录、加工、编辑和多聚腺苷酸化等方面的应用。

原位反转录PCR技术的应用

针对已有资料中对于以DNA为靶基因序列的原位 PCR介绍较多,而对于原位反转录PCR的介绍很少,但在实际研究工作中有很多检测的靶基因是 RNA(病毒的或基因组的 RNA)的实际情况,就原位反转录PCR技术的基本原理、影响试验结果的关键因素和步骤,如组织细胞的固定、引物和探针的选择、蛋白酶及DNA酶消化、假阳性及假阴性的产生等进行了概述,旨在通过探讨上述问题,对该技术的实际应用有所指导。

原位反转录PCR检测慢性丙型肝炎患者外周血单个核细胞中HCV

目的研究慢性丙型肝炎患者外周血单个核细胞（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌｂｌｏｏｄｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒｃｅｌ，ＰＢＭＣ）中丙型肝炎病毒的定位分布及复制。方法直接原位反转录－ＰＣＲ（标记引物）对２０例慢性丙型肝炎患者的ＰＢＭＣ内丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）的分布、定位及存在形式进行研究。结果１６例患者外周血单个核细胞的胞浆内发现ＨＣＶＲＮＡ阳性信号，并有一例患者的胞浆内发现ＨＣＶＲＮＡ负链信号。结论ＨＣＶ可感染ＰＢＭＣ并在其中复制。原位ＲＴ－ＰＣＲ为进一步研究ＨＣＶ进入人体内的分布、潜伏、复制状况以及丙型肝炎治疗、药物研究奠定了基础。

5-HT受体亚型mRNAs在大鼠背根神经节和三叉神经节的表达—原位杂交组织化学法研究

应用原位杂交组织化学技术观察了大鼠背根节和三叉神经节内 5 -HT2 、5 -HT3 、5 -HT4、5 -HT5 、5 -HT6 和 5 -HT7受体亚型 m RNAs的表达。结果显示 :在背根节和三叉神经节中均观察到了 5 -HT2 A、5 -HT3 、5 -HT4和 5 -HT7受体亚型 m RNAs阳性细胞 ;两种神经节内上述受体亚型 m RNAs阳性细胞的百分比不同。 5 -HT3 受体亚型 m RNA阳性细胞的百分比最高 ,分别为 3 0 .4% (背根节 )和 3 2 .8% (三叉神经节 )。约 17.2 %和 14 .6 %的背根节和三叉神经节细胞分别呈 5 -HT2 A受体 m RNA阳性 ;而 5 -HT4和 5 -HT7受体亚型 m RNAs阳性细胞在此二节中的百分比分别为 14 .9%、2 4.7%和 11.2 %、9.8%。各受体亚型 m RNA阳性细胞均以中、小型节细胞为主。在各神经节内均未观察到 5 -HT2 B、5 -HT2 C、5 -HT5 和 5 -HT6 受体 m RNA的表达。上述结果提示 5 -HT2 A、5 -HT3 、5 -HT4和 5

直接原位聚合酶链法检测肝组织中丙型肝炎病毒RNA

液相聚合酶链反应(PCR)技术已广泛应用于临床,协助诊断常见的各型(甲、乙、丙、丁、戊、庚等)病毒性肝炎,为了探讨丙型肝炎病毒RNA(HCVRNA)在肝脏组织中的定位,探讨丙型肝炎发病机理,笔者等用直接法原位反转录—PCR法检测肝组织中HCVRNA,现报道如下:

正常和放射复合伤口血管再生中VEGF基因的表达及其意义

目的研究ＶＥＧＦ 基因在正常和放射复合伤口愈合中的表达及意义，探讨其在血管再生中的作用。方法将４ ８ 只Ｗｉｓｔａ ｒ 二级大鼠背部皮肤造成圆形伤口后，以２５Ｇｙ ６０ Ｃｏ γ射线局部照射，于伤后２ 、５ 、１０ 、１５ 、２ １ 和２８ｄ 活杀取材，采用免疫组织化学、原位杂交和原位ＰＣ Ｒ 等方法，研究ＶＥＧＦ 基因的表达及意义。结果单纯创伤组于伤后２ｄ，新生血管内皮细胞浆内ＶＥＧＦ 的表达呈强阳性；５ ｄ 时毛细血管数明显增多，其内皮细胞胞浆内ＶＥＧＦ 表达呈阳性；而于１０ｄ后，ＶＥＧＦ 的表达逐渐减少。创伤＋照射组则于伤后５ｄ，ＶＥＧＦ 的表达在血管内皮细胞胞浆内呈弱阳性，１０ ｄ 时阳性，１５ ｄ 后则呈弱阳性。原位杂交显示，ＶＥＧＦｍＲＮＡ 于单纯创伤组伤后２ ～５ ｄ 及创伤＋照射组伤后５ ～１０ｄ，血管内皮细胞浆内阳性。原位反转录ＰＣ Ｒ 则显示，ＶＥＧＦｍＲＮ Ａ 于单纯创伤组伤后２ ～１５ｄ 及创伤＋照射组伤后５ ～２８ｄ，呈阳性反应。结论内源性ＶＥＧＦ 基因的表达参与创伤愈合中血管再生过程。辐射使血管内皮细胞中ＶＥＧＦ 的表达减少。原位反转录ＰＣ Ｒ 方法较原位杂交能客观地反映内源性ＶＥＧＦ 基因的表达情况。

妊娠绵羊子宫内膜组织内源性反转录病毒及其受体HYAL2基因表达水平的检测

为了探究内源性反转录病毒(enJSRV)及其受体HYAL2在妊娠蒙古绵羊子宫内膜形成和发育过程中的作用,运用TaqMan实时荧光定量PCR和组织原位杂交技术对其在不同妊娠时期(30、50、70、90、110和130d)蒙古绵羊子宫内膜中的表达规律和分布定位进行了研究。实时荧光定量PCR结果显示,enJS-RV及其受体HYAL2在蒙古绵羊子宫内膜的不同妊娠时期均有表达,通过SPSS统计学软件分析可以看出,妊娠蒙古绵羊子宫内膜组织中enJSRV mRNA的表达于妊娠第30和50天相对较高,70～130d均低于对照组(30d),且差异都极显著,enJSRV与其受体HYAL2mRNA之间亦无线性相关性。原位杂交结果显示,enJSRV及其受体HYAL2mRNA在妊娠第30、50和130天蒙古绵羊子宫内膜的腔上皮细胞、腺上皮细胞、血管内皮细胞、间质及滋养层巨型双核细胞中均有阳性信号表达。表明enJSRV及其受体HYAL2表达于上皮细胞及上皮细胞来源的滋养层巨型双核细胞中,揭示enJSRV及其受体HYAL2在子宫形成过程中和系统防御中可能发挥重要作用。

基于受体捕获的人源诺如病毒检测方法的优化及应用

在原位捕获反转录实时定量PCR法(In situ capture real-time quantitative reverse transcription polymerase chain reaction,ISC-RT-qPCR)建立的基础上,本研究旨在优化该新型感染性HuNoVs的检测方法,并将其应用于市售贝类样品中HuNoVs的检测。本研究以2份HuNoVs临床腹泻样本3010(GI组)和3009(GII组)对ISC-RT-qPCR中猪胃粘膜提取物(porcine gastric mucin,PGM)包被浓度、待测样本孵育时间和孵育pH进行了优化;最后,对随机采集的40份市售贝类样品(文蛤、花蛤、海蛏、扇贝和鲍鱼)进行感染性HuNoVs的检测。结果表明,ISC-RT-qPCR最佳试验参数分别为:PGM包被浓度为1.0 mg/mL、待测样本孵育时间为30min、孵育pH(GI组,pH=3.0;GII组,pH=7.0);40份市售贝类样品中,贝类中HuNoVs总检出率为22.5%,多重检出率为5.0%,GI组和GII组HuNoVs的检出率分别为17.5%和10.0%;其中,市售文蛤的GI组和GII组HuNoVs检出率均为最高。因此,ISC-RT-qPCR是一种可用于市售贝类样品中感染性HuNoVs的检测方法,为食品中HuNoVs的检测与监测提供了新选择。

A组轮状病毒原位捕获RT-qPCR检测体系的建立及评估

目的建立基于原位捕获反转录实时定量PCR方法(in situ capture real time quantitative reverse transcription PCR,ISC-RT-qPCR)检测感染性A组轮状病毒(group A rotavirus,RVA)的体系,并对其进行评估。方法以自行构建的NSP3重组质粒为对象,绘制标准曲线;通过优化ISC-RT-qPCR体系中猪胃粘膜提取物(porcine gastric mucin,PGM)包被浓度、孵育时间、孵育缓冲液pH和封闭时间的参数,建立、完善RVA的ISC-RT-qPCR检测体系,并评估该体系的特异性、检测限及稳定性。结果ISC-RT-qPCR最佳试验参数分别为:PGM包被浓度为1.0 mg/mL、孵育时间为60 min、孵育pH为9.0、封闭时间为60 min;体系的检测限约为5拷贝/mL,检测特异性强、稳定性好。结论本研究所建立的ISC-RT-qPCR是一种可用于检测感染性RVA的方法,具有操作简单、绿色环保、可高通量检测等优点,适合于临床、尤其是低病毒载量的食品和环境样品中RVA的快速检测。

基于受体捕获诺如病毒检测方法的特异性及应用

目的评价新型感染性诺如病毒检测方法原位捕获反转录实时定量PCR（In situ capture realtime quantitative reversetranscription polymerase chain reaction，ISC-RT-qPCR）的特异性，并将其应用于新鲜草莓中诺如病毒的检测。方法以诺如病毒GⅡ组不同基因型和不同浓度的临床粪便标本评价ISC-RT-qPCR方法的特异性。此外，利用ISC-RT-qPCR方法对以GⅡ组诺如病毒人工污染新鲜草莓样本进行检测。结果ISC-RT-qPCR可特异性检测所有GⅡ诺如病毒8种基因型临床腹泻样本；与传统RT-qPCR相比，检测的Ct值并未随着诺如病毒滴度的降低而升高。人工污染新鲜草莓的ISC-RT-qPCR检测限为1.36基因组拷贝数。结论ISC-RT-qPCR是一种可用于临床腹泻样本和草莓中GⅡ组感染性诺如病毒的检测方法，为食品中诺如病毒的检测与监测提供了技术储备。