适应性进化提高淀粉酶产色链霉菌T17自发酸胁迫抗性的生理机制

考察ε-聚赖氨酸产生菌淀粉酶产色链霉菌(Streptomyces diastatochromogenes)T17,及其经酸性适应性进化得到的3株进化菌株(S.diastatochromogenes AE41、S.diastatochromogenes AE51和S.diastatochromogenes AE56)应对自发酸胁迫的生理响应。比较2个胁迫时间下原始菌株和进化菌株相关生理指标的变化。结果显示,在第0小时(pH 6.5),原始菌株和进化菌株的各生理指标无明显区别;在第48小时(pH 3.2),相较于原始菌株,进化菌株的耐酸能力更强,胞内pH值、ATP含量和H+-ATPase活性均明显提高,胞内天冬氨酸、丙氨酸、谷氨酸、赖氨酸、甘氨酸以及脯氨酸浓度明显增加,细胞膜脂肪酸的不饱和度明显增加从而提高流动性。进化菌株能够实现对自发酸胁迫的制衡。

淀粉酶产色链霉菌TUST2中ε-聚赖氨酸降解酶的纯化和性质

分离得到产抗菌聚氨基酸ε-聚赖氨酸菌株淀粉酶产色链霉菌TUST2,从中纯化了ε-聚赖氨酸降解酶,并对其性质进行了研究.结果表明,该酶为膜结合蛋白.为提取该降解酶,先收集菌体细胞并用超声波破碎,细胞膜部分用1.0mol/LNaSCN溶液溶解.将粗酶液进行SephadexG100凝胶柱层析分离.用100mmol/L磷酸缓冲液洗脱,收集活性部分.纯化后的样品用SDS-PAGE检测,酶亚基分子量约为54700.酶活力在pH=6.0～9.0间稳定,最适宜pH=7.0.酶的最适温度为30℃,在10～50℃水浴30min酶活力未见明显下降.研究了不同金属离子对酶活力的影响,结果表明,Zn2+,Cu2+和Fe3+可分别提高酶活力29.72%,15.85%和15.08%;但Ag+,Hg2+,Co2+和Mn2+对酶活力有强烈的抑制作用.Ca2+,K+和Ba2+对酶活力没有影响.添加4%Tween-80能提高酶活力10%,但EDTA能强烈抑制酶活力.研究结果表明,此降解酶的性质与白色链霉菌产生的ε-聚赖氨酸降解酶的性质相似.

淀粉酶产色链霉菌1628中toyF基因的克隆与丰加霉素合成相关性

为考察编码腺苷琥珀酸裂解酶toyF基因对淀粉酶产色链霉菌Streptomyces diastatochromogenes 1628合成丰加霉素的影响,本研究设计简并引物,首次克隆获得了菌株1628的toyF基因,并构建了敲除质粒p KC1132-toyF’,通过接合转移转入菌株1628,获得toyF基因缺失株1628-ΔTOYF。结果表明,与原始菌株1628相比,缺失株1628-ΔTOYF中TOYF的酶活和丰加霉素产量分别降低66.7%、87.5%。在缺失株1628-ΔTOYF中回补表达toyF基因构建了重组菌1628-ΔTOYF/toyF。重组菌1628-ΔTOYF/toyF中的TOYF酶活和丰加霉素产量,较缺失株1628-ΔTOYF分别提高了2.7和8.3倍。由此可见,toyF基因是参与菌株1628生物合成丰加霉素的关键酶基因。本文toyF基因的克隆及其功能研究,为克隆完整的丰加霉素生物合成基因簇及其丰加霉素生物合成机制的研究奠定了基础。

铁皮石斛梢枯病病原菌分离鉴定及淀粉酶产色链霉菌代谢产物对其防治效果

梢枯病是浙江省武义县寿仙谷铁皮石斛种植基地一种常见的真菌病害,严重影响铁皮石斛的产量与品质,而鉴定枯梢病的病原菌是有效防治该病害的前提条件。本文通过对铁皮石斛染病组织培养、病原菌分离纯化,柯赫法则验证、形态学观察与基因序列比对分析(Alta1、EF-1α、RPB2、ATP、His 3)等,明确了引起浙产铁皮石斛梢枯病的病原菌为链格孢菌Alternaria alternata。淀粉酶产色链霉菌Streptomyces diastatochromogenes 1628代谢产物对链格孢菌菌丝生长有较强的抑制作用,IC_(50)为0.461%(体积浓度)。田间试验结果表明,在7和14 d的校正防效分别为68.35%和65.97%,均显著高于阳性对照50%多菌灵。本研究明确了铁皮石斛梢枯病病原菌的分类地位,并获得能够有效抑制该病原菌的微生物抑菌物质淀粉酶产色链霉菌代谢产物,为后续浙产铁皮石斛梢枯病的防治提供了实践依据。

甘氨酸对淀粉酶产色链霉菌Cbγ4产ε-聚赖氨酸的影响

为了研究甘氨酸对淀粉酶产色链霉菌Cbγ4产ε-聚赖氨酸的影响,在种子培养阶段添加不同浓度的甘氨酸。结果表明,在种子培养初期添加3 g/L甘氨酸,天冬氨酸激酶活性会明显提高,ε-聚赖氨酸最高可积累0.51g/L,比对照组高27.5%。5L自控式发酵罐发酵ε-聚赖氨酸试验中,种子液中添加甘氨酸组比对照组明显提高了菌体耗糖速度,缩短了达到最高生物量的积累时间,ε-聚赖氨酸产量也提高至12.87g/L,糖酸转化率也比对照组提高了30.6%。因此甘氨酸可作为一种新型营养物质用于ε-聚赖氨酸的生产。

菌丝体形态对淀粉酶产色链霉菌CGMCC3145发酵生产ε-聚赖氨酸的影响

采用淀粉酶产色链霉菌CGMCC3145发酵生产ε-聚赖氨酸(ε-PL),考察Mg2+和孢子浓度对菌丝体形态和ε-PL的影响。结果表明,Mg2+可以使菌丝体更好地分散,培养基中添加0.5 g/L Mg2+,ε-PL比对照组提高了30.91%;发酵初始时添加Mg2+对ε-PL的生物合成最有利。当接种1.0×105 cfu/mL孢子悬液时,菌丝球直径为1.0×108 cfu/mL的2.66倍。相反,ε-PL产量、生物量、菌丝球的体积和菌丝球个数/mL与孢子接种浓度呈正相关,当接种1.0×108 cfu/mL孢子悬液时,上述4个指标分别比接种1.0×105 cfu/mL时提高68.2%、58.8%、126.2%和114.9%。

淀粉酶产色链霉菌杀灭钉螺研究

从钉螺孳生土壤中分离得一株放线菌(编号218),经鉴定为淀粉酶产色链霉菌。实验室用摇瓶培养物0.1％浸杀钉螺,48h校正死亡率为96.0％—100.0％;以工业生产菌粉10mg/L浸杀钉螺,48h校正死亡率达98.0％,100mg/L浸泡螺卵,48h孵出率为9.0％。现场用菌粉75mg/L浸泡48h,钉螺校正死亡率为96.9％,试验区植物无枯黄。对鱼类有一定的毒性,但作用缓慢。

醇类物质对淀粉酶产色链霉菌Bcα1产ε-聚-L-赖氨酸聚合度的影响

为了在不影响ε-聚-L-赖氨酸（ε-Poly—L—Lysine，ε—PL）抑菌性能的同时减弱其带有的苦味，改善口感，研究了向培养基中添加不同醇类物质对淀粉酶产色链霉菌Bcα1产ε-PL聚合度分布的影响，并且比较了分别以葡萄糖和甘油为碳源对Bcctl产ε-PL聚合度的影响。结果表明：向以葡萄糖为碳源的培养基中添加0．5％的正丁醇后，ε-PL平均聚合度明显降低由31～32降低至24～25。进一步分析推测，正丁醇的羟基能够与ε-PL末端羧基结合，发生酯化反应，所得ε—PL衍生物为ε—PL酯，且该反应的发生有利于ε—PL链长延伸的终止。

几个常用内参基因在淀粉酶产色链霉菌1628抗药性突变株中稳定性的评估

淀粉酶产色链霉菌Streptomyces diastatochromogenes 1628是一株重要的生防菌株,其代谢产物对多种植物病原真菌具有较强的抑制效果。为了筛选在其不同抗药性高产突变株中均能稳定表达的内参基因,选择16S rRNA、sigB、hrdB、thyA、gyrB和rpoA共6个常见内参基因,分别探究它们在野生型菌株、链霉素抗性突变株、利福平抗性突变株和巴龙霉素抗性突变株中的表达情况,并用geNorm软件和NormFinder软件对结果进行分析。结果表明,使用不同软件分析得出的最佳内参基因略有差异。geNorm软件认为在上述4株菌株中,表达最稳定的内参基因分别是gyrB、gyrB、thyA、rpoA;而NormFinder软件认为rpoA基因在所有菌株的表达都是最稳定的。利用平均等级的算法平衡两个软件的分析差异,最终确定rpoA基因为表达最稳定的内参基因。通过检测toyG基因的表达水平,发现以rpoA作为内参基因能得到更合理的结果。

淀粉酶产色链霉菌1628发酵培养基及发酵条件的优化

淀粉酶产色链霉菌1628(Streptomyces diastatochromogenes)是一株具有广阔应用前景的生防菌株,其合成的主要活性物质为核苷类抗生素——丰加霉素.为了提高淀粉酶产色链霉菌的发酵水平,本研究采用单因素和正交实验设计,对菌株1628的发酵培养基和发酵条件进行了优化,优化后的最佳培养基配方为:可溶性淀粉1.5%、黄豆粉5%、FeSO40.1%、CaCO30.5%、NH4NO3 0.3%、KH2PO4 0.3%,最适初始pH7.0.在供试的发酵条件内,装液量60mL/250mL,发酵温度28℃,摇床转速180r/min,发酵时间为92h.活性物质丰加霉素的产量最高156.17mg·L-1,比优化前提高了3.3倍.

杭白菊枯萎病的病原菌分离鉴定及淀粉酶产色链霉菌对其防治效果

杭白菊枯萎病是杭白菊重要病害之一,枯萎病的爆发对杭白菊产量造成了巨大的影响。为了明确杭白菊枯萎病的病原菌及其生防菌的防治效果,本文通过形态学和ITS序列分析方法,初步鉴定杭白菊枯萎病病原菌为半裸镰刀菌Fusarium incarnatum。进一步采用菌丝生长速率法和孢子萌发法,测定了淀粉酶产色链霉菌Streptomyces diastatochramogenes 1628代谢产物对该病原菌的抑制效果。结果发现,链霉菌1628代谢产物对菌丝生长和孢子萌发的EC_(50)分别为2.22%和4.70%(体积浓度)。盆栽试验结果表明,施用淀粉酶产色链霉菌代谢产物原液14和28 d后,其对杭白菊枯萎病的保护效果、治疗效果分别为52.84%和42.85%、19.23%和30.16%。说明淀粉酶产色链霉菌1628的代谢产物对杭白菊枯萎病具有明显的保护和治疗作用。

氨氮对淀粉酶产色链霉菌产ε-聚赖氨酸的影响

ε-聚赖氨酸(ε-poly-L-lysine,ε-PL)是一种新型广谱天然防腐剂。由于生产成本较高,价格昂贵,限制了其在食品工业上的广泛应用。为降低生产成本,研究了不同氨氮(NH4^+-N)浓度对淀粉酶产色链霉菌生产ε-聚赖氨酸的影响。摇瓶发酵试验结果表明,当NH+4-N初始质量浓度为0.5g/L时,提高了天冬氨酸激酶(aspartokinase,Ask)和聚赖氨酸合成酶(polylysine synthetase,Pls)的活力,发酵96h,ε-PL产量达到0.95g/L,与对照组相比提高了15.13%。5L发酵罐分批发酵和流加发酵实验确定了一种有效提高ε-PL产量的方法:初始NH4^+-N质量浓度2.5g/L,发酵过程中流加(NH4)2SO4使NH4^+-N质量浓度维持在0.5g/L。采用此工艺进行补料分批发酵,ε-PL最高产量达到27.67g/L,与对照组相比提高了17.72%。

浙麦冬黑斑病病原菌的分离鉴定及淀粉酶产色链霉菌对其生物防治效果

黑斑病是浙江省慈溪市浙麦冬种植基地常发病害,传染速度快且严重影响麦冬的产量与品质。为了明确引起黑斑病的病原菌以便后续有效防治该病害,本文通过对染病组织培养、病原菌分离纯化和柯赫法则验证、形态学观察与基因序列分析比对(ITS、EF-1α、RPB2、Alt a 1、His 3、ATP),最终鉴定出引起浙麦冬黑斑病的病原菌是链格孢菌Alternariaalternata。研究淀粉酶产色链霉菌Streptomyces diastatochromogenes 1628代谢产物对黑斑病的防效结果表明,1628代谢产物对链格孢菌菌丝生长具有较强的抑制作用,其EC50=0.764%(体积浓度)。田间防效结果表明7和14 d校正防效分别可达74.08%和65.28%,均高于阳性对照多菌灵。本研究明确了浙麦冬黑斑病病原菌的分类地位,并筛选到能有效抑制该病原菌的生防菌株淀粉酶产色链霉菌,为后续浙麦冬黑斑病的防治提供依据。

AdpA_(sd)对于淀粉酶产色链霉菌1628的形态分化和丰加霉素合成的影响

为阐明Adp A与淀粉酶产色链霉菌Streptomyces diastatochromogenes 1628形态分化和合成丰加霉素(Toyocamycin,TM)的相关性。本研究设计简并引物成功克隆了来源于淀粉酶产色链霉菌1628大小为1263 bp的adp Asd基因(Gen Bank登录号:JX847412)。结果发现,Adp Asd的氨基酸序列与灰色链霉菌Streptomyces griseus的Adp Ag及天然色链霉菌Streptomyces coelicolor的Adp Ac的同源性分别为80.7%和78.9%。将adp Asd基因置于载体p IB139启动子Perm E*下游,构建了重组质粒p IB139-adp Asd,将其通过接合转移法分别转入菌株1628-T15(高产TM)和1628-T62(低产TM,孢子合成受阻)中,获得重组菌1628-T15A和1628-T62A。结果表明,与出发菌株1628-T62相比,重组菌1628-T62A产孢能力得到一定程度的恢复;重组菌1628-T15A与出发菌株1628-T15相比,整体形态无明显变化。摇瓶发酵试验表明,重组菌1628-T62A较出发菌株1628-T62的TM合成能力显著提高,最终TM产量提高了近3倍,而重组菌1628-T15A的TM产量比出发菌株1628-T15仅有小幅提升。以上结果证实adp Asd参与淀粉酶产色链霉菌1628形态分化以及TM合成,为今后深入理解adp Asd的分子调节机制奠定了基础。

一株抗茶炭疽菌和魔芋镰刀菌的淀粉酶产色链霉菌的分离、鉴定及生防潜能

【背景】放线菌是一类重要的生防菌,具有强大的代谢活性,能产生抗生素、酶、酶抑制剂和激素等天然产物抑制病原物生长。【目的】从茶树根际分离得到放线菌,研究候选放线菌对茶炭疽菌和魔芋镰刀菌的抑菌活性及其生防潜能。【方法】分别以茶炭疽病致病菌Colletotrichum camelliae和魔芋茎腐病致病菌Fusarium solani为指示菌,采用土壤稀释涂布法、平板对峙法和菌丝生长速率法,从茶树根际土壤中分离、筛选拮抗放线菌,并根据菌株的形态特征、生理生化特性和系统发育分析结果对其进行分类鉴定,并开展候选放线菌的产促生相关物质和分泌细胞壁水解酶能力的定性检测试验。【结果】共分离得到14株拮抗放线菌,菌株A-dyzsc04-2的拮抗效果最强,被鉴定为淀粉酶产色链霉菌(Streptomyces diastatochromogenes)。该菌株的活菌体对C.camelliae和F.solani的抑制率分别为66.71%±1.23%和71.59%±2.46%,其无菌发酵滤液对2种指示菌的抑菌率均大于90%;此外,菌株A-dyzsc04-2还具有产嗜铁素和葡聚糖酶以及溶解无机磷的能力。【结论】菌株A-dyzsc04-2是一株优良的生防菌,具有较高的开发利用价值,研究结果为菌株A-dyzsc04-2防治茶炭疽病和魔芋茎腐病提供了理论支撑。

基于非靶向代谢组学的烟草镰刀菌根腐病和黑胫病拮抗链霉菌及其代谢产物的鉴定

针对烟草两种土传病害病原菌—镰刀根腐病菌Fusarium oxysporum和黑胫病菌Phytophthora parasitica,本实验室前期从烟草根际土壤中筛选得到1株具有良好生防作用的链霉菌,结合形态学、生理生化特性及分子生物学分析,将其鉴定为淀粉酶产色链霉菌Streptomyces diastatochromogenes。通过对该生防菌发酵液进行色谱-质谱联用(LC/MS)非靶向代谢组学分析,确定其重要代谢产物为茴香霉素。利用高效液相色谱对产物进行验证及含量测定,表明每克粗提物中含有茴香霉素423.98μg。菌丝生长抑制试验结果表明,茴香霉素对镰刀根腐病菌和黑胫病菌的EC_(50)值分别为1556.36和40.74μg/m L。本研究为烟草镰刀菌根腐病和黑胫病的生物防治提供了新的方法,并为其代谢产物—茴香霉素的进一步利用提供了有价值的理论基础。

透明颤菌血红蛋白基因在淀粉酶产色链霉菌中的表达及对合成丰加霉素的影响

【目的】丰加霉素(Toyocamycin)是核苷类抗生素家族的重要成员,其在农业植物病害防治领域具有巨大的应用价值。为改善丰加霉素生产菌淀粉酶产色链霉菌(Streptomyces diastatochromogenes 1628)发酵过程溶氧限制,旨在实现vgb在S.diastato-chromogenes 1628中的表达以促进丰加霉素的生物合成。【方法】首先以gfp为报告基因检测红霉素抗性基因启动子Perm*在S.diastatochromogenes 1628中的转录活性,再利用PermE*实现vgb的异源表达。【结果】在荧光显微镜下,重组菌1628-GFP菌丝可发出稳定明亮的绿色荧光,表明启动子PermE*在菌株1628中可有效启动外源基因的表达;通过一氧化碳结合差光谱分析显示VHb具有生物学活性;摇瓶实验表明:与原始菌株相比,重组菌可促进丰加霉素产量的提高,在中度和高度限氧条件下促进效果尤为明显,提高幅度分别为48.9%和104.5%。PCR和发酵效价检测显示重组菌具有良好的遗传稳定性。【结论】成功实现了vgb在S.diastatochromogenes 1628中的表达,有效提高了其丰加霉素的合成水平,为丰加霉素的工业化生产提供了基础条件。

卑霉素产生菌Tü-57的诱变育种研究

[目的]对卑霉素产生菌Tü-57进行诱变的育种。[方法]先对4种诱变方式的致死剂量进行筛选,再采用复合诱变的方法,用紫外线和微波2种诱变剂与链霉素和氯化锂2个底物标记物,两两结合作用于原始菌,得到诱变株,并测定其卑霉素产量。[结果]获得了一株卑霉素高产菌株ul36,其作用条件为紫外350 s,链霉素0.8μg/ml,与原始菌相比,ul36卑霉素产量提高2.58倍。诱变株经多次发酵测效价结果稳定。[结论]为将卑霉素应用于实际生产奠定了基础。

铁皮石斛镰刀菌根腐病病原菌的鉴定及其对链霉菌发酵液的敏感性分析

根腐病是危害浙江省铁皮石斛的重要病害之一,鉴定根腐病的病原菌是有效防治该病害的前提条件。为进一步明确前期经柯赫法则验证为病原菌的镰刀菌(编号为GF-14)分类地位,本研究通过形态学鉴定,并结合内源转录间隔区(rDNA-ITS)、翻译延伸因子(TEF-1α)和RNA聚合酶基因(RPB1和RPB2)等序列的同源性比对及系统发育分析,确认该致病菌属于变红-木贼镰刀菌复合种群Fusarium incarnatum-equiseti species complex。进一步采用菌丝生长速率法,测定了该病原菌对多种杀菌剂的敏感性,并选取对菌丝生长抑制效果最佳的杀菌剂进行田间防效的测定。结果表明:本实验室分离获得的生防菌淀粉酶产色链霉菌Streptomyces diastatochramogenes 1628发酵液对该致病菌的抑制效果最佳,发酵液稀释10倍后抑制率高达98.22%;而宁南霉素、井冈霉素则对该致病菌无显著抑制作用。菌株对峙试验发现淀粉酶产色链霉菌1628对菌株GF-14的菌丝生长抑制率为32.65%。田间防效试验表明其发酵液对铁皮石斛根腐病病株具有防治效果,为34.90%。本研究明确了铁皮石斛镰刀菌根腐病病原菌的分类地位,并筛选到能有效抑制该病原菌的微生物杀菌剂,为后续铁皮石斛根腐病的防治提供依据。

ε-聚赖氨酸高产菌株的诱变选育

ε-聚赖氨酸(ε-PL)是一种L-lysine同聚物,主要由链霉菌科和麦角真菌产生。但是,ε-PL野生菌株的生产能力较低,这一定程度上制约对它的进一步研究和利用。对于包括链霉菌在内的大多数细菌,ε-PL的前体物lysine一般是通过天冬氨酸途径合成的。这条途径中的第一个关键酶Ask活性会受到氨基酸终产物的调节。而且,天冬氨酸还可以反馈抑制上游磷酸烯醇式丙酮酸脱羧酶的活性。为了解除上述反馈调节,提高ε-PL产生菌的产量,我们利用(SG+Gly+L-lysine+AHV)复合抗性,筛选出一种高产菌株L9。最终,我们得到了一株淀粉酶产色链霉菌(Streptomyces diastatochromogenes)L9,其摇瓶产量为0.69g/L,比出发菌株高13%。经代传稳定性研究证明其产酸量和抗性标记均可稳定遗传。