气单胞菌属低温淀粉酶基因改造与原核表达

【目的】获取低温淀粉酶基因,分析其相关功能,为工业生产上的应用提供参考。【方法】以气单胞菌(Aeromonas)LA77为出发菌株克隆低温α-淀粉酶基因,以BL-21(DE3)为宿主菌进行克隆。分析其它已知气单胞菌属低温α-淀粉酶基因同源性,设计特异引物,PCR扩增获得C13片段,将其克隆到pMAL-2X,转化到BL-21(DE3)中,筛选蓝白斑,验证PCR及EcoRⅠ和HindⅢ的双酶切,获得高效表达生物工程菌株pMAL-2X-C13。设计定点突变引物,以pMAL-2X-C13为模板,获得低温淀粉酶基因突变株三株C19、C29、C43。【结果】表达蛋白的分子大小为114kD,突变菌株C19蛋白表达量均高于pMAL-2X-C13。【结论】低温淀粉酶基因突变株C19比原始菌株pMAL-2X-C13淀粉酶基因蛋白表达量更高。

烟草源高产淀粉酶菌株的分离鉴定、发酵条件优化及固体淀粉酶制剂的制备

该研究从分离自植烟土壤的具有产淀粉酶能力的20株细菌和17株真菌中筛选高产淀粉酶的菌株,结合形态学观察、生理生化试验和分子生物学技术对筛选菌株进行鉴定,通过单因素试验对其产酶条件优化,并通过澄清、分离纯化制备固体淀粉酶制剂,研究其稳定性。结果表明,筛选到1株高产淀粉酶的菌株MK10163,其被鉴定为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens),其最佳产酶发酵条件为发酵时间44 h,发酵温度35℃,装液量50 mL/500 mL,摇床转速200 r/min,初始pH 6.0。在此条件下,淀粉酶活力为(224.63±7.34)U/mL,较优化前提高34.21%。通过1%氯化钙和1%磷酸氢二钠澄清和2倍体积的体积分数为95%乙醇醇沉,将沉淀冷冻干燥后得到固体淀粉酶制剂,其在储存60 d时仍具有91.12%的相对酶活,表明其具有较强的稳定性。

绿豆蛋白α-淀粉酶抑制肽的制备与鉴定

采用胃-胰蛋白酶水解绿豆蛋白及其分级蛋白,以水解物α-淀粉酶活性抑制率为主要指标,结合水解度、氨基酸组成及分子质量分析其抑制效果差异及原因。结果表明,绿豆蛋白肽对α-淀粉酶活性抑制率最高,为16.51%;与绿豆分级蛋白相比,绿豆蛋白的疏水氨基酸含量和水解度最高,分别为32.68%和6.28%,水解物的肽分子质量最小,均小于20kDa,因此选用绿豆蛋白制备α-淀粉酶抑制肽。然后分离鉴定绿豆蛋白肽,新发现了17条有潜在α-淀粉酶抑制效果的肽。本研究表明绿豆蛋白较其分级蛋白具有更强的α-淀粉酶抑制效果,能够用于降血糖的功能性食品或药物中。

高原地区多发性骨髓瘤伴高淀粉酶患者1例分析

多发性骨髓瘤(MM)是一种恶性浆细胞疾病,临床常表现为骨痛、贫血等症状。目前,关于恶性肿瘤合并高淀粉酶血症文献报道渐多,但多见于胃癌等肿瘤,MM伴高淀粉酶血症临床较少见,高原地区尚未发现。MM伴高淀粉酶血症患者因临床表现复杂,治疗尚无标准方案,未发现达雷妥尤单抗药物联合使用的文献报道。根据首例高原地区MM伴高淀粉酶血症的回顾分析结果,建议高原地区临床医生将淀粉酶水平作为MM患者病情严重程度的敏感指标,以降低MM的误诊率,并提供一种MM伴高淀粉酶血症疾病中新的治疗方案。

入院时血清淀粉酶、ApoB/ApoA1水平联合检测对重症急性胰腺炎的预测价值

目的:观察入院时血清淀粉酶、载脂蛋白B(ApoB)/载脂蛋白A1(ApoA1)水平联合检测对重症急性胰腺炎(AP)的预测价值。方法:回顾性分析2020年12月至2023年12月该院收治的86例AP患者的临床资料,按入院后是否发展为重症AP分为重症组(n=40)和非重症组(n=46),检测两组入院时血清淀粉酶、ApoB/ApoA1水平,并采用受试者工作特征(ROC)曲线,分析血清淀粉酶、ApoB/ApoA1水平单项及联合检测对重症AP的预测价值。结果:重症组入院时血清淀粉酶、ApoB/ApoA1水平均高于非重症组,差异有统计学意义(P<0.05);ROC曲线结果显示,入院时血清淀粉酶、ApoB/ApoA1水平联合检测预测重症AP的价值[曲线下面积(AUC)=0.821]高于二者单项预测(AUC=0.795、0.740)。结论:入院时血清淀粉酶、ApoB/ApoA1水平联合检测预测重症AP的价值高于二者单项预测。

血清淀粉酶、脂肪酶及C-反应蛋白在急性胰腺炎患者中的应用价值

目的探讨血清淀粉酶、脂肪酶及C-反应蛋白联合检验对诊断急性胰腺炎的临床价值。方法选取2020年4月—2022年5月甘肃省天水市第一人民医院收治的50例急性胰腺炎患者为研究组,包括30例轻型急性胰腺炎患者及20例重型急性胰腺炎患者;同时选择50例非急性胰腺炎急腹症患者作为A1组,50例健康体检人员作为A2组;对所有研究对象均展开血清淀粉酶水平检测、脂肪酶水平检测以及C反应蛋白检测,比较3组的血清淀粉酶水平、脂肪酶水平以及C反应蛋白检测结果,比较轻型、重型急性胰腺炎患者指标测定结果,并进行相关性分析。结果研究组血清淀粉酶水平、血清脂肪酶水平及C反应蛋白水平均高于A2组和A1组,差异有统计学意义(P均<0.05);重型急性胰腺炎患者血清淀粉酶水平为(768.49±43.22)U/L、血清脂肪酶水平为(1694.88±300.15)mg/L、C反应蛋白水平为(137.49±13.35)mg/L,高于轻型急性胰腺炎患者的(591.85±48.22)U/L、(1232.49±300.13)mg/L、(26.25±4.13)mg/L,差异有统计学意义(t=19.288、7.702、56.288,P均<0.05)。随着急性胰腺炎病情的严重,患者的血清淀粉酶水平、血清脂肪酶水平以及C反应蛋白水平呈现出显著提升(r=0.128、0.139、0.137,P均<0.05)。结论临床对急性胰腺炎患者在开展早期诊断工作期间,合理展开血清淀粉酶水平、血清脂肪酶水平以及C反应蛋白水平检测工作,可为疾病顺利诊断提供一定依据,发现随着急性胰腺炎病情的严重,患者的血清淀粉酶水平、血清脂肪酶水平以及C反应蛋白水平呈现出显著提升对于疾病的有效治疗可以奠定基础。

行内镜逆行胰胆管造影术术后发生高淀粉酶血症的影响因素分析

目的探讨内镜逆行胰胆管造影术术后并发高淀粉酶血症的危险因素,为今后临床治疗胰胆管相关疾病提供依据。方法回顾性分析皖北煤电集团总医院2021年4月至2023年4月收治的104例行内镜逆行胰胆管造影术治疗的患者的临床资料,根据术后是否发生高淀粉酶血症将其分为发生组(21例)与未发生组(83例),分析两组患者临床资料,并进行单因素与多因素Logistic回归分析,筛选内镜逆行胰胆管造影术术后发生高淀粉酶血症的影响因素。结果与未发生组比,发生组患者合并胆总管狭窄、合并十二指肠乳头憩室、插管困难占比及白细胞计数均升高,操作时间均延长(均P<0.05)。多因素Logistic回归分析结果显示,合并胆总管狭窄、十二指肠乳头憩室及操作时间长均为术后发生高淀粉酶血症的危险因素(OR=5.603、5.289、1.118,均P<0.05)。结论合并胆总管狭窄、十二指肠乳头憩室及操作时间长均为内镜逆行胰胆管造影术术后发生高淀粉酶血症的危险因素,临床应严格筛选上述危险因素给予相应预防干预措施,改善患者预后。

青香蕉果肉多酚成分鉴定及其对α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制作用

以青香蕉为原料提取多酚,利用超高效液相色谱-四极杆-静电场轨道阱质谱联用技术对多酚提取物进行成分鉴定,并通过体外实验评价香蕉果肉多酚对α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用,探究青香蕉降血糖的部分机制。结果表明:青香蕉果肉多酚提取物中共鉴定出28种化合物,包括21种多酚类化合物、2种有机酸、3种鞣花单宁代谢产物、以及香兰素和香豆素,检测到香蕉果肉中含有秦皮乙素、金丝桃苷、紫云英苷3种多酚类化合物,此外,二甲基鞣花酸和尿石素A为主要色谱峰;体外实验结果显示,香蕉果肉多酚对α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶均存在抑制作用,质量浓度为1.0 mg/mL时,对α-淀粉酶抑制率为(76.25±3.79)%,半抑制质量浓度(half maximal inhibitory concentration,IC50)为0.53 mg/mL;质量浓度为160μg/mL时,对α-葡萄糖苷酶抑制率为(92.54±0.69)%,IC50为35.76μg/mL。因此,多酚可能是青香蕉能够降血糖的活性成分之一。

红肉火龙果α-淀粉酶基因HpAMY3的克隆及功能鉴定

为了解α-淀粉酶在红肉火龙果〔Hylocereus polyrhizus(F.A.C.Weber)Britton et Rose〕果实淀粉降解中的作用,对红肉火龙果α-淀粉酶基因HpAMY3进行克隆和生物信息学分析,检测果实发育期间该酶的活性及其编码基因的表达,同时对HpAMY3重组蛋白的淀粉降解活性进行分析。结果表明:HpAMY3基因的开放阅读框长度为2742 bp,编码913个氨基酸;HpAMY3蛋白的理论相对分子质量为102370,理论等电点为pI 6.02,预测此蛋白位于叶绿体,且为亲水性蛋白。系统进化分析表明HpAMY3与拟南芥〔Arabidopsis thaliana(Linn.)Heynh.〕AtAMY3的亲缘关系最近,均属于AMYⅢ类。亚细胞定位实验结果显示HpAMY3定位于本氏烟草(Nicotiana benthamiana Domin)叶片的叶绿体,表明HpAMY3具有质体定位的特点。在授粉后20和23 d,红肉火龙果果实的α-淀粉酶活性较低;在授粉后25 d,α-淀粉酶活性显著(P<0.05)升高;在授粉后27和30 d,α-淀粉酶活性保持在较高水平。红肉火龙果果实的HpAMY3基因相对表达量在授粉后20和23 d较低,在授粉后25和27 d持续升高,在授粉后30 d略有降低。红肉火龙果果实发育期间α-淀粉酶活性与HpAMY3基因相对表达量的相关性较高(R^(2)=0.94)。体外淀粉降解活性实验结果显示:在含有HpAMY3重组蛋白的反应体系中均检测到麦芽糖和麦芽三糖,且二者含量极显著(P<0.01)高于含有载体对照pDR196的反应体系。综合上述结果,HpAMY3蛋白可能定位于红肉火龙果果实的淀粉体;在果实发育期间,HpAMY3基因上调表达,HpAMY3具有淀粉降解活性。

生淀粉水解α-淀粉酶Amy486的重组表达和性质分析

为明晰生淀粉水解α-淀粉酶Amy486独特的催化特征,将克隆自Exiguobacterium sp.J84菌株的amy486进行重组表达,并研究重组酶的酶学性质、嗜盐特性和钙离子依赖性。Amy486最适催化pH为7.5,在pH 6.5~8.5范围内酶活力保持40%以上,最适温度为35℃,30℃半衰期为100 h。1.5 mol/L Na_(2)SO_(4)处理可将Amy486的比酶活由1.53 U/mg提升至2209 U/mg。添加1.0 mol/L Na_(2)SO_(4),Amy486在35℃放置500 h,酶活力可保持60%以上。2.5 mmol/L CaCl_(2)可提升酶活力至110%,添加超过5 mmol/L CaCl_(2),Amy486的相对酶活力降至100%以下,EDTA孵育对Amy486蛋白的酶活力和稳定性影响较小。Amy486与钙离子结合的关键位点为K_(3)0_(2),K_(3)0_(2)E与钙离子的结合能力增强,从而降低该酶对外源钙离子的依赖性。α-淀粉酶Amy486及其突变体酶K_(3)0_(2)E是具有较高比酶活的生淀粉水解酶,对外源钙离子的依赖性较低,其活力的发挥依赖于适合的盐浓度,可应用于某些高盐环境下的淀粉水解。

带电短肽T_(7)+、T_(6)-对α-淀粉酶活性和构象的影响

利用带不同电荷的短肽T_(7)+、T_(6)-,探讨正电荷短肽T_(7)+和负电荷短肽T_(6)-对α-淀粉酶的活性和构象的影响。将短肽加入α-淀粉酶体系后,测定其相对酶活、米氏常数(Km)、活化能、Zeta电位等指标。为了更清晰地观察不同带电量的短肽对α-淀粉酶构象的影响,通过紫外吸收光谱、荧光光谱、同步荧光光谱、圆二色光谱进一步考察α-淀粉酶构象的变化。结果表明,将带电短肽加入α-淀粉酶的酶促反应中,正电荷短肽T7+抑制α-淀粉酶酶活,当短肽质量浓度为10^(-7)g/mL时,α-淀粉酶相对酶活降低2.40%,同时也使α-淀粉酶与可溶性淀粉的亲和力降低,活化能升高,Zeta电位增加。负电荷短肽T_(6)-促进α-淀粉酶酶活,当短肽质量浓度为10^(-7)g/mL时,α-淀粉酶相对酶活升高1.40%,同时也使α-淀粉酶与可溶性淀粉的亲和力升高,活化能降低,Zeta电位增加。光谱分析表明,不同带电短肽使α-淀粉酶的紫外-可见吸收光谱、荧光光谱以及二级结构发生不同程度的改变。这表明不同带电短肽可以发挥与电场相似的作用,即电场在作用于蛋白质时,产生的电场力促使蛋白质构象发生改变,人工设计合成短肽所带的表面电荷影响酶表面电荷的分布,进而导致酶的活性和构象发生改变。

麦芽糖酶-葡萄糖淀粉酶D246A异源表达及性质表征

以大型真菌灵芝中的麦芽糖酶-葡萄糖淀粉酶(MGAM)为研究对象,采用同源序列比对、同源模建、底物对接和定点突变等方法成功构建酶活力显著降低的突变体D246A.酶学性质表征结果表明:最适反应温度由野生型(wild type,WT)的65℃减少至60℃,突变体耐热能力下降;最适pH值由WT的6.0升高至7.0,有利于工程菌生长;半衰期由WT的2.0 h下降至1.5 h,酶稳定性降低.酶动力学结果表明:突变体D246A酶动力学曲线符合Michaelis方程,与WT相比,K_(m)值变大,表明酶与底物亲和力下降;V_(max)约降低至原来的1/4.

人参α-淀粉酶抑制肽的降血糖作用

通过采用高糖高脂饲料联合腹腔注射链脲佐菌素(Streptozotocin,STZ)构建小鼠2型糖尿病(Type 2 Diabetes,T2DM)模型,建模成功后连续4周给药治疗T2DM小鼠,以小鼠体质量、脏器指数、血糖、血脂、肝脏氧化应激反应、肝脏病理学检验结果作为参考指标,探究人参α-淀粉酶抑制肽对T2DM小鼠的降糖作用。结果表明,阿卡波糖阳性组和人参α-淀粉酶抑制肽各剂量组对小鼠的体重下降情况、高血糖情况均有不同程度的改善作用及调控效果,所以人参α-淀粉酶抑制肽各个剂量对T2DM小鼠具有降糖的效果。经过4周的治疗,高剂量组血糖从建模后的15.43 mmol/L下降至12.10 mmol/L与阿卡波糖阳性组血糖从建模后的15.71 mmol/L下降至10.17 mmol/L结果相近,且两组的小鼠肝脏损伤较轻,说明高剂量的人参α-淀粉酶抑制肽对2型糖尿病引发的肝脏损伤可起到明显的防护效果(P<0.01)。因此,人参α-淀粉酶抑制肽具有降血糖的作用和成为辅助治疗2型糖尿病产品或保健品的潜力。

不同品种白芸豆α-淀粉酶抑制剂的活性和含量差异分析

探究不同品种白芸豆α-淀粉酶抑制剂(α-AI)的活性和含量差异,为α-AI专用型白芸豆的品种选育和加工生产提供指导。以大白芸豆(YWL1、YWL2)、中白芸豆(Tbh1、Tbh2)、小白芸豆(云白1、云白2)品种为材料,对其营养成分、α-AI的活性和含量进行测定分析,并采用超滤膜进行不同分子量α-AI1(6~20 ku)、α-AI2(21~40 ku)、α-AI3(41~60 ku)的分离,测定不同分子量α-AI的活性差异。结果表明,不同品种白芸豆的蛋白质、脂肪、淀粉和灰分含量差异明显,含量分别为17.5%~26.9%、1.1%~2.3%、32.9%~43.5%、3.8%~4.6%。云白1蛋白质含量最高(26.9%);YWL2灰分含量最高(4.6%),Tbh2脂肪含量最高(2.3%);α-AI的活性依次排序为YWL1>YWL2>云白1>Tbh1>Tbh2>云白2;α-AI的含量依次为云白1>YWL1>Tbh1>YWL2>Tbh2>云白2;将α-AI提取液进行膜分离得到3种不同分子量结构的α-AI1(6~20 ku)、α-AI2(21~40 ku)、α-AI3(41~60 ku),活性平均值分别为(2315±313)、(11491±1226)、(45683±1914)U/g,依次是α-AI3>α-AI2>α-AI1。综合比较发现,YWL1具有较高的α-AI活性和含量,分别为23156 U/g和7.04%,更适于α-AI的生产。

高温大曲中高产淀粉酶和蛋白酶细菌的分离、鉴定及生物学特性研究

该研究采用稀释涂布平板法、平板划线法从高温大曲中分离菌株,利用透明圈法及酶活力测定筛选高产淀粉酶及蛋白酶的菌株,通过形态学观察及分子生物学技术对其进行菌种鉴定,并对其耐高温和耐酸性进行研究。结果表明,筛选得到一株高产淀粉酶和蛋白酶的优良菌株,编号为KC-6,其淀粉酶和蛋白酶活力分别为64.45 U/m L、0.60 U/m L,经鉴定,菌株KC-6为苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis),其可耐受60℃的高温,在强酸性条件生长缓慢,在弱酸和中性环境中生长旺盛。

一株高产淀粉酶魏斯氏菌产酶条件优化

淀粉酶广泛存在于动物、植物、微生物中,魏斯氏菌具有高产淀粉酶的能力,本研究拟从实验室前期分离的3株魏斯氏菌中通过淀粉圈水解法筛选出一株高产淀粉酶的菌株W.confusa C13,测定其基本生物学特征,并通过单因素试验、PB试验、半陡爬坡试验和响应面对菌株的产酶条件进行优化.研究确定了碳源比例、pH、接种量是影响菌株产淀粉酶活力最显著的三个因素(P<0.05),通过响应面得到最佳酶条件为脱脂奶粉:蔗糖为4.76∶1、pH 8.07、接种量5.79%、豆粕:酵母粉为3∶1、NaCl浓度为3%、发酵温度35℃、发酵时间24 h.在该条件下淀粉酶活力可达105.48 U/mL,比未优化酶活提升了103.43%,优化效果显著(P<0.05),且在该条件下模型预测值和真实值基本吻合(相对误差为3.5%),为乳酸菌所产的淀粉酶的开发和利用提供了新的研究思路.

基于麦芽糖诱导型启动子在枯草芽胞杆菌中异源表达麦芽四糖淀粉酶及其酶学性质的研究

麦芽四糖淀粉酶(Maltotetraose amylase,Mta)可以从淀粉的非还原末端特异性依次切割第4个α-1,4糖苷键形成麦芽四糖,目前在食品、医疗保健和造纸等领域具有重要应用。构建安全、高效的表达系统强化麦芽四糖淀粉酶的重组表达,进而降低以其为核心酶的麦芽四糖生物转化过程的生产成本具有迫切的现实需求。本研究将源自Pseudomonas saccharophila(DSM 654)的麦芽四糖淀粉酶基因mta在枯草芽胞杆菌Bacillus subtilis中重组表达,利用麦芽糖诱导型启动子实现其安全高效表达,之后对重组酶进行分离纯化和酶学性质表征。结果显示,将携带麦芽糖诱导型启动子Pglv的表达载体转入B.subtilis WB800N中,成功构建工程菌后进行诱导表达,并且利用金属离子螯合层析技术成功获得了Mta纯酶。酶学性质研究结果显示其最适反应温度为55℃,最适反应pH为7.5。动力学常数Km为(1.26±0.17)g/L、kcat/Km为(2275.07±32.83)L/s·g,纯酶在4℃储存14 d后保留40%的酶活力。本研究成功构建出安全、高效表达重组麦芽四糖淀粉酶的表达系统,为其规模化制备和应用提供了新策略。

碱性淀粉酶在棉机织物汽蒸退煮一步工艺中的应用

采用碱性淀粉酶JN20/精练酶BioPrep■Fusion复配对棉织物进行汽蒸退煮一步前处理,优化工艺为:碱性淀粉酶JN200.5 g/L、精练酶BioPrep■Fusion 10 g/L、酶液pH 8、轧酶温度60℃、汽蒸温度80℃、汽蒸时间60 min。采用该工艺处理的织物退浆率达98.25%,退浆等级8级,果胶去除率为85.26%,毛效可达14.6 cm,退浆和精练效果都非常好。相较于碱法煮练工艺,碱性淀粉酶JN20/精练酶BioPrep®Fusion复配汽蒸退煮一步工艺对织物强力损伤更小。

发芽小麦高温α-淀粉酶挤压膨化工艺优化

为解决酿造食品工业中小麦原料还原糖和阿魏酸含量低的问题,利用高温α-淀粉酶挤压膨化处理技术对发芽小麦进行预处理,基于外源酶、内源酶与高温膨化共同作用促进原料中淀粉水解,以期提高其中的还原糖和阿魏酸含量。通过单因素和正交试验,确定最佳工艺条件为物料水分30%、加酶量0.18%、末端机筒温度90℃、螺杆转速80 r/min。在此条件下,还原糖和阿魏酸含量分别为38.39%和3.78 mg/g。与小麦原料和单一发芽处理相比,还原糖含量分别提高481.67%和20.95%,阿魏酸含量分别提高131.90%和38.97%。通过冷场发射扫描电镜(cold field emission scanning electron microscope,Cold FESEM)、傅里叶转换红外光谱(Fourier transform infrared spectroscopy,FTIR)、高效体积排阻色谱(high performance size exclusion chromatography,HPSEC)表征,观察到发芽小麦的淀粉结构被破坏,其结晶度、短程有序度、重均分子量降低。高温α-淀粉酶挤压膨化处理发芽小麦能够促进还原糖的生成和阿魏酸的释放,为后续发酵食品的生产提供更好的发酵条件和更多的风味前体物质。

pH值对双(2-甲基-3-呋喃基)二硫醚与α-淀粉酶结合的影响及相互作用机制研究

双(2-甲基-3-呋喃基)二硫醚[bis(2-methyl-3-furyl)disulfide,BMFDS]是肉类的一种关键香气化合物,它与口腔中的α-淀粉酶相互作用,影响人体对香气的感知。该研究采用气相色谱-质谱、紫外吸收光谱、荧光光谱、zeta-电位检测、蛋白质表面疏水性、分子对接分析等方法研究BMFDS与α-淀粉酶之间的相互作用机制以及pH值对其相互作用的影响。结果表明,BMFDS与α-淀粉酶之间自发的相互作用形成了基态复合物,对α-淀粉酶的荧光产生了静态猝灭。不同pH条件下其相互作用强度顺序为pH 7.0>pH 8.5>pH 5.0,但都以疏水相互作用为主。pH会影响BMFDS与α-淀粉酶之间的相互作用强度,但并不会改变二者间的相互作用力和反应类型。总之,BMFDS和α-淀粉酶之间存在非共价相互作用,使α-淀粉酶结构松散,且在3种pH条件下的作用强度有差异。该研究可为后续肉类风味调控提供理论依据。