淀粉合酶的酶学与分子生物学研究进展

淀粉合酶作为淀粉合成的关键酶之一 ,一直是淀粉研究的重要内容。这些研究多集中在对其同工型的研究 ,淀粉合酶的两类主要同工型分别为淀粉粒结合的淀粉合酶和可溶性淀粉合酶 ,这两类同工型的作用极为复杂。本文介绍了淀粉合酶同工型的酶学和分子生物学近年来的研究进展 ,同时也讨论了这些同工型的分类、相互关系及其在淀粉合成过程中的生理功能等内容。

禾谷类作物淀粉合酶

淀粉合酶是禾谷类作物淀粉合成所必需的一类酶。根据淀粉合酶家族成员的氨基酸序列的相似性,分别介绍了一个颗粒性淀粉合酶亚家族和四个可溶淀粉合酶亚家族的组成、基因结构和表达特点,并从转录、转录后和翻译后水平上对这些基因的表达调控做了概述。

马铃薯块茎颗粒结合型淀粉合酶基因的克隆及其RNAi载体的构建

GBSSI是马铃薯块茎中控制直链淀粉合成的关键酶,为培育高支链淀粉含量或纯支链淀粉含量的转基因马铃薯材料,根据GenBank登录号X58453的序列设计特异引物,采用RT-PCR技术获得马铃薯块茎GBSSI相似基因,并利用生物信息学相关软件分析,预测GBSSI相似基因cDNA序列编码的蛋白质结构和功能。结果表明,克隆的GBSSI相似基因与报道的GBSSI基因序列相似性达到99.78%,其开放阅读框长1824bp,编码607个氨基酸,具有许多重要功能位点。三级结构预测结果表明,该蛋白具有淀粉合成功能,基因序列已注册到GenBank,序列登录号为EU403426。以此基因CDS内542bp的靶标序列作为干扰区段,扩增GBSSI的正反向基因片段,并引入237bp的内含子序列,构建由Patatin启动子驱动的具有"正义基因片段gbssA-内含子VP1-ABI3-like protein-反义基因片段gbssB"的植物干扰表达载体pBI121g-PgABI。本研究结果将为淀粉合成的进一步研究和高支链淀粉含量或纯支链淀粉含量的马铃薯品种的培育奠定基础。

小麦淀粉合酶基因Ⅲ片段的克隆及反义和RNA干扰载体的构建

采用RT-PCR方法从小麦品种豫教2号的发育籽粒中克隆出淀粉合酶III基因(starchsynthase III,SSIII)部分cDNA片段(509bp)(GenBank No.EF466009),同源性比较结果显示,它与GenBank上已报道的SSIII基因有高度同源性。以pWM101质粒为基础,构建了由35S启动子调控的SSIII基因的反义表达载体pWM101SSIIIA;另外,还以pFGC5941质粒为基础,构建了SSIII基因的RNAi干扰载体pFGC5941SSIIIsa,这些载体的构建为研究此基因的功能打下了很好的基础。

利用等位基因特异性PCR检测水稻可溶性淀粉合酶基因的单核苷酸多态性

单核苷酸多态性(SNP)广泛分布于水稻基因组中,SNP分型已成为水稻遗传作图、关联分析、资源鉴定和分子标记辅助选择等研究的重要技术。本文选择水稻可溶性淀粉合酶基因SSIIIa的12个SNP位点,研究了利用等位基因特异性PCR法检测SNP的可行性。按照等位基因特异性PCR原理设计引物3'末端碱基,并根据每个SNP位点引物3'端的错配类型,在上游引物3'末端第3位引入不同的错配碱基,结果均获得了很好的扩增特异性,PCR检测结果与测序结果吻合。表明,等位基因特异性PCR是一种简便、快捷、可靠和低成本的SNP分型方法,可有效应用于水稻可溶性淀粉合酶基因的种质资源鉴定和分子标记辅助选择育种等相关研究。

小麦淀粉合酶基因I的克隆及反义和RNAi载体的构建

采用RT-PCR方法从小麦品种豫教2号发育的籽粒中克隆出淀粉合酶I基因(starch synthase I,SSI)部分cDNA片段(795 bp)(GenBank No.EF221762),同源性比较结果显示,它与GenBank上已报道的SSI基因有高度同源性。以p WM101质粒为基础,构建了由35S启动子调控的SS I基因的反义表达载体p WM101SSI;另外,还以pFGC5941质粒为基础,构建了SSI基因的RNAi载体pFGC5941SSIsa,这些载体的构建为研究此基因的功能奠定了基础。

小麦淀粉合酶基因Ⅱ克隆及反义和RNAi载体构建

采用RT-PCR方法从小麦品种豫教2号的籽粒中克隆出淀粉合酶Ⅱ基因(Starch synthaseⅡ,SSⅡ)部分cDNA片段(600bp)(GenBank No.EF221761),同源性比较结果显示,它与GenBank上已报道的SSⅡ基因有高度同源性。以pCMBIA1301质粒为基础,构建了由35S启动子调控的SSⅡ基因的反义表达载体pCMBIA1301SSIIA;另外,还以pFGC5941质粒为基础,构建了SSⅡ基因的RNAi载体pFGC5941SSIIsa,这些载体的构建为研究此基因的功能奠定了基础。

木薯淀粉合酶SSⅠ结构与功能的分析及预测

木薯(Manihot esculenta Crantz)是重要的工业淀粉原料和生物质能源作物,贮藏根富含淀粉。淀粉合酶是淀粉合成的关键酶,在淀粉合成中起着重要作用。采用生物信息学方法,以木薯淀粉合酶I为研究对象,对其氨基酸序列、甲基化、导肽、跨膜拓朴结构、疏水性亲水性、磷酸化位点、亚细胞定位、蛋白质二级结构与功能域进行分析和预测。结果表明,淀粉合酶SS在不同植物中的氨基酸序列差异性较大,但仍然具有一定的保守性氨基酸残基,其氨基酸序列的功能结构域是一致的,表明淀粉合酶在植物中具有一定的保守性,与其在植物中的重要作用密切相关,为木薯淀粉合酶深入研究提供生物信息学的参考数据。

萌发后食松幼苗淀粉粒结合与可溶性淀粉合酶的研究(英文)

裸子植物食松 (PinusedulisEngelm .)幼苗在萌发后具有淀粉积累的独特特征 ,而淀粉合酶在裸子植物中尚未有研究。这项研究对在室温下暗中萌发的食松幼苗的淀粉合酶进行了提取和研究 ,结果显示 :5 8kD和 91kD的淀粉粒结合蛋白均为豌豆淀粉合酶Ⅱ抗体所识别。5 8kD淀粉粒结合蛋白被纯化出来 ,其N端序列与其他几种被子植物淀粉粒结合的淀粉合酶Ⅰ的N端序列有很高的相似性 ,并与豌豆、大麦、马铃薯淀粉粒结合淀粉合酶Ⅰ有免疫相似性 ,被鉴定为淀粉粒结合的淀粉合酶Ⅰ。从DEAE_Sepharose柱上洗脱出来的可溶性淀粉合酶表现出两个淀粉合酶活性峰 ,表明至少有两类可溶性淀粉合酶同工酶。对可溶性淀粉合酶的前体亲和特性进行了研究。以兔肝糖原为前体时 ,可溶性淀粉合酶的亲和性最高。裸子植物淀粉合酶的酶学特性表现与已研究的被子植物相似。

萌发中食松幼苗淀粉合酶同工酶与淀粉成分的关系

利用14C－ADPG标定法测定可溶性及与淀粉粒结合的淀粉合酶活性，采用过氯酸抽提、DMSO玻璃纤维纸层析、硫酸水解法定量测定各类淀粉成分，探讨了食松（PinusedulisEngelm）幼苗生长过程中淀粉合酶与淀粉成分间的关系。结果表明，在胚根出现以后，淀粉含量迅速增加，伴随着淀粉颗粒数目和质量的增加，两类淀粉合酶活性的增加以及淀粉合酶免疫印迹图谱的变化。支链淀粉是食松淀粉的主要成分，占总淀粉的84％。可溶性淀粉合酶峰值比淀粉粒结合的淀粉合酶活性峰值高1．3倍，与支链淀粉和直链淀粉的比例相对应。结果支持食松可溶性淀粉合酶是负责支链淀粉合成的主要酶的假说，同时表明淀粉粒结合的淀粉合酶在支链淀粉的合成中也有作用。

小麦淀粉合酶基因家族成员的表达差异分析

籽粒淀粉的含量和结构影响小麦的产量和品质,而淀粉合酶在淀粉合成中起着关键作用。植物淀粉合酶基因经多次复制和功能分化,形成了具有不同功能特性的多成员大家族。为揭示淀粉合酶基因家族成员间的序列特性和表达差异,本研究参考已知的水稻淀粉合酶蛋白序列,对小麦全基因组中的淀粉合酶基因进行鉴定,并对其进行差异表达分析。结果共鉴定到27个小麦淀粉合酶基因,这些基因分布在1A/1B/1D、2A/2B/2D、6A/6B/6D、7A/7B/7D染色体上,可分为Group A和Group B两大类,Group A包含TaGBSS、TaSSⅠ、TaSSⅡ三个亚家族,所编码的蛋白均具有motif1~motif10,且motif排列顺序一致;Group B包含TaSSⅢ、TaSSⅣ两个亚家族,所编码的蛋白都缺少motif9和motif10,另外TaSSⅢ亚家族还缺少motif8。与玉米、水稻、高粱、拟南芥不同,小麦淀粉合酶基因没有TaSSⅤ亚家族。同一亚家族内不同基因具有明显的表达差异,其中,TaGBSSⅠ、TaSSⅡa和TaSSⅢa在胚乳中特异表达;小麦相同部分同源群内的淀粉合酶基因间在不同组织和不同发育时期也存在表达差异,TaSSⅡa-B和TaSSⅡa-D在授粉后20 d和30 d的胚乳中表达量比TaSSⅡa-A高。差异表达的淀粉合酶基因启动子中的胚乳特异表达元件(RY-element、AACA-motif和ACGTOSGLUB1)存在类型和数量差异。

冬小麦籽粒淀粉合成相关酶活性的日变化

蔗糖向淀粉的转化是决定小麦籽粒产量的重要因素。田间条件下研究了两个小麦(Triticum aestivum L.)品种“鲁麦22”和“鲁麦14”籽粒淀粉合成相关酶：蔗糖合酶(sucrose synthase，SS)、腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(ADP-glucose pyrophosphorylase，ADPGPPase)、可溶性淀粉合酶(soluble starch synthase，SSS)、束缚态淀粉合酶(starch granule-bound synthase，GBSS)的活性以及籽粒ATP含量的日变化。结果表明，上述酶活性呈现明显的昼夜变化特征，酶活性一般在白天较低，而在夜间呈现较高活性，而籽粒ATP含量趋势相反。相关分析表明，白天较低的酶活性可能与气温超过其适宜温度有关。对籽粒淀粉合成相关酶活性日变化的可能因子进行了讨论。

水稻糯性突变体r162的鉴定与基因定位

直链淀粉是影响稻米食味品质和外观品质的重要因素,主要由Waxy(Wx)基因编码的颗粒结合淀粉合酶Ⅰ(granule-bound starch synthaseⅠ, GBSSⅠ)介导合成。本研究从宁粳2号的甲基磺酸乙酯(ethyl methanesulfonate,EMS)诱变材料中筛选到了一个糯性突变体r162,与野生型相比,其籽粒外观呈不透明的云雾状,种子和糙米的粒长、粒宽以及千粒重显著下降。通过扫描电镜对淀粉形态进行观察,发现突变体的淀粉颗粒上存在孔洞。半薄切片碘染结果表明,突变体r162发育时期胚乳的造粉体排列结构与野生型相似,但碘染后颜色更浅。理化性质分析发现,突变体r162的总淀粉、总蛋白质和总脂肪含量与野生型相比无显著差异,但是表观直链淀粉含量极显著下降、胶稠度极显著增加,糊化特性发生明显改变,并且淀粉的崩解值、回生值、回复值以及米粉在尿素中的膨胀体积均小于野生型。通过基因定位和测序发现,突变基因Wx位于第6号染色体短臂上,Wx基因第7个内含子的第1个碱基(Int7-1)由鸟嘌呤(G)替换为腺嘌呤(A),造成Wx基因的编码区存在10个碱基的缺失,导致其编码的GBSSⅠ蛋白自第256位氨基酸起出现错误翻译,使蛋白质翻译提前终止,因此将该等位变异命名为Wx-r162。进一步通过蛋白质印迹法检测发现,突变体中的GBSSⅠ蛋白水平极显著下降。酶活性测定也证实,突变体r162中GBSSⅠ活性明显降低。综上所述,Wx-r162基因被视为一个新的等位变异,这种突变导致GBSSⅠ活性下降,进而造成突变体r162表观直链淀粉含量降低和籽粒表现出不透明的表型。

百合GBSS基因RNAi载体构建

为研究GBSS基因在百合鳞茎形成及发育过程中影响鳞茎淀粉合成代谢的作用机理,构建干扰GBSS基因的RNAi载体为其在转录水平沉默表达提供材料。从百合鳞片克隆GBSS基因300 bp的保守序列,通过BP与LR反应将该序列正反向连接到干扰载体pJawohl8-RNAi中,经过酶切反应鉴定所构建RNAi表达载体的正确性。实验成功构建pDONR221-GBSS入门克隆与pJawohl8-RNAi-GBSS表达载体,为在百合鳞茎淀粉合成代谢途径中研究GBSS基因功能及对鳞茎发育的影响提供了材料与思路。

水稻分蘖期叶片淀粉和蔗糖代谢途径的转录组动态分析

为了探索水稻分蘖期叶片中生育进程相关代谢途径的转录响应情况,分别在分蘖期7 d、14 d和21 d收获水稻品种‘五优稻4号’(‘WYD4’)叶片,并进行动态转录组分析。结果表明,在水稻分蘖期共有12815个差异表达基因,通过GO分析显示这些基因主要集中在细胞组分方面,KEGG分析表明淀粉与蔗糖代谢途径在整个分蘖期生育进程内有差异表达基因(DEGs)显著富集,并有6个淀粉与蔗糖代谢途径相关的差异表达基因在整个分蘖期显著差异表达。同时,预测的转录因子SSⅠ(LOC_Os06g06560)在分蘖前期差异表达倍数达到9.7倍,并与64个预测的蛋白互作。这表明淀粉与蔗糖途径关键基因在不同时间点的应答是有差异的,为水稻分蘖形成和群体构建提供了时间上的能量来源,也为水稻栽培精确调控提供了转录组学指导。

水稻胚乳中淀粉合成相关酶活性的变化对支链淀粉精细结构的影响

分析了水稻(Oryza sativa L.)籽粒发育过程淀粉生物合成途径中的关键酶——ADP-葡萄糖焦磷酸化酶、可溶性淀粉合酶、淀粉分支酶以及淀粉脱支酶活性变化,同时研究了淀粉结构形成动态.与野生型晚粳9522相比,转基因晚粳9522中直链淀粉的合成被显著抑制,而总淀粉含量和籽粒终重量没有改变.淀粉生物合成途径中关键酶活性表达时间不一致,存在明显的时段特征,这与淀粉积累动态密切相关.可溶性淀粉合酶活性表达最早,其在灌浆前期驱动淀粉合成起始;而淀粉粒结合态淀粉合酶在胚乳发育的中期活性最大.两水稻实验材料间,除淀粉脱支酶活性变化有所不同外,ADP-葡萄糖焦磷酸化酶和淀粉分支酶活性的变化没有明显差异.并且,支链淀粉的分支模式在水稻籽粒发育过程中变化较大,且与品种有关.以上结果揭示,支链淀粉的合成要先于直链淀粉,并且在控制支链淀粉各分支的形成过程中有不同的酶在起特异的作用.

利用基因编辑技术创制福香占糯稻新种质

福香占是新育成的优质、抗稻瘟病、长粒籼稻品种,具有较好的推广潜力。本研究旨在利用基因编辑技术快速创制福香占糯稻材料。通过筛选和优化靶点序列,成功地利用CRISPR/Cas9技术敲除水稻颗粒结合型淀粉合酶基因(Waxy,Wx),获得了Wx基因的缺失突变体。通过后代农艺性状和米质鉴定,结果表明敲除材料的淀粉含量从16.3%下降至1.67%~1.81%,达到了糯稻水平。此外,敲除植株在株叶态、产量和抗性方面并没有显著变化。此项研究为福香占的应用推广提供了新的途径,并丰富了抗瘟糯稻的种质资源。

壳聚糖固定β-淀粉酶-海藻糖合酶双功能融合酶产海藻糖的研究

β-淀粉酶-海藻糖合酶双功能融合酶以戊二醛为交联剂,壳聚糖为载体,采用交联-吸附法固定。通过单因素试验和正交设计方案得到最优条件:壳聚糖浓度为2.5 g/L,戊二醛浓度3 g/L,交联时间80 min,融合酶浓度为8 mg/m L,固定时间为12 h,酶活力回收率为71%。酶学特性:最适pH向碱性偏移0.5,最适温度不变,具有良好的储存稳定性和操作稳定性,其酸碱稳定性和热稳定性均优于游离态。4℃储存31 d后酶活力损失33%,循环使用6次酶活力降低27%,通过固定化海藻糖转化效率与游离态和单酶混合体系相比分别低29%、6%。

通过CRISPR/Cas9技术靶向编辑SSSⅡb基因改良稻米品质

[目的]本文旨在利用基因编辑技术,降低水稻直链淀粉含量,改善稻米食味品质特性,以培育直链淀粉含量降低的优质育种材料。[方法]利用CRISPR/Cas9基因编辑技术,下调水稻品种‘宁粳4号’淀粉合成基因(SSSⅡb)的表达,对转基因家系进行目标基因的分子鉴定和主要农艺性状、生理生化指标的测定,选出目标育种材料。[结果]对淀粉合酶基因SSSⅡb进行多靶点编辑,得到3个目标基因敲除的转基因家系,分别为SSS2-Q、SSS2-Z和SSS2-H家系。与‘宁粳4号’相比,SSS2-Q家系直链淀粉含量显著下降,支链淀粉的中等链长减少,胶稠度、热浆黏度和冷浆黏度等指标均优于‘宁粳4号’,品质指标达到预期目标;但每穗实粒数和结实率降低,粒长增加。而在SSS2-Z与SSS2-H家系中,品质指标没有实现预期目标。RT-qPCR分析发现,SSS2-Q家系中SSSⅡb基因表达下调,其他淀粉合成相关基因表达也发生变化。[结论]采用CRISPR/Cas9技术,靶向编辑‘宁粳4号’中SSSⅡb基因,降低SSS2-Q家系直链淀粉含量,品质指标得到改善,为优质食味转基因水稻新品种培育提供新种质。

基因

参见 W94:1548,2157 W941507 与拟南芥属基因 cor47有关的冷调节小麦基因的特征特性[刊,英]/Guo,W.W.…//PlantPhysiology.-1992,100(2).-915～922W941508 麦醇溶蛋白和麦谷蛋白作为普通小麦的标记基因[刊,捷]/Slip Vadav…//Genet.a slecht..-1992,28(3).-185～194[1993,(7),175]