应用液相色谱联合质谱技术对血小板输注不相容干扰因子的实验研究

目的探讨血小板输注无效其非免疫因素和免疫因素间的差异；方法应用液相色谱联合质谱技术比较受、供血血样间的血小板输注无效的差异显著性；结果血小板输注后有效组与无效组比较差异：X^2=18．02 P〈0．01二组间差异显著，在332例次血小板输注过程中由血小板抗体导致输注无效的仅占17．1％；结论过去过高评价了免疫因素导致的RPT，而忽略了非免疫因素是引起的PLT输注无效性的主要原因。液相色谱联合质谱技术可弥补目前检测方法的不足，不仅对免疫因素产生的输注效果可做出判断，对非免疫因素产生的不相容干扰也可做出判断，弥补了目前检测方法的缺陷。

运用液相色谱联合离子阱-飞行时间质谱法进行海洛因成瘾人员代谢组学研究

利用代谢组学的研究方法,对海洛因成瘾人员尿液及血清中可能的相关标志物进行筛选。运用液相色谱联合离子阱-飞行时间质谱(LC/MS-IT-TOF)联用技术对海洛因检测尿检条阴性的16名海洛因滥用成瘾者与16名正常人的血清和尿液进行研究。多变量统计分析结果表明,海洛因成瘾者和正常人聚类明显,血清和尿液中分别发现12种可能的潜在标志物。成瘾人员和正常人员在血清及尿液代谢水平上具有明显差异,差异代谢物的发现有助于为发现海洛因成瘾判定的潜在标志物提供依据。

黄芩甲醇提取物中抗氧化活性成分的液相色谱-质谱联合检测

目的:探讨黄芩甲醛提取物中主要的抗氧化成分。方法把黄芩甲醇提取物与二苯基二苯基三硝基苯肼(DPPH)自由基相互反应,随之采用高效液相色谱-质谱联合检测提取物中的抗氧化成分,从而确定黄芩甲醇提取物中包含的抗氧化成分。结果黄芩甲醛对DPPH自由基有较强的清除作用,高效液相色谱分析结果可知,黄芩甲醛提取物中包含汉黄芩苷、千层纸素A、黄芩苷、千层纸素A-7-O-B-D葡萄糖醛酸苷4种较强的抗氧化活性成分。结论使用高效液相色谱-质谱联合检测法能快速筛选黄芩甲醛提取物中的抗氧化成分,这种检测方法快速、方便,从而检测黄芩甲醛提取物抗氧化成分为千层纸素、葡萄糖醛酸苷、汉黄芩苷、黄芩苷。

基于液相色谱联合离子阱-飞行时间质谱技术的海洛因滥用成瘾大鼠血清代谢组学研究

建立海洛因成瘾动物模型,研究海洛因成瘾大鼠血清代谢物变化,寻找其潜在的标志物。实验动物设成瘾组和空白对照组,运用液相色谱联合离子阱-飞行时间质谱(LC/MS-IT-TOF)分析方法研究海洛因成瘾对大鼠血清代谢变化的影响。分别采用主成分分析(PCA)、偏最小二乘法-判别分析(PLS-DA)分析成瘾组和正常对照组之间的代谢差异。结果表明成瘾组和对照组大鼠在血清代谢水平上具有明显差异,经统计学分析初步筛选出26个潜在的生物标记物的质荷比。海洛因成瘾代谢组学研究具有一定的可行性,代谢组学在判定海洛因成瘾与否方面具有一定的潜在价值。

LC-MS/MS技术检测新生儿干血斑甲基丙二酸、同型半胱氨酸cut-off值的建立

目的探讨建立高效液相色谱质谱-串联质谱联合检测(liquid chromatography-tandem mass spectrometry,LC-MS/MS)技术检测新生儿干血斑甲基丙二酸(methylmalonic acid,MMA)和同型半胱氨酸(homocysteine,Hcy)cut-off值的方法。方法收集本院分娩的新生儿MS/MS筛查中C3、C3/C2和C3/C0任一指标偏高的正常干血斑样本作为阴性样本,同时收集通过尿气相色谱质谱结合循环酶法确诊为甲基丙二酸血症合并同型半胱氨酸血症患儿的初筛干血斑样本作为阳性样本,采用LC-MS/MS技术分别检测该两类样本中MMA和Hcy的浓度。应用百分位数法并结合ROC曲线分析确定使用LC-MS/MS技术检测MMA和Hcy的cut-off值。结果共收集1 015例阴性样本和16例MMA患儿阳性样本,LC-MS/MS技术检测阳性样本的MMA和Hcy浓度均明显高于阴性样本,差异具有统计学意义(UMMA=8.5,UHcy=23.5,P均<0.05);MMA和Hcy的ROC曲线下面积(AUCROC)均为0.999,cut-off值分别为3.145μmol/L和7.295μmol/L,诊断特异性分别为99.5%和99.3%。结论百分位数法结合ROC曲线法可用于确定本地区MMA患儿干血斑中MMA和Hcy的cut-off值,且本地区人群的MMA和Hcy cut-off值明显低于梅奥诊所提供的cut-off值。

基于血清代谢组学研究金水缓纤方治疗肺纤维化机制

目的:采用代谢组学技术探讨金水缓纤方治疗肺纤维化(PF)大鼠的机制。方法:将32只SD大鼠分为对照组、模型组、金水缓纤方组和吡非尼酮组,每组8只。建立PF大鼠模型,金水缓纤方组和吡非尼酮组于造模后第29—41天分别采用相应药物进行治疗。Masson染色观察大鼠肺组织病理变化,免疫组化法测定肺组织中Ⅰ型胶原(Col-Ⅰ)、Ⅲ型胶原(Col-Ⅲ)的表达。基于超高效液相色谱联合四级杆-静电场轨道阱高分辨质谱(UPLC Q-Exactive MS)系统,对大鼠血清进行非靶向代谢组学分析,筛选差异代谢物,探讨PF大鼠代谢网络的变化及金水缓纤方的调控作用。结果:模型组大鼠肺组织纤维化评分和Col-Ⅰ、Col-Ⅲ表达较对照组显著升高(P<0.01),金水缓纤方组纤维化评分和Col-Ⅰ、Col-Ⅲ表达均较模型组显著降低(P<0.01,P<0.05)。模型组有8种代谢物较对照组发生显著变化(FDR<0.2),其中二十碳五烯酸、18-羟基二十碳五烯酸、溶血磷脂酰胆碱18∶1和溶血磷脂酰胆碱20∶3显著下调(P<0.01,P<0.05),1-磷酸鞘氨醇和哌啶羧酸显著上调(P<0.01);金水缓纤方组有5种代谢物(溶血磷脂酰胆碱18∶1、1-磷酸鞘氨醇和十五烷酸除外)较模型组有回调趋势,其中二十碳五烯酸和溶血磷脂酰胆碱20∶3差异有统计学意义(P<0.05)。结论:金水缓纤方对PF大鼠胶原沉积有明显改善作用,其作用机制可能与其调节脂肪酸代谢、磷脂代谢和赖氨酸代谢有关。

11β-羟基类固醇脱氢酶2型活性对库欣综合征患者血钾水平的影响

目的通过分析不同类型库欣综合征患者尿液中游离皮质醇（UFF）与游离皮质酮（UFE）的比值，反映体内11β羟基类固醇脱氢酶（11β-HSD2）的功能水平，进一步揭示促肾上腺皮质激素（ACTH）非依赖性库欣综合征患者低血钾的发病机制。方法运用液相色谱联合串联质谱分析（LC．MS／MS）方法，对北京协和医院2013年10至12月收治的异位ACTH综合征患者（n=6）、血钾正常肾上腺库欣腺瘤患者（n=6）、低血钾肾上腺库欣腺瘤患者（n=5），以及对照的健康人（n=6）的24h尿液中游离皮质醇（UFF）和皮质酮（UFE）的含量进行测算；对4组研究对象的UFF＋UFE总量以及UFF／UFE比值进行组间比较分析。结果通过LC—MS／MS对4组研究对象UFF以及UFE定量分析得出：异位ACTH综合征患者组UFF＋UFE为（2787±820）μg／L，UFF／UFE为2．98±0．35；血钾正常肾上腺库欣腺瘤患者组UFF＋UFE为（689±163）μ/L，UFF／UFE为1．03．±0．42；低血钾肾上腺库欣腺瘤患者UFF＋UFE为（697±120）μg／L，UFF／UFE为2．24±0．37；健康对照组UFF＋UFE为（70±27）μg／L，UFF／UFE为0．42±0．20；血钾正常肾上腺库欣腺瘤患者和低血钾肾上腺库欣腺瘤患者的UFF＋UFE差异无统计学意义，但低血钾肾上腺库欣腺瘤患者UFF／UFE比值显著高于血钾正常肾上腺库欣腺瘤患者（P〈0．001），提示低血钾。肾上腺库欣腺瘤患者存在11β．14SD2酶功能缺陷。结论部分ACTH非依赖性库欣综合征患者由于自身体内11β—HSD2酶功能缺陷，无法有效地将有活性的皮质醇转化为无活性的皮质酮出现典型低血钾等盐皮质激素过多表现。

兔出血症病毒肝脏表面蛋白受体的初步筛选

为了筛选鉴定兔出血症病毒（RHDV）感染的肝脏细胞表面受体，取成年兔肝脏组织以胰酶消化，经300目铜网过滤，得到完整的兔肝脏细胞。用生物素对细胞表面蛋白进行标记和分离；采用病毒铺覆蛋白技术分析兔肝脏细胞表面蛋白。结果表明，在130000-170000的位置上存在与RHDV相互作用的特异性蛋白条带；利用液相色谱联合质谱技术（LCMS／MS）对特异蛋白条带进行shotgun分析，鉴定得到38个候选蛋白，其中3种蛋白在已知病毒感染过程中具有重要作用。

HPLC-MS/MS法测定人血浆中儿茶酚胺浓度的方法学建立

目的:建立LC/MS/MS法测定人血浆中儿茶酚胺(肾上腺素、去甲肾上腺素、多巴胺)的含量。方法:选用PFP column(150 mm×2.1 mm,3μm),流动相A:甲醇(0.01%甲酸):B水(0.01%甲酸),流速:0.3 m L·min-1,柱温:40℃,进样量:20μL,正离子方式检测,多反应监测(MRM)扫描,以异丙肾上腺素为内标,采用弱阳离子固相萃取(WCX-SPE)血浆中儿茶酚胺后进行LC/MS/MS法分析。结果:去甲肾上腺素(NE)在100~2 000 pg·m L-1(n=6,r=0.994 2)、肾上腺素(E)在100~2 000 pg·m L-1(n=6,r=0.992 2)、多巴胺(DA)在100~2 000 pg·m L-1(n=6,r=0.996 2)浓度范围内线性关系良好,最低检测限均为100 pg·m L-1(S/N≥10),批内、批间准确度、精密度、精密度RSD均<15%,儿茶酚胺样品4℃放置12 h,以及预处理后16 h均稳定。结论:该方法灵敏度高、选择性高、操作简便、结果准确可靠,能满足检测血浆中儿茶酚胺的浓度,适合于临床诊疗需要。

甲基苯丙胺滥用人员尿液代谢组学初探

目的:应用代谢组学的研究方法,对已经证实的甲基苯丙胺(MA)滥用人员尿液进行分析,筛选潜在的相关生物标志物。方法:运用高效液相色谱联合离子阱-飞行时间质谱(LC/MS-IT-TOF)对20名甲基苯丙胺滥用者与20名正常人的尿液进行检测。结果:多变量统计分析结果表明,甲基苯丙胺滥用者和正常人聚类明显,在尿液中共发现20种可能的生物标志物。结论:甲基苯丙胺滥用人员和正常人员在尿液代谢水平上具有明显差异,这为发现甲基苯丙胺滥用判定的潜在标志物提供了依据。

基于多肽组学的美洲大蠊肽类组分分析及促创面修复活性多肽筛选

目的鉴定美洲大蠊Periplaneta americanna中丰富的多肽类成分,寻找具有促创面修复活性多肽。方法通过超滤技术从美洲大蠊中初步提取多肽成分,使用超高效液相色谱-高分辨质谱联合技术快速纯化鉴定多肽的氨基酸序列,使用Peptide Ranker在线工具对鉴定多肽进行活性预测,应用Autodock4.2分子对接软件初步预测鉴定多肽与创面修复相关靶蛋白结合作用强弱,最后通过体外实验验证筛选肽段的活性。结果共鉴定出属于34个前体蛋白的449个多肽序列,选择相对丰度和评分较高的5条多肽,氨基酸序列分别为AGFA GDDAPR、DFIR、PGPIN、IGF、TLF,分子对接结果分析发现DFIR、PGPIN、IGF、TLF与胞外信号调节激酶/丝裂原活化蛋白激酶、细胞内非受体酪氨酸激酶/信号转导与转录激活子、磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B/一氧化氮合酶等相关信号通路上的胞外信号调节激酶2、丝裂原活化蛋白激酶、酪氨酸激酶、一氧化氮合酶等8个靶蛋白能够有效对接,体外实验结果表明在0.1~10μmol/L浓度下,合成的DFIR、PGPIN、IGF、TLF对人脐静脉内皮HUVEC细胞和小鼠成纤维L929细胞2种细胞模型的增殖和迁移有不同程度的促进作用,说明DFIR、IGF、PGPIN及TLF具有潜在的促创面修复活性。结论超高效液相色谱-高分辨质谱联合技术为美洲大蠊多肽类成分的分析鉴定提供有力的支持,多肽的分析鉴定同时为美洲大蠊促创面修复活性成分的探索提供了新的思路。