食品中弓形虫和旋毛虫液相基因芯片检测方法的研究

为建立一种可同时检测食品中弓形虫和旋毛虫的液相基因芯片方法,本研究以弓形虫B1基因和旋毛虫18S rDNA基因为靶序列,设计并合成特异性探针和引物,通过PCR方法扩增目的片段并测序,建立一种基于双重PCR的液相基因芯片检测方法。结果显示:在约180bp和90bp处分别扩增出目的条带;测序结果与GenBank登录的弓形虫和旋毛虫的相关基因一致性分别为99.47%和100%;液相基因芯片对单重PCR产物和双重PCR产物的检测结果一致,特异性和重复性良好。应用该方法检测弓形虫和旋毛虫变异系数(CV%)均在7%以内;灵敏度分别为65.6ng/mL和39.06ng/mL,比琼脂糖凝胶电泳灵敏高约8倍;模拟污染试验准确率达98%以上。本研究建立的液相基因芯片检测食品中弓形虫和旋毛虫的方法具有高效、灵敏和特异等优点,为食源性寄生虫的检测和监控提供了新方法。

Ⅰ群禽腺病毒液相基因芯片检测方法的建立

为了建立一种快速、特异、灵敏的检测I群禽腺病毒的液相基因芯片方法。根据Hexon基因序列设计特异引物,上游引物5'端加TAG序列,下游引物5'端加生物素,进行PCR扩增,将扩增产物与链霉素亲和蛋白、磁珠37℃孵育30 min,通过Luminex200仪器分析。用所建立的液相基因芯片方法进行特异性、灵敏度、重复性及病料样品的检测。结果该方法的特异性强;检测的敏感性可达1×102copies/μL;批内批间的变异系数都在5%以下;检测结果与SYBR Green I荧光PCR方法 100%相符。表明建立的液相基因芯片方法特异性好、灵敏高、重复性好,可用于I群禽腺病毒的检测。

猪囊尾蚴和华支睾吸虫液相基因芯片检测方法的建立

为建立一种可以同时检测猪囊尾蚴和华支睾吸虫的液相基因芯片方法,本研究以猪囊尾蚴ITS基因和华支睾吸虫ITS基因为靶序列,设计并合成特异性探针和引物,通过PCR方法扩增目的片段,构建阳性重组质粒标准品并对其进行测序,建立一种基于双重PCR的液相基因芯片检测方法。结果显示,扩增目的片段长度分别约为150 bp和170 bp,测序结果与Gen Bank登录的猪囊尾蚴和华支睾吸虫相关基因一致性分别为99.35%和98.27%;液相基因芯片对单重PCR产物和双重PCR产物的检测结果一致,特异性和重复性良好。应用该方法检测猪囊尾蚴和华支睾吸虫的灵敏度分别为5.13×104拷贝/μL和2.03×104拷贝/μL,比琼脂糖凝胶电泳灵敏高约8倍;应用该方法检测猪囊尾蚴和华支睾吸虫的变异系数均在8%以内,模拟污染样品的检验试验准确率达98%。本研究初步建立了可以同时高效、灵敏和特异检测猪囊尾蚴和华支睾吸虫的液相基因芯片方法,为人畜共患寄生虫的检测和监控提供了新方法。

液相基因芯片技术在崇明地区人乳头瘤病毒检测和分型中的应用

目的探究液相基因芯片技术在崇明地区人乳头瘤病毒（HPV）检测和分型中的应用。方法选取2011年5月至2013年4月该院妇科门诊就诊者宫颈脱落细胞500例,使用液相基因芯片技术对其进行HPV基因型检测。并对80例患者进行病理诊断,根据组织病理学将80例患者分为炎性反应组、细胞学正常组、宫颈癌组、宫颈上皮内瘤变（CIN）Ⅰ组、CINⅡ组、CINⅠ～Ⅱ组、CINⅢ组。将病理诊断结果和HPV DNA亚型分布结果结合分析,对崇明地区宫颈病变程度和HPV感染基因型的关系进行分析。结果 500例标本中共180例HPV阳性患者,HPV总感染率为36%,共检出22种基因型,按照感染率从高到低依次为HPV-16、HPV-52、HPV-58、HPV-18、HPV-11、HPV-6、HPV-31。其中高危型感染为85.96%,低危型感染为14.04%。500例标本中共180例HPV阳性患者,其中44例（24.44%）患者年龄为21～25岁的女性,11例（6.15%）患者年龄为51～67岁的女性,随着年龄的增大HPV阳性例数减少。随着宫颈病变级别的升高HPV感染率逐渐升高,两两比较结果显示,炎性反应组与正常组、CINⅢ组与CINⅡ组、宫颈癌组与CINⅡ组、宫颈癌组与CINⅢ组之间差异无统计学意义（P〉0.05）;其余11对两两对比差异具有统计学意义（P〈0.05）。随着宫颈病变级别的升高HPV多重感染率逐渐升高,但是仅炎性反应组与CINⅢ、CINⅡ组间差异有统计学意义（P〈0.05）。将组织病理学作为确诊标准,液相芯片HPV DNA检测CINⅢ、CINⅡ的特异度为76.63%,灵敏度为88.57%,阴性预测值为92.16%,阳性预测值为68.89%。结论崇明地区常见的HPV感染基因型为HPV-16、HPV-52、HPV-58、HPV-18、HPV-11、HPV-6、HPV-31。HPV阳性多发于年轻女性,且HPV多重感染和感染率均随着宫颈病变的程度加重而加重。因而液相芯片HPV DNA检查对大规模筛查和宫颈病变的临床诊断有十分重要的价值。

牛白细胞黏附缺陷病液相基因芯片检测方法的建立

从福建某奶牛场200头进口荷斯坦牛采血提取牛血液DNA,根据已知牛染色体上CD18编码基因序列383位碱基由A变为G而引起牛白细胞黏附缺陷症(BLAD)设计特异性野生型和突变型引物,建立液相基因芯片检测方法用于牛白细胞黏附缺陷症(BLAD)的检测,结果检出2头母牛为BLAD携带者,检出率为0.67%,没有发现患病牛。结果证明建立的液相基因芯片检测方法是一种敏感性和特异性很高的筛选奶牛BLAD有害基因的新方法。

一种基于液相基因芯片技术对甲型和乙型流感病毒分型检测方法的建立

目的建立能够对甲型流感病毒(influenza virus A,INFA)和乙型流感病毒(influenza virus B,INFB)进行区分的液相基因芯片技术,为甲型和乙型流感病毒的分型提供一种高通量、高灵敏度的检测和鉴定方法。方法从NCBI的Gen Bank下载具有代表性的流感病毒基因组序列,利用生物信息学软件Bio Edit进行序列比对,分别设计针对INFA和INFB的简并引物和特异性探针,将设计好的引物和探针与Gen Bank中所有的基因序列进行比对,以验证其特异性。经探针合成、悬浮液相芯片制备和检测条件的优化获得用于甲型和乙型流感病毒分型的液相基因芯片。结果所检测INFA和INFB均可获得特异性杂交信号,非特异性杂交信号不明显,将2种病毒混合,模拟混合病毒感染也可以得到相应的特异性杂交信号。灵敏度评估结果表明INFA的检测灵敏度为1~10空斑形成单位(plaque forming unit,pfu),而INFB为10~100 pfu。将本方法用于检测11份临床样本,其结果与荧光定量分型逆转录聚合酶链反应(reverse transcriptase-polymerase chain reaction,RT-PCR)检测方法的结果一致。结论本研究初步建立了INFA和INFB的液相基因芯片检测技术,可用于流感病毒的初步筛查和鉴定,并且可以进行混合感染样本的检测,为流感病毒的分型和鉴定提供了一种新的手段。

液相基因芯片法同时检测3种食源性病原菌

目的:建立一种能同时检测3种食源性病原菌的液相基因芯片方法。方法:针对金黄色葡萄球菌23SrDNA、志贺氏菌iapH、单核增生李斯特氏菌iap基因分别设计引物和探针,通过多重聚合酶链式反应扩增获得大小为246、112bp和174bp的目的片段;将探针偶联到编码微球上,制成基因芯片,与目的片段进行杂交,建立3种食源性病原菌的液相基因芯片方法;并评价该方法的特异性、灵敏度。结果:建立的液相基因芯片检测方法特异性好、灵敏度高。对金黄色葡萄球菌、单核增生李斯特氏菌、志贺氏菌的检测灵敏度分别为38、44、21CFU/mL。结论:成功建立了3种致病菌的液相基因芯片检测方法。

建立多重液相基因芯片方法快速检测狐狸、水貂成分

基于xMAP液相芯片新型生物技术平台,分别以狐狸线粒体DNA D-loop区序列、水貂线粒体DNA细胞色素b基因序列为模板设计特异扩增引物和探针,并对探针进行锁核酸修饰,建立了二重xMAP液相基因芯片方法,用于快速检测狐狸和水貂源性成分。该法能准确鉴定鉴别狐狸和水貂DNA,对其他18种动物物种DNA均呈检测阴性,对狐狸、水貂DNA的检测低限分别为2.8pg/μl、0.9pg/μl,对肉类混样检出限为0.05%(m/m)。对目标源性DNA含量为1%(V/V)的32份饲料与食品核酸添加样本均呈对应目标检测阳性。结果表明,该方法特异性强、灵敏度高,适用于食品与饲料领域相关原料和产品的质量与安全检验。

液相芯片快速检测结核耐药基因方法建立

基于Luminex100^(TM)技术平台,结合多重PCR技术,以5'生物素标记引物为信号指示,在H_937)RV结核标准株做对照下,对104株结核分枝杆菌分离株的LFP耐药rpoB基因和INH耐药的katG,inhA基因进行检测,并与药敏试验绝对浓度法和测序结果比较.结果表明:液相芯片检出结果与药敏法比较,104株分离株中LFP、INH、多重耐药的检出结果分别为:液态芯片检测73株、50株、48株;药敏检测结果为74株、58株、53株;对比检出率98.6%,86.2%,90.6%.液相基因芯片技术对耐药,耐多药结核的检测,具有特异性高,敏感性强的特点,是检测结核分枝杆菌耐药基因的有效方法,可用于临床检测.