细胞因子诱导及贴壁法提取淋巴内皮祖细胞

目的:使用细胞因子诱导及贴壁法从C57BL/6小鼠骨髓细胞中分离淋巴内皮祖细胞(LEPCs),并对其进行鉴定。方法:通过贴壁技术获取小鼠骨髓24小时后贴壁细胞,待其增殖融合至80%~90%后,使用Tryple Express酶对贴壁细胞消化1分钟,去除消化掉的细胞,剩余细胞继续培养,待其再次融合至80%~90%时,进行1:2传代,将获得的第三代细胞进行流式细胞术检测其表面特异性标记物,并对其进行淋巴管成管分化实验,鉴定细胞。结果:我们所获取的LEPCs,在体外诱导后,可形成典型的微管样结构,并且经过多次传代后可形成“鹅卵石”样的典型细胞形态;其表面特异性标记物为:CD34、CD113双阳性率为:87.17% ±1.77%;CD113、VEGFR-3双阳性率为:85.17% ±1.65%;CD34、VEGFR-3双阳性率为:83.77% ±0.42%,符合相关文献关于LEPCs的报道。结论:利用细胞因子诱导及贴壁法可获取较高纯度的LEPCs。

淋巴内皮祖细胞对小鼠后肢淋巴水肿治疗的影响

目的:研究小鼠淋巴内皮祖细胞(Lymphoid Endothelial Progenitor Cells,LEPCs)对于淋巴水肿的治疗影响。方法:分离并培养小鼠骨髓LEPC细胞,培养至3~4代,使用流式细胞术以及成管实验对LEPCs进行鉴定。通过手术方法建立小鼠后肢淋巴水肿模型,并测试模型的稳定性。将LEPCs在淋巴水肿部位进行注射,测量小鼠腿围并对淋巴管进行计数,测量LEPCs组和对照组差异。结果:分离的细胞呈纤维样,通过流式细胞术鉴定其为LEPCs,在VEGF-C诱导下可以形成管样结构;通过手术建立淋巴水肿模型,手术肢较健康肢明显增粗,且一个月内稳定存在;将LEPCs在淋巴水肿部位进行注射,发现LEPCs干预组较对照组腿围明显变细且淋巴管计数增高,两组比较差异具有统计学意义(P<0.05)。结论:LEPCs可以缓解淋巴水肿症状。

人脐带血淋巴管内皮祖细胞的分化及其生物学特征

目的研究脐带血中CD34+/CD133+/VEGFR-3+淋巴管内皮祖细胞经VEGF-C诱导向内皮细胞分化过程中生物学特征的变化,并探讨其分化的机制。方法取脐带血,用Percoll密度梯度离心法分离单形核细胞,再用流式细胞仪分选CD34+/CD133+/VEGFR-3+细胞,然后用VEGF-C诱导分化。在扫描电镜和透射电镜下观察细胞表面形态和细胞内结构的变化,并在激光扫描共焦显微镜下观察特征性标志物的表达变化。结果脐带血中的淋巴管内皮祖细胞表达CD34、CD133和VEGFR-3。CD34+/CD133+/VEGFR-3+细胞经VEGF-C诱导后7 d,呈长梭形,细胞伸出板状伪足和丝状伪足,出现较多短的微绒毛,表面可见细胞小凹,细胞质中含有丰富的线粒体和粗面内质网。诱导后14 d,细胞已具有内皮细胞的特征,表达淋巴管内皮特异性标志物LYVE-1和5-核苷酸酶,CD133表达消失,细胞质中可见Weibel-Palade小体。结论脐带血中存在CD34+/CD133+/VEGFR-3+淋巴管内皮祖细胞,这些细胞在VEGF-C诱导作用下可能通过VEGF-C/VEGFR-3信号途径分化为淋巴管内皮细胞。

细胞因子对淋巴管内皮祖细胞的趋化和动员作用

目的研究血管内皮生长因子C(VEGF-C)、基质细胞衍生因子-1(SDF-1)、单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)和粒细胞集落刺激因子(G-CSF)对CD34+/CD133+/VEGFR-3+淋巴管内皮祖细胞(LEPCs)的趋化和动员作用。方法用Percoll非连续密度梯度离心法分离狗外周血单个核细胞,再用流式细胞术分选VEGFR-3+LEPCs,激光扫描共焦显微镜下观察细胞特征性标志物CD34和CD133的表达。通过跨膜迁移实验观察VEGF-C、SDF-1、MCP-1和G-CSF对LEPCs的趋化作用,并用扫描电镜观察迁移细胞的形态特征。在大鼠皮下分别注射VEGF-C、SDF-1、MCP-1和G-CSF,用流式细胞术检测外周血单个核细胞中LEPCs数目,同时用全自动血样分析仪计数白细胞。结果与对照组相比,VEGF-C、SDF-1、MCP-1和G-CSF组跨膜迁移细胞的百分率增大,用VEGFR-3和CXCR-4阻断抗体处理后VEGF-C和SDF-1的趋化迁移作用明显降低。注射VEGF-C、SDF-1、MCP-1和G-CSF后,大鼠外周血中LEPCs的数量明显增多。未见白细胞显著增多。结论VEGF-C、SDF-1、MCP-1和G-CSF对LEPCs有趋化迁移和动员作用,VEGF-C/VEGFR-3和SDF-1/CXCR-4信号途径在LEPCs趋化迁移方面起着重要调控作用。

VEGFR-3基因转染淋巴管内皮祖细胞后可溶性VEGFR-3蛋白的分泌

目的研究携带BABL/c小鼠VEGFR-3(1-3Ig)基因的重组腺病毒转染淋巴管内皮祖细胞(LEPCs)后,对可溶性VEGFR-3蛋白分泌及其生物学特性的作用。方法采用巢式RT-PCR技术从BABL/c小鼠胎盘组织中扩增VEGFR-3(1-3Ig)的编码基因,并通过重组PCR技术在基因的N端加上人CD33的信号肽。将该基因片段亚克隆入腺病毒表达载体(pDC316-IRES-EGFP),重组质粒经酶切及测序验证后,与包装质粒共转染293细胞以产生重组腺病毒。将构建好的携带有小鼠VEGFR-3(1-3Ig)基因的重组腺病毒转染淋巴管内皮祖细胞,通过ELISA检测转染细胞上清液中可溶性VEGFR-3蛋白的分泌及其对VEGF-C的中和作用。结果成功构建了带有信号肽的BABL/c小鼠VEGFR-3(1-3Ig)基因的腺病毒表达质粒,并获得高滴度的携带有小鼠VEGFR-3(1-3Ig)基因的重组腺病毒,重组腺病毒转染淋巴管内皮祖细胞后,可使转染细胞分泌可溶性VEGFR-3蛋白,该蛋白具有中和VEGF-C的作用。结论成功地制备了携带BABL/c小鼠VEGFR-3(1-3Ig)基因的重组腺病毒,用该病毒转染淋巴管内皮祖细胞可使其分泌可溶性VEGFR-3,该蛋白在体外具有中和VEGF-C的作用,这为临床抑制肿瘤淋巴管新生奠定了基础。

RNAi体外沉默淋巴管内皮祖细胞VEGFR-3基因表达

目的应用聚乙烯亚胺(polyethyleneimine,PEI)包裹淋巴管内皮祖细胞(lymphatic endothelial progenitor cells,LEPCs)血管内皮生长因子受体3(vascular endothelial growth factor receptor-3,VEGFR-3)基因siRNA,体外沉默VEGFR-3基因表达,研究抑制LEPCs分化抗肿瘤淋巴管新生的作用。方法 Ficoll法分离人脐血单个核细胞,流式细胞仪、免疫荧光分选并鉴定LEPCs。PEI包裹VEGFR-3siRNA并转染入LEPCs,流式细胞仪检测转染效率。RT-PCR和Western blot检测mRNA和蛋白质水平VEGFR-3基因沉默效果。结果 VEGFR-3siRNA成功转入LEPCs,转染效率30%。VEGFR-3siRNA转染组LEPCs VEGFR-3mRNA和蛋白表达均降低(P<0.05)。结论体外经由PEI介导的siRNA能有效的抑制LEPCs VEGFR-3的表达,为以LEPCs为靶点抑制肿瘤淋巴管新生提供了实验依据。

淋巴管内皮祖细胞标志物的研究进展

淋巴管内皮祖细胞是淋巴管新生和再生的起点,分化成的淋巴管内皮细胞构成了淋巴管网络的基本框架。随着淋巴管新生和再生研究的深入,淋巴管内皮祖细胞在其中发挥的作用得到越来越多的关注。淋巴管内皮祖细胞已成为当前的研究热点之一,我们就其标志物的相关进展进行综述。

糖尿病和糖尿病足溃疡患者淋巴管内皮祖细胞改变及其影响因素研究

目的探讨糖尿病患者和糖尿病足溃疡患者外周血淋巴管内皮祖细胞的改变及其影响因素。方法采用RT-PCR检测外周血白细胞中淋巴管内皮祖细胞标志物VEGFR3mRNA表达;采用免疫组织化学检测外周血白细胞VEGFR3蛋白表达,并计数VEGFR3阳性细胞数量;检测各组患者临床指标,分别和外周血VEGFR3表达进行统计学相关分析。结果与正常对照组比较,实验组外周血VEGFR3mRNA表达及VEGFR3蛋白表达减少,差异有统计学意义(P<0.01)。糖尿病1组(Hb A1C<7%)与正常对照组比较,VEGFR3阳性细胞数量减少,差异有统计学意义(P<0.05);糖尿病2组(Hb A1C≥7%)和糖尿病足组与正常对照组比较,VEGFR3阳性细胞数量减少(P<0.01)。相关因素分析显示:VEGFR3表达的影响因素为糖化血红蛋白、空腹血糖、收缩压、舒张压。结论糖尿病及糖尿病足溃疡患者外周血淋巴管内皮祖细胞标志物VEGFR3表达减少,且和糖化血红蛋白、空腹血糖、收缩压、舒张压呈负相关。

人外周血单核细胞经体外诱导向淋巴管内皮细胞分化的实验研究

目的探讨人外周血单核细胞经体外诱导能否向淋巴管内皮细胞分化。方法从健康人外周血分离单个核细胞,经贴壁法获取单核细胞,用内皮细胞培养基EGM-2和体外诱导培养单核细胞,分别用免疫荧光细胞化学染色法、RT-PCR及流式细胞术检测单核细胞对淋巴管内皮标志物VEGFR-3、Podoplanin、LYVE-1、Prox-1和内皮共同标志物vWF、VEGFR-2的表达。结果经过诱导培养后的细胞呈纺锤形或多角形,表达VEGFR-3、LYVE-1、Prox-1、Podoplanin和vWF,弱表达或者不表达VEGFR-2。结论人外周血来源的单核细胞经体外诱导培养可分化为淋巴管内皮样细胞。

淋巴管新生及其在相关疾病发生和治疗中的意义

淋巴管在维持体内微环境衡定、免疫反应和肿瘤淋巴转移等方面起着重要作用,淋巴管新生与胚胎发育、外伤修复、炎症转归和肿瘤转移密切相关。在趋化因子和生长因子的作用下,淋巴管内皮细胞迁移、增殖和构成管腔,形成新的淋巴管。近年来发现淋巴管内皮祖细胞参与淋巴管新生。淋巴管内皮特异表达Prox-1、podoplanin、VEGFR-3和LYVE-1等,这些因子和受体调控淋巴管新生。VEGF-C/VEGFR-3或VEGF-D/VEGFR-3信号途径在淋巴管新生过程中起着重要作用。VEGF-C、VEGF-D和VEGFR-3可作为基因治疗的靶点,有望治疗淋巴管新生障碍性疾病以及抗移植后免疫排斥和抗肿瘤淋巴管转移。本文主要综述了胚胎发育、先天性淋巴水肿、炎性病变和肿瘤等状态下淋巴管新生的变化及其机制、淋巴管内皮祖细胞参与淋巴管新生的过程、淋巴管内皮细胞特异性转录因子和受体对于淋巴管新生的调控作用。

PEI介导VEGFR-3siRNA转染对VEGF-C诱导LEPCs分化的影响

目的应用聚乙烯亚胺(polyethyleneimine,PEI)介导淋巴管内皮祖细胞(lymphatic endothelial progenitor cells,LEPCs)VEGFR-3基因siRNA,体外沉默LEPCs VEGFR-3基因表达,观察VEGFR-3siRNA对VEGF-C诱导LEPCs分化的影响。方法采用Ficoll法分离人脐血单个核细胞,流式细胞仪、免疫荧光分选并鉴定LEPCs。PEI包裹前期实验抑制效果最好的VEGFR-3siRNA体外转染入LEPCs,荧光显微镜和流式细胞仪检测转染效率。流式细胞仪检测经VEGF-C诱导7天各组LEPCs CD133+细胞所占比例,14天后各组LYVE-1+细胞所占比例。结果 VEGFR-3siRNA成功转染入LEPCs,转染效率30%,与lipofectimine转染效率无差异,VEGFR-3siRNA转染组7天的LEPCs CD133+细胞所占比例明显高于VEGF-C诱导组(P<0.05),而14天后两组之间LYVE-1+细胞所占比例无显著差异(P>0.05)。结论体外经由PEI介导的siRNA能有效的沉默LEPCsVEGFR-3的表达,从而抑制VEGF-C诱导的LEPCs分化。