草鱼miR-1260对鱼淋巴囊肿病毒中国株复制的调控作用

【目的】鉴定草鱼(Ctenopharyngodon idella)miR-1260(cid-miR-1260),分析cid-miR-1260在鱼淋巴囊肿病毒中国株(Lymphocystis disease virus China,LCDV-cn)感染草鱼卵巢细胞系(Grass carp ovary cells,GCO)过程中的时序表达特性,揭示cid-miR-1260对其靶基因znf574和LCDV-cn复制的调控作用。【方法】制备LCDV-cn感染的GCO细胞,通过茎环RT-PCR和测序鉴定cid-miR-1260;采用定量PCR检测cid-miR-1260在LCDV-cn感染GCO过程中的时序表达;应用生物信息学方法预测cid-miR-1260的靶基因,并用双荧光素酶报告基因系统验证靶基因;通过转染cid-miR-1260 mimic和cid-miR-1260 inhibitor使cid-miR-1260过表达和抑制表达,并用定量PCR检测cid-miR-1260、靶基因znf574、LCDV-cn mcp基因的表达;应用Reed-Muench法测定LCDV-cn在GCO细胞中的滴度。【结果】cid-miR-1260与其他已知miR-1260仅有一个碱基差异,且cid-miR-1260在LCDV-cn感染GCO过程中呈先上升后下降的表达变化,72 h时表达量最高(P<0.05);生物信息学分析表明,znf574为cid-miR-1260的靶基因;重组质粒pmirGLO-znf574-WT与cid-miR-1260 mimic共转染后,荧光素酶活性显著降低(P<0.05),证实znf574为cid-miR-1260的靶基因;cid-miR-1260过表达后,靶基因znf574的表达显著下降(P<0.05),LCDV-cn mcp的表达和LCDV-cn在GCO细胞中的滴度显著上升(P<0.05);抑制cid-miR-1260表达后,靶基因znf574的表达量显著上升(P<0.05),LCDV-cn mcp的表达量和LCDV-cn在GCO细胞中的滴度显著下降(P<0.05)。【结论】LCDV-cn感染GCO细胞后,cid-miR-1260的表达显著上调;在LCDV-cn感染中,cid-miR-1260对其靶基因znf574的表达起负调控作用,且cid-miR-1260表达与LCDV-cn的复制呈正相关,起促LCDV-cn感染作用,而锌指蛋白ZNF574具有抗LCDV-cn作用。本研究为淋巴囊肿病的防治提供新的依据和思路。

草鱼miR-218鉴定及其对鱼淋巴囊肿病毒中国株感染的调控作用

【目的】鉴定草鱼(Ctenopharyngodon idella)miR-218(cid-miR-218)家族成员,分析cid-miR-218在鱼淋巴囊肿病毒中国株(LCDV-cn)感染草鱼卵巢细胞系(Grass carp ovary cells,GCO)过程中的表达特性,探索cid-miR-218-5p对LCDV-cn感染的调控作用。【方法】从LCDV-cn感染的GCO细胞中,通过茎环RT-PCR获取cid-miR-218家族成员,并进行测序验证和生物信息学分析;用定量PCR分析cid-miR-218家族在LCDV-cn感染GCO过程中的表达;用生物信息学方法预测cid-miR-218家族的靶基因,并利用双荧光素酶报告基因系统验证cid-miR-218-5p的靶基因;通过转染cid-miR-218-5p mimic和cid-miR-218-5p inhibitor上调和下调cid-miR-218-5p的表达,用定量PCR分析cid-miR-218-5p、靶基因il-10和LCDV-cn mcp基因的表达情况;应用GO和KEGG数据库,对cid-miR-218家族可能参与调控的信号通路进行富集分析。【结果】在LCDV-cn感染GCO过程中,鉴定到cid-miR-218-5p、cid-miR-218a、cid-miR-218b、cid-miR-218b-1和cid-miR-218b-2等5个cid-miR-218家族成员,其中cid-miR-218-5p的表达呈先升后降再上升的变化趋势,且差异表达最显著(P<0.05);经生物信息学分析预测,cid-miR-218家族成员有较多共同的潜在靶基因,il-10是共有的靶基因。经验证,pmirGLO-il-10重组质粒与家族成员代表cid-miR-218-5p结合后,其荧光素酶活性降低(P<0.05),证明il-10是cid-miR-218-5p的靶基因。cid-miR-218-5p过表达后,il-10与LCDV-cn mcp表达均显著下降(P<0.05),而抑制cid-miR-218-5p表达后,il-10与LCDV-cn mcp表达则显著上升(P<0.05)。预测表明cid-miR-218家族参与调控病毒感染致瘤相关信号通路。【结论】在LCDV-cn感染GCO过程中,cid-miR-218家族中cid-miR-218-5p起重要调控作用;cid-miR-218-5p负调控其靶基因il-10的表达,并负调控LCDV-cn mcp基因的表达;cid-miR-218-5p和IL-10对鱼淋巴囊肿病诊断和防控有潜在的临床应用价值。

牙鲆淋巴囊肿病毒的病原性与免疫原性

用病牙鲆体表肿瘤纯化的病毒 ,对健康牙鲆进行人工感染实验。感染 6 0天后 ,供试牙鲆再现了自然发病鱼的症状。该结果证明 ,从病鱼囊肿物中纯化的病毒 ,确系引发淋巴囊肿病的病原。免疫学实验显示 ,淋巴囊肿病毒使被感染鱼产生了抗体IgM。在实验期间内 ,IgM随着时间的延长而增加。

利用牙鲆鳃细胞系分离和培养淋巴囊肿病毒

本文利用牙鲆鳃细胞系进行了养殖牙鲆淋巴囊肿病毒的分离及培养 ,并通过电镜对培养细胞中淋巴囊肿病毒的形态及感染循环进行了初步研究。将病鱼的淋巴囊肿组织无菌滤液接种牙鲆细胞系 ,细胞出现了明显的细胞病变 ( Cytopathic effect,CPE)。电镜观察在培养细胞的胞质中有病毒的包涵体 ,胞质中散在 6角形、5角形或圆形的病毒粒子 ,大小为 10 0～ 140 nm之间。在感染细胞的线粒体中也存在大量的病毒颗粒。

应用免疫技术检测牙鲆组织内的淋巴囊肿病毒

应用免疫荧光抗体技术(IFAT)和标记链亲和素-生物素(LSAB)免疫组化法对患淋巴囊肿病牙鲆(Paralichthys olivaceus的肝、脾、肾、胃、幽门、肠、心脏、性腺、鳃、表皮10种组织进行了检测，结果发现体表有囊肿症状病鱼的胃、肠、鳃和表皮组织内有淋巴囊肿病毒存在；体表未见囊肿症状病鱼的胃、肠和表皮组织内也检测到了病毒，说明这两种免疫技术可以应用于牙鲆淋巴囊肿病的检测与诊断。同时本文还对淋巴囊肿病毒通过消化道感染的可能进行了探讨。

牙鲆(Paralichthys olivaceus)淋巴囊肿病毒的分离

通过不同的样品处理和离心方法 ,发现了影响淋巴囊肿病毒 (LCDV)得率和纯度的因子 ,通过消除该因子并结合计算机软件设计程序 ,建立了高纯度LCDV的快速分离技术。

淋巴囊肿病毒实时定量PCR检测方法的建立和应用

选取淋巴囊肿病毒(Lymphocystis disease virus,LCDV)主衣壳蛋白(MCP)基因保守序列,利用Primer Express2.0软件设计引物,通过优化反应条件,建立了SYBR GreenⅠ实时定量PCR的检测方法,并进行了敏感性、特异性分析。SYBR GreenⅠ实时定量PCR反应体系的最佳引物浓度为0.5μmol/L,方法的检测限为30个病毒拷贝,扩增产物的Tm值为74.5℃。该方法对淋巴囊肿病毒有特异性,不能扩增流行性造血器官坏死病毒(EHNV)、虎纹蛙病毒(TFV)、蛙虹彩病毒(BIV)、新加坡石斑虹彩病毒(SGIV)、鳜鱼传染性脾肾坏死病毒(ISKNV)及真鲷虹彩病毒(RSIV)。对12份发病牙鲆鱼样品进行检测,均感染淋巴囊肿病毒;20份无临床症状的牙鲆经检测不含淋巴囊肿病毒。建立的LCDV的SYBR GreenⅠ实时定量PCR方法,具有成本低、特异、灵敏、快速等优点,可用于淋巴囊肿病毒的早期诊断。

应用单克隆抗体检测牙鲆血清中抗淋巴囊肿病毒的特异性抗体

应用杂交瘤单克隆抗体技术制备10株分泌抗牙鲆免疫球蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞。利用单抗2H4,通过间接酶联免疫法(ELISA)对牙鲆血清中抗淋巴囊肿病毒(LCDV)特异性抗体进行了检测。结果表明:无外观症状的牙鲆血清中特异性抗体水平很低(平均OD值为0.092),个别鱼体偏高,证明已感染LCDV,处于潜伏期;患淋巴囊肿病且症状显现的牙鲆血清中特异性抗体水平升高(平均OD值为0.165),患淋巴囊肿病后处于恢复期的牙鲆抗体水平最高(平均OD值为0.231);健康牙鲆接种LCDV灭活疫苗后,特异性抗体水平显著升高。

胶原酶消化法纯化牙鲆淋巴囊肿病毒（Lymphosystis Disease Virus China，LCDV-cn）

先后采用各种胶原酶和疏水性制剂，消化、水解病鱼囊肿细胞中带状包涵体外围的胶原蛋白和糖蛋白。经过设计蔗糖密度梯度离心条件，成功分离出了大量的LCDV-cn粒子，并最终建立起一套较完备的、分离纯化LCDV-cn的方法。

淋巴囊肿病毒环介导等温扩增检测方法的建立与应用

根据淋巴囊肿病毒的主要衣壳蛋白(major capsid protein,MCP)基因保守序列,利用PrimerExplorer 3软件设计了5条引物,对LAMP反应温度和反应时间等参数进行了优化。与流行性造血器官坏死病毒、虎纹蛙病毒、蛙虹彩病毒、新加坡石斑虹彩病毒、鳜传染性脾肾坏死病毒、真鲷虹彩病毒等其它虹彩病毒及对虾白斑综合症病毒都没有交叉反应。将LAMP检测方法与常规PCR进行灵敏度的比较分析,结果显示LAMP的检测灵敏度约为15 fg,比常规PCR灵敏度高一个数量级。该方法检测时间短,在1 h内即可完成检测。用建立的LAMP方法对临床鱼样进行了检测,结果表明12尾外观有淋巴囊肿病症状的牙鲆样品中都含有淋巴囊肿病毒,而10尾外观正常牙鲆鱼苗则没有检测到淋巴囊肿病毒(与预期结果一致),说明LAMP方法比较适合淋巴囊肿病毒的早期及现场诊断。

抗牙鲆淋巴囊肿病毒单克隆抗体的制备

用本实验室分离纯化的淋巴囊肿病毒(Lymphosystis Disease Virus China，LCDVcn)作为抗原，感染BALB／c小鼠，取被免疫小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞(Sp2／0融合；ELISA法检测、筛选阳性克隆，经过3次克隆化，首次成功获得18株抗牙鲆淋巴囊肿病毒的单克隆抗体。

鱼类淋巴囊肿病毒靶器官的组织病理研究

探讨病毒传播途径，运用组织病理学技术，对患淋巴囊肿病毒病的牙鲆和鲈鱼的组织进行显微观察，并对病毒感染的靶器官进行了研究。结果表明，在牙鲆体表皮下结缔组织中，当大量成纤维细胞膨大、变圆，大小为10～18μm时，细胞膜外未出现囊壁，少数细胞的细胞质中观察到嗜碱性物质；18～20μm的膨大细胞在细胞膜外出现囊壁，细胞质内出现嗜碱性物质；〉20μm的细胞具有了淋巴囊肿细胞的典型特征。另外，在牙鲆鳃、肠上皮下结缔组织和粘膜下层中，脾、头肾边缘组织和表面系膜、肝表面系膜，以及鲈鱼的鳃等部位均观察到淋巴囊肿细胞，并在牙鲆和鲈鱼脾内观察到膨大细胞。因此，淋巴囊肿病毒的靶器官主要是鱼体表皮下结缔组织，其次是鳃、体腔膜、肠、脾和头肾。鱼体表皮下结缔组织是淋巴囊肿病毒病的检测、检疫和早期诊断的最佳样品。

淋巴囊肿病毒中国分离株基因组序列和结构分析

LCDV-cn是分离自中国养殖牙鲆的淋巴囊肿病病原,给中国牙鲆养殖业带来了严重危害。通过PCR、克隆和测序,获得了LCDV-cn部分基因的序列,证明LCDV-cn与LCDV-C的基因组序列是一致的。比较基因组学分析发现,LCDV-cn基因组中有137个ORF是其独有的、与LCDV-1及其它虹彩病毒无同源区域。对LCDV-cn基因组进行生物信息学分析发现,在LCDV-cn独有的ORF中,有的编码与宿主同源的蛋白,有的编码与DNA复制相关的蛋白,某些ORF编码的蛋白含有跨膜区等。LCDV-cn的独有基因或许对其毒力和宿主范围有关。

军曹鱼淋巴囊肿病毒主衣壳蛋白基因全序列分析

The major capsid protein of lymphocystis disease virus isolated from Rachycentron canadum(LCDV-rc) was amplified and analysed.The 457bp DNA core fragment was amplified with the degenerate primers designed according to the conserved sequences of MCP gene of iridoviruses,then the flaking sequences adjacent to the core region were amplified by inverse PCR,and the complete sequence was obtained by combining all of them.The open reading frame of the gene is 1380bp in length,encoding a putative protein of 459 aa with molecular weight 51.12 kD and pI 6.87.Constructing the phylogenetic tree for comparing the MCP amino acid of iridoviruses,the results indicated that LCDV-rc is most homologous to the other Lymphocystis viruses and all of them constitute a branch.Accordingly LCDV-rc is identified as Lymphocystivirus.

军曹鱼淋巴囊肿病毒的系统关系研究及基因型分析

从患淋巴囊肿病的养殖军曹鱼肿瘤中分离到一种虹彩病毒,命名为淋巴囊肿病毒军曹鱼分离株（LCDV-rc）。为探讨LCDV-rc的系统地位,从DNA水平上分析了该病毒株与淋巴囊肿病毒中国牙鲆分离株（LCDV-cn）、淋巴囊肿病毒韩国鲈鱼分离株（LCDV-sb）、淋巴囊肿病毒日本牙鲆分离株（LCDV-jf）、淋巴囊肿病毒欧洲分离株（LCDV-1）和淋巴囊肿病毒日本岩鱼分离株（LCDV-rf）的系统关系。以核衣壳蛋白（MCP）基因为分子标记,通过PCR扩增和克隆测序获得了长度为1356bp的含178个信息位点的mcp基因序列;用最大简约法、最大似然法、邻接法和Bayesian法构建了分子系统树并进行了置信度检验。结果表明,构建的淋巴囊肿病毒ML、NJ、MP和Bayesian系统树的拓扑结构一致,LCDV-rc和LCDV-sb聚为一支,LCDV-cn和LCDV-jf聚为一支,LCDV-1和LCDV-rf分别各为一支。在35种虹彩病毒的系统关系分析中,LCDV-rc与另5株淋巴囊肿病毒在系统树上聚为一大支,说明LCDV-rc与淋巴囊肿病毒的关系近于其他虹彩病毒。根据遗传距离和系统关系分析认为,LCDV-rc属于一种新的基因型,称其为淋巴囊肿病毒Ⅳ型基因型。

淋巴囊肿病毒结构蛋白及其抗原性分析

病鱼为威海水产养殖场感染淋巴囊肿病的牙鲆（Paralichthys olivaceus）,收集病鱼的囊肿组织,匀浆破碎,采用差速离心和蔗糖密度梯度离心方法,分离纯化淋巴囊肿病毒粒子.负染后,电镜观察证实获得的病毒纯度高,杂质极少,病毒粒子呈近似于圆形的多角形,结构完整.纯化的淋巴囊肿病毒粒子经SDS-PAGE,硝酸银染色后,电泳图谱清晰显示病毒结构蛋白带共有22条,且分子量主要集中在123～26 kD.应用Western blotting法分析病毒结构蛋白的抗原性,结果显示,分子量分别为123.55 kD、65.292 kD和54.438 kD的3条蛋白带发生了免疫反应,其中分子量为65.292 kD的蛋白带反应强度明显高于其他2条蛋白带.本研究旨为确定淋巴囊肿病毒主要衣壳蛋白提供基础依据.[中国水产科学,2006,13（3）：415-420]

牙鲆抗淋巴囊肿病毒免疫球蛋白的纯化

采用饱和硫酸铵沉淀、DEAE 52纤维素离子交换柱层析和Sepharose 6B凝胶过滤的方法 ,首次得到了纯化的牙鲆抗淋巴囊肿病毒IgM。该IgM的重链与轻链分子量分别为 74KD和 2 2KD。

淋巴囊肿病毒核酸疫苗在牙鲆体内的表达及免疫效果评价

将本试验室得到的牙鲆淋巴囊肿病毒（LCDV-cn）衣壳蛋白0.6kb片段重组质粒pEGFP-N2-LCDV-cn MCP0.6肌注入牙鲆体内,荧光显微观察及特异性RT-PCR检测其在牙鲆组织内的表达,并进一步测定牙鲆外周血、肠、脾脏、前肾的淋巴细胞增殖反应、呼吸爆发活性及抗体产生水平.研究结果表明, pEGFP-N2-LCDV-cn MCP 0.6可分布于牙鲆各组织内,并在一定时间内持续表达;免疫学检测表明,该重组质粒诱导了牙鲆特异性体液免疫和细胞免疫.本试验成果为淋巴囊肿病毒核酸疫苗的生产应用和产业化提供了重要的理论依据.

牙鲆淋巴囊肿病毒一抗原蛋白的确认及定位

以牙鲆淋巴囊肿病毒(LCDV)为抗原免疫Balb/c小鼠,而后将小鼠脾细胞与P3U1骨髓瘤细胞融合,以囊肿组织冰冻切片的免疫荧光染色筛选杂交瘤细胞,阳性结果显示特异性块状荧光信号集中在囊肿细胞的细胞质边缘部分,且多个荧光信号相连呈现链圈状,有限稀释法克隆阳性杂交瘤细胞,三次克隆后获得4株稳定产生抗LCDV抗体的单克隆杂交瘤细胞株(1A8、1D72、B6、2D11)。应用Western blotting法分析单抗识别蛋白的分子量,结果显示,单抗1D7和2B6均能特异性结合一条分子量116kD病毒多肽;应用免疫电镜技术定位单抗识别的抗原决定簇,结果发现胶体金颗粒集中吸附在病毒粒子衣壳周围,且背景清洁,无散在的金颗粒或其他污染物。实验结果说明分子量约为116kD的蛋白多肽为LCDV病毒衣壳蛋白,且具有线性抗原决定簇。

淋巴囊肿病毒mcp基因变异特征及其基因型分析

淋巴囊肿病毒是引起多种海、淡水鱼淋巴囊肿病的病原,且不同淋巴囊肿病毒分离株间存在一定的差异。本文对25株淋巴囊肿病毒分离株mcp基因的变异特征进行分析,结果表明:分离自同一宿主的淋巴囊肿病毒mcp基因序列并非完全一致,有些同宿主分离株间存在着较少的变异,其MCP蛋白序列间的变异位点多位于不规则结构域、属于非蛋白相互作用位点;分属不同基因型淋巴囊肿病毒分离株MCP蛋白序列间的变异位点也多位于不规则结构域,变异位点为蛋白相互作用位点的比率仅占21.98%。金头鲷淋巴囊肿病毒分离株LCDV-sa是一种新的淋巴囊肿病毒基因型,此25株淋巴囊肿病毒可分为7个基因型。对淋巴囊肿病毒变异的研究,可加深对其感染机制的认识,有助于了解其传播途径,可为淋巴囊肿病的防控提供重要的理论依据。