mTORC1在EB病毒LMP1促进DLBCL细胞母细胞化的机制研究

目的:研究通过mTORC1通路EB病毒LMP1诱导弥漫大B细胞淋巴瘤(DLBCL)细胞母细胞化的可能机制。方法:采用Western blot法分析EBV+及EBV-DLBCL细胞株LMP1蛋白、CD38的表达及p70S6K磷酸化情况。构建过表达LMP1稳转株及RNAi沉默LMP1基因,用RT-qPCR验证基因表达,并利用Western blot法检测各组细胞LMP1蛋白、CD38的表达量及较EBV-p70S6K磷酸化水平。结果:相较于EBV-DLBCL细胞,LMP1蛋白在EBV+DLBCL细胞上表达(P=0.0008),EBV+DLBCL细胞p70S6K磷酸化水平更高(P=0.0072)及CD38的表达量更高(P=0.0091)。与空载组对比,LMP1OE组的LMP1蛋白表达及CD38表达量均增高(P=0.0353;P<0.0001),且p70S6K磷酸化水平增高(P=0.0065);并验证了LMP1 mRNA表达(P<0.0001)。较si-NC组,LMP1KO组不表达LMP1蛋白(P=0.0129),且p70S6K磷酸化消失(P=0.0228);同时,CD38表达量减少,但无显著性差异(P=0.2377)。结论:LMP1通过活化mTORC1通路促进DLBCL细胞浆母细胞化。

microRNA-185下调AKT1信号通路对淋巴母细胞淋巴瘤细胞增殖和凋亡的影响及相关的分子机制的研究

目的探讨miR-185对淋巴母细胞淋巴瘤(T-LBL)细胞增殖和致肿瘤性的影响及相关的分子机制。方法 q PCR检测人T-LBL组织和正常的胸腺组织中miR-185表达水平。miR-185模拟物及NC-miRNA转染Jurkat细胞,MTT法测定细胞增殖情况,q PCR和MTT法分别检测miR-185表达水平和细胞增殖情况,细胞流失术检测细胞凋亡。生物信息学软件Target Scan预测miR-185的靶作用位点,并通过q PCR、Western blot和荧光素酶活性实验证实miR-185的靶作用位点。慢病毒介导的miR-185过表达Jurkat细胞分别通过皮下注射的方式注射入裸鼠左右侧,皮下注射后4 d、8 d、12 d、16 d、20 d、24 d、28 d、32 d分别测量肿瘤体积,以探讨miR-185对体内肿瘤生长的影响。结果与人正常胸腺组织相比,T-LBL组织中miR-185表达显著下调(P<0.05);MTT检测细胞增殖结果表明,与NCmiRNA转染组相比,miR-185转染组Jurkat细胞增殖速率显著下降(P<0.05),且转染miR-185后,Jurkat细胞凋亡比例显著升高(P<0.05);Target Scan生物学软件预测表明AKT1为miR-185潜在的靶基因,实验结果进一步证实AKT1的3'非翻译序列(3'UTR)是miR-185的直接靶点;裸鼠移植瘤试验结果表明,miR-185能抑制体内肿瘤生长。结论miR-185通过靶向作用于AKT1基因抑制Jurkat细胞增殖,其可能为T-LBL的临床治疗提供新的靶标。

重组腺病毒载体介导共刺激分子B7.1基因对儿童肝母细胞瘤体外淋巴细胞增值的影响

目的研究含hB7-1基因的重组腺病毒载体对儿童肝母细胞瘤体外淋巴细胞增值的影响。方法以腺病毒为载体,将hB7-1基因转入HepG2细胞,以FCM检测HepG2和HepG2/hB7-1细胞表面B7-1分子的表达情况。观察HepG2和HepG2/hB7-1细胞的生长曲线。用混合淋巴细胞培养法检测瘤苗对T淋巴细胞增殖的影响。结果HepG2细胞表面B7-1分子表达水平低,其阳性率为1.1%。而HepG2/hB7-1的B7-1分子表达阳性率达到18.5%,B7-1基因的表达水平提高16.8倍。HepG2和HepG2/BB-102的生长曲线相比,后者生长曲线上升减缓,生长速度减慢。B7-1分子的表达促进了淋巴细胞的增殖,较对照组有显著性差异(P<0.05)。结论1.HepG2表面B7-1分子低水平表达是其弱免疫原性的主要原因。2.含hB7-1基因的重组腺病毒载体转染HepG2可以获得B7-1分子高表达的细胞株。3.重组腺病毒载体的转染可以降低肝母细胞瘤细胞的恶性表征。4.转染含hB7-1基因的瘤苗可以促进T淋巴细胞的增殖。

miRNA-106a在人淋巴瘤Jurkat细胞中的表达及作用机制

目的探讨miRNA-106a在人淋巴瘤Jurkat细胞中的表达及作用机制。方法取对数生长期人淋巴瘤Jurkat细胞,分别向培养基中加入5 ml生理盐水配制的浓度为0、0.5、1.0、1.5μg/ml的多柔比星,取健康体检者(对照组)的单个核细胞。采用定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)检测miRNA-106a以及视网膜母细胞瘤1(RB1)、E2F转录因子1(E2F1)、胱天蛋白酶3(caspase 3)mRNA的表达水平,采用噻唑蓝(MTT)法检测细胞增殖能力,流式细胞术检测细胞凋亡能力,采用蛋白质印迹法(Western blot)检测RB1、E2F1、caspase 3蛋白的表达水平。结果0μg/ml多柔比星干预人淋巴瘤Jurkat细胞miRNA-106a的表达水平明显高于对照组单个核细胞(P﹤0.01)。随多柔比星浓度升高、作用时间延长,miRNA-106a表达水平逐渐降低,光密度(OD)值逐渐降低,细胞增殖抑制率(IR)和凋亡率均逐渐升高,RB1、caspase 3 mRNA及其蛋白的表达水平均逐渐升高,E2F1 mRNA及其蛋白的表达水平均逐渐降低,差异均有统计学意义(P﹤0.05)。相关性分析结果显示,miRNA-106a与RB1、caspase 3的表达均呈负相关(P﹤0.01),与E2F1的表达呈正相关(P﹤0.01)。结论miRNA-106a在人淋巴瘤Jurkat细胞中高表达,其可能通过调控RB/E2F1通路相关蛋白的表达来调节淋巴瘤进展。

T淋巴母细胞淋巴瘤/白血病患者PDL1蛋白/mRNA表达及其与临床病理参数和预后的关系

目的分析程序性死亡配体1(PDL1)蛋白及其mRNA在T淋巴母细胞淋巴瘤/白血病(T-LBL/ALL)患者中的表达及其与临床病理参数和预后的关系。方法收集2016年1月-2018年12月江苏省人民医院血液内科三病区T-LBL/ALL患者50例(T-LBL/ALL组)的病变组织存档蜡块,另选择35例淋巴结反应性增生(LH)患者(LH组)存档蜡块作为对照,将2组蜡块均制成组织芯片,采用免疫组化法检测PDL1蛋白表达水平,采用实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)检测PDL1 mRNA表达量,分析其与患者临床病理参数和预后的关系。结果T-LBL/ALL组PDL1蛋白表达阳性率高于LH组(χ^2=7.824,P=0.005),PDL1 mRNA表达量高于LH组(t=14.010,P=0.000)。有骨髓侵犯、IPI评分>2分的T-LBL/ALL患者PDL1蛋白表达阳性率和PDL1 mRNA表达量明显较高(χ^2/P=5.133/0.023、5.773/0.016,t/P=3.707/0.001、2.564/0.014)。Kaplan-Meier生存分析显示,PDL1蛋白表达阳性患者总生存时间短于PDL1蛋白表达阴性患者(log-rank=9.761,P=0.002)。相关性分析显示,PDL1 mRNA表达量与T-LBL/ALL总生存时间呈负相关(r=-0.718,P=0.000)。结论 PDL1蛋白及其mRNA在T-LBL/ALL患者中呈高表达,且与肿瘤进展及预后存在关联。

羧甲基-β-1,3-葡聚糖对人B淋巴母细胞的辐射防护作用

利用X射线辐照经羧甲基-β-1,3-葡聚糖预处理的人B淋巴母细胞(Human B lymphoblasts,HMy2.CIR),探究羧甲基-β-1,3-葡聚糖对辐射损伤的防护作用。采用CCK-8法检测细胞存活率,并筛选出最佳给药浓度和孵育时间(0.1μg/mL,72 h);流式细胞仪检测羧甲基-β-1,3-葡聚糖对辐照后HMy2.CIR细胞凋亡的影响;微核实验检测羧甲基-β-1,3-葡聚糖对辐照后HMy2.CIR细胞微核形成的影响;彗星实验检测对DNA损伤程度和修复的影响。结果表明,羧甲基-β-1,3-葡聚糖对HMy2.CIR无细胞毒性并具有增殖促进作用;羧甲基-β-1,3-葡聚糖能够抑制辐射造成的凋亡率和微核率的增加,降低DNA损伤程度,加快损伤DNA的修复。羧甲基-β-1,3-葡聚糖对HMy2.CIR细胞辐射损伤有防护作用,其机制可能与抑制辐射诱导的细胞凋亡和DNA损伤有关。

HIV-1感染对人CD4^+T淋巴母细胞内ITAMs/ITIMs通路的影响

目的探讨感染人免疫缺陷病毒1(HIV-1)后人CD4^+T淋巴母细胞(M8166细胞)内免疫受体酪氨酸激活基序(ITAMs)/免疫受体酪氨酸抑制基序(ITIMs)通路的变化。方法体外培养M8166细胞,随机分为空白组及感染组。空白组常规培养,感染组则以10 TCID50 HIV-1进行感染。用RT-PCR技术检测ITAMs/ITIMs信号通路相关受体基因的表达,以Western blotting法检测ITAMs/ITIMs信号通路相关受体蛋白及磷酸化蛋白的表达。结果与空白组比较,病毒组SHP-1 mRNA相对表达量高(P<0.01),SHIP1 mRNA低,但差异无统计学意义(P>0.05);两组SHP-2、SHIP2、Zap70、Syk mRNA相对表达量比较差异无统计学意义(P均>0.05)。与空白组比较,感染组SHP-1、p-SHP-1蛋白相对表达量高(P均<0.05),SHIP1、p-SHIP1蛋白相对表达量低(P均<0.05),Syk蛋白相对表达量高、p-Syk蛋白相对表达量低,但差异均无统计学意义(P均>0.05);两组SHP-2、SHIP2、p-SHIP2蛋白相对表达量比较差异无统计学意义(P均>0.05);两组均未见p-SHP2、Zap70、p-Zap70蛋白表达。结论 M8166细胞感染HIV-1后,其ITAMs/ITIMs信号通路被部分激活。

儿童颞骨乳突B淋巴母细胞淋巴瘤1例

1临床资料患儿,男,9岁,主因间断右侧口角歪斜1月余,加重伴耳痛3天于2019-05-28入院。患儿入院前1月余无明显诱因间断出现右侧口角歪斜,伴右眼偏斜,偶伴右耳疼痛,每次持续约20~100 min,可自行恢复正常,病情间断反复发作,无发热、头痛、头晕及眩晕,无张口受限,无耳溢液及听力下降,曾就诊于神经内科,诊断不详,予营养神经等治疗后病情无缓解。入院前3天患儿无明显诱因口角歪斜呈持续性,伴右侧耳痛,门诊考虑“右侧周围性面神经麻痹待查;右侧中耳乳突炎”收治入院。患儿既往体健,家族中无遗传性疾病史。专科查体:右侧额纹消失,右眼闭合不全,无溢泪,右侧鼻唇沟变浅,口角对称,张口时口角左偏,伸舌无偏斜;双侧耳廓无畸形,右侧外耳道变窄、后壁肿胀,鼓膜不能窥及;右侧乳突区压痛;鼓腮漏气;左耳(-)。面神经检测未见异常。颞骨CT示右侧中耳鼓室及乳突小房渗出性病变,未见骨质破坏(图1A)。

NY-ESO-1致敏树突状细胞诱导的细胞毒性T淋巴细胞对视网膜母细胞瘤细胞的特异性

背景目前用细胞免疫的方法治疗视网膜母细胞瘤（RB）成为新的研究热点，肿瘤-睾丸抗原是最具免疫原性的人类肿瘤抗原之一，已用于全身一些肿瘤的免疫治疗，但其对RB治疗作用的研究报道较少。目的探讨肿瘤-睾丸抗原的NewYork—esophageal-1（NY—ESO-1）致敏树突状细胞（DCs）诱导特异性细胞毒性T淋巴细胞（CTL）对RB细胞株HXO—RB44的杀伤作用。方法用聚合酶链反应（PCR）技术对NY—ESO-1质粒的目的基因片段进行扩增，使用SalⅠ限制酶和EcoRI限制酶进行双酶切，切胶回收DNA片段。将其连接入pDC316质粒，构建pDC316／NY—ESO．1真核表达载体并再进行酶切鉴定。免疫荧光及Western blot法检测NY—ESO-1蛋白在HXO．RB44细胞株中的表达。Ficoll法分离血获得单个核细胞，通过RPMI1640重悬，调整细胞密度为1×10。个／ml，通过重组人集落刺激因子（rhGM—CSF）和重组人白细胞介素4（rhlL-4）诱导培养外周血来源的DCs，通过重组质粒转染DCs，以脂多糖诱导DCs成熟，DCs与淋巴细胞数量比为1：25的比例混合培养HXO．RB44细胞，通过MTT法检测CTL的增生情况。在培养液中同时加入CTL细胞，MTT法检测HXO—RB44细胞的活力。结果重组质粒pDC316／NY—ESO-1的目的片段序列与NY-ESO-J基因序列完全相同，酶切鉴定结果与预期一致。Western blot法以及免疫荧光检测结果显示，NY—ESO．1在细胞株HXO．RB44中呈强阳性表达。经rhGM．CSF和rhlL-4成功诱导出的外周血DCs，重组质粒转染后其表型分子分别是HLA—DR为42．1％，CD80为54．2％，CD83为39．7％，CD86为94．8％。MTT法检测表明，pDC316／NY—ESO-1质粒转染的DCs诱导的CTL组的增生能力强于未转染组，致敏的DCs与淋巴细胞比例为1：100时诱导CTL效果最为显著，与未转染组比较差异有统计学意义（P〈0．05），CTL对肿瘤细胞的杀伤作用明显强于未转染组和无DCs组，且效靶比为75：1时杀伤率最强，差异有统计学意义（P〈0．05）。结论NY—ESO-1质粒转染DCs诱导的CTL对RB细胞具有特异性杀伤作用，为RB免疫治疗提供了一种新的方法。

分子遗传学和表观遗传学异常在T淋巴母细胞淋巴瘤/白血病中的预后价值的研究进展

T淋巴母细胞淋巴瘤/白血病(T-LBL/L)侵袭性强和基因突变等分子遗传学异常发生率高。NOTCH1/FBXW7突变是最常见的一种基因突变,在T-LBL/ALL中与良好的预后相关;PTEN突变是不良预后因素,在儿童患者中能够一定程度地被NOTCH1突变克服。发生MLL基因异常和6号染色体杂合性缺失的患者,其预后差于核型正常患者。早期前体T淋巴细胞白血病中MLL基因异常、RUNX1突变和DNMT3A突变发生率高于其他成熟亚型,可以作为危险度分层的指标。表观遗传学异常在造血干细胞的恶性改变中起着重要作用,针对表观遗传学的治疗如去甲基化药物或者能够改善高危患者的预后。本文就NOTCH1/FBXW7/PTEN/RAS基因突变与预后,分子和细胞学异常与预后,以及表观遗传学与预后关系进行综述。

小儿肾母细胞瘤Th1/Th2类细胞因子的漂移及临床意义

采用逆转录聚合酶链反应 (RT- PCR)技术 ,检测正常儿及肾母细胞瘤患儿肿瘤组织、手术前后外周血Th1/ Th2类细胞因子的基因表达 ,观察肾母细胞瘤患儿手术前后 Th1/ Th2类细胞因子的表达和漂移情况。结果显示肾母细胞瘤患儿外周血、肿瘤组织均出现明显的 Th2类细胞因子偏移趋势 ,手术和化疗可促进 Th1/ Th2平衡向 Th1漂移。肾母细胞瘤患儿体内 Th2类细胞因子的强势表达 ,可能与肾母细胞瘤的发生发展有关 ;Th1/ Th2平衡漂移是观察机体抗肿瘤免疫动态变化的良好指标。

肾母细胞瘤免疫治疗中的细胞毒T淋巴细胞效应

目的用肾母细胞瘤WT1基因一段序列(WT1y)构建于真核表达质粒pCDNA3.1(+),通过小鼠和体外细胞模型初步研究所激发的细胞毒T淋巴细胞(CTL)效应。方法WT1基因一段序列,含HLA-A*2402锚定残基的9个氨基酸。构建重组真核表达质粒pCDNA3.1(+)/WT1y。免疫Balb/c小鼠,ELISA方法检测体液免疫反应;分离脾淋巴细胞,FCM检测脾淋巴细胞中CD4/CD8。结果重组质粒测序鉴定,与GenBank中登录的序列完全一致;免疫组小鼠T淋巴细胞增殖及CTL活性均明显优于对照组(p0.01);体外具有较强溶解靶细胞的功能。结论WT1基因的DNA疫苗具有很强的CTL效应,为小儿肾母细胞瘤的治疗提供了新的思路。

γ-射线诱发的人AHH—1淋巴细胞凋亡及其机制研究

研究γ-射线诱发的人AHH-1淋巴细胞凋亡规律和发生机制,用MGG、TUNEL染色,MTT、免疫组化和电镜观察,经0、3、6、9、12、15、20Gy γ-射线照射后,AHH-1淋巴细胞凋亡、活存率以及Bax、Bel-2、Bel-xl等凋亡相关蛋白表达的变化。结果(1)3—12Gy照射范围内,凋亡是AHH-1细胞死亡的主要方式,且6-12Gy范围内呈现较好的量效关系;(2)15-20Gy照射后,凋亡率下降,推测此时除凋亡外,坏死也是AHH-1细胞死亡的主要途径;(3)不同剂量照射后,AHH-1细胞凋亡率在24h达到高峰;3-12Gy照射范围内,细胞活存率随照射剂量的增加而下降,15-20Gy照射后,下降趋势趋于平缓。结论认为一定剂量γ-射线照射可诱发人AHH-1淋巴细胞出现大量凋亡,且在一定范围内呈现较好的量效关系。

PD-1、PD-L1、肿瘤浸润淋巴细胞在神经母细胞瘤组织中的表达

目的探讨程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)、程序性细胞死亡配体1(PD-L1)、肿瘤浸润淋巴细胞在神经母细胞瘤中的表达及与患者临床病理特征之间的关系。方法选取2000年1月至2022年6月山西省儿童医院58例接受手术切除的神经母细胞瘤患者的术后肿瘤组织,免疫组化法检测PD-1在肿瘤中淋巴细胞的表达及PD-L1在肿瘤细胞中的表达情况,同时检测CD3^(+)、CD4^(+)、CD8^(+)T淋巴细胞密度,分析PD-1、PD-L1的表达和不同亚群T淋巴细胞密度与临床病理特征的关系。结果PD-1和PD-L1蛋白的阳性表达率分别为44.8%和43.1%。PD-L1的表达在INSS分期、INRGSS分期、病理类型及分化类型中肿瘤细胞差异有统计学差异(P<0.05)。PD-1表达在肿瘤发生部位、INSS分期及INRGSS分期中差异有统计学意义(P<0.05)。PD-1与PD-L1的表达具有相关性(r=0.318,P=0.011)。肿瘤浸润淋巴细胞密度在INSS分期及INRGSS分期中差异有统计学意义(P<0.05)。CD3^(+)T细胞巢周表达、CD3^(+)T细胞巢内表达及CD8^(+)T细胞巢周表达与PD-1表达均有相关性(r=0.265、0.287、0.309,P<0.05)。结论神经母细胞瘤高表达PD-L1预示更差的预后,肿瘤浸润T淋巴细胞可能参与了PD-1表达的调控,以PD-1/PD-L1信号通路为靶点的免疫治疗有望成为神经母细胞瘤的潜在治疗靶点。

WT1、NLR及LMR对儿童急性髓系白血病的诊断价值分析

目的探讨WT1、NLR及LMR对儿童急性髓系白血病的诊断价值。方法选取73例AML初诊患儿作为研究组,另外选取同时期门诊体检的健康儿童作为对照组(50例),比较2组的WT1、NLR及LMR水平等差异。结果研究组患儿的NLR水平高于对照组,而LMR则较对照组低(P<0.05);随着危险度增高,AML患儿的NLR及WT1表达水平逐渐升高,而LMR水平逐渐降低(P<0.05);NLR、LMR及WT1检测鉴别为儿童AML分别为55例、59例及56例,联合检测鉴别儿童AML为69例;各指标联合检测对儿童AML鉴别诊断敏感度、特异度及AUC均明显高于NLR、LMR及WT1单独检测(P<0.05)。结论联合检测WT1及NLR、LMR可显著提高儿童AML的诊断率,但仍需进一步加大样本量行深入验证。

小白菊内酯干预骨髓基质细胞对Jurkat细胞黏附作用的影响及其机制研究

目的探讨急性淋巴细胞白血病(ALL)患者骨髓基质细胞(BMSCs)对Jurkat细胞的黏附作用及小白菊内酯(PTL)对此作用的干预机制。方法采集2013年10月—2014年3月于桂林医学院附属医院经FAB分型及MICM分型确诊为ALL并经治疗后缓解的6例患者髂后上棘骨髓液,体外分离培养BMSCs。Jurkat细胞复苏后传代培养,取生长状态良好的细胞用于实验,建立BMSCs与Jurkat细胞共培养模型。设置Jurkat细胞组、BMSCs组、BMSCs+Jurkat细胞组、BMSCs+Jurkat细胞+PTL 4μmol/L组、BMSCs+Jurkat细胞+PTL 8μmol/L组、BMSCs+Jurkat细胞+PTL 12μmol/L组、BMSCs+Jurkat细胞+PTL 16μmol/L组。黏附实验检测共培养24 h和48 h后各组黏附率,ELISA测定各组可溶性血管细胞黏附分子-1(s VCAM-1)表达水平,RT-PCR法检测BMSCs VCAM-1 mRNA的相对表达量。结果各组培养24 h和48 h后,黏附率与PTL浓度呈负相关(r=-0.95、-0.91,P<0.05)。各组s VCAM-1表达水平比较,差异有统计学意义(P<0.05),BMSCs+Jurkat细胞组、BMSCs+Jurkat细胞+PTL 4μmol/L组、BMSCs+Jurkat细胞+PTL 8μmol/L组和BMSCs+Jurkat细胞+PTL 12μmol/L组s VCAM-1表达水平高于BMSCs组(P<0.05),各加入PTL组s VCAM-1表达水平低于BMSCs+Jurkat细胞组(P<0.05),各加入PTL组s VCAM-1表达水平与PTL浓度呈负相关(r=-0.994,P=0.001)。各组BMSCs VCAM-1 mRNA表达水平比较,差异有统计学意义(P<0.05),BMSCs组与BMSCs+Jurkat细胞+PTL 16μmol/L组BMSCs VCAM-1 mRNA表达水平比较,差异无统计学意义(P>0.05)。各加入PTL组BMSCs VCAM-1 mRNA表达水平与PTL浓度呈负相关(r=-0.994,P=0.001)。结论 PTL可以通过降低VCAM-1的表达抑制BMSCs对Jurkat细胞的黏附,减弱骨髓微环境对白血病细胞的保护作用。

柠檬酸和EDTA对cyclinD1和TdT抗原修复的应用比较

目的探讨p H 6.0 Citrate、p H 8.0 Tris/EDTA和p H 9.0 Tris/EDTA三种修复液对恶性淋巴瘤中cyclin D1和Td T抗原修复的比较。方法运用高压抗原修复法,选择三种修复液,比较56例套细胞淋巴瘤cyclin D1和48例淋巴母细胞型淋巴瘤Td T的免疫组化染色效果的比较。结果免疫组化染色采用柠檬酸和EDTA两种修复液相比,56例套细胞淋巴瘤中40例cyclin D1表达强度随着p H值的升高而增强,6例用p H 6.0 Citrate修复后不表达,而用p H 9.0 Tris/EDTA修复后表达;另外48例淋巴母细胞型淋巴瘤中42例Td T表达强度随着p H值的升高而增强,其中4例用p H 6.0 Citrate修复后不表达,而用高p H值EDTA修复后表达。结论对于这两种抗体cyclin D1和Td T来说,以高压热修复,高p H值EDTA抗原修复溶液优于p H6.0 Citrate,提高了恶性淋巴瘤中cyclin D1和Td T抗原表达。