淋巴毒素的研究进展

淋巴毒素(lymphotoxin,LT)是最早发现的细胞因子之一,LT是淋巴细胞受抗原或有丝分裂原等刺激活化后及在某些肿瘤、自身免疫病的情况下产生分泌的一种细胞因子.虽然LT与肿瘤坏死因子α(TNI=α)在分子结构和活性区域上相似,二者的有些生物学活性类似,但是它们的不同之处也是十分明显的:LT特有LTβ及其受体,两种细胞因子对肿瘤细胞的结合能力及体内外杀伤活性也存在差异.近年来,随着LT基因工程产品的成功开发,LT作为抗肿瘤药物的实验研究的不断深入,显示LT也许是一种具有较好疗效的细胞因子.

肿瘤坏死因子α/淋巴毒素α基因多态性与支气管哮喘的关系

肿瘤坏死因子 (tumornecrosisfactor,TNF)在哮喘炎症过程中起重要作用 ,本文探讨了TNFα LTα基因多态性和哮喘遗传易感性及相关表型的关系。采用聚合酶链反应 (PCR) 限制性长度多态性 (RFLP)检测TNFα LTα基因多态性在 12 5名哮喘个体 ,12个哮喘家系成员和 96名无血缘关系的健康对照者间的分布 ;并测定了哮喘患者血清的TIgE ;肺通气功能 ,支气管舒张试验 ,乙酰甲胆碱 (Mch)气道激发试验。TNFα 2 2基因型的频率在哮喘组较健康对照组明显增高 (2 0 8%vs 11 4 % ,P <0 0 5 ) ,优势比 (OR)为 2 2 5 9(95 %CI1 30 1～ 4 94 9) ;等位基因频率TNF2在哮喘组较健康对照组明显增高 (0 4 2vs 0 33,P <0 0 1)。LTα基因的频率在两组间分布无差异。Logistic回归分析显示 :TNFα 2 2基因是哮喘的独立危险因素 (P <0 0 5 ) ,OR值为 0 2 2 6 (95 %CI 0 0 5 5 - 0 92 5 1)。携带TNFα 2 2基因型的患者在吸入 β2激动剂 2 0分钟后 ,FEV1的改善较携带其它基因型的患者差 (2 4 0 9± 19 5 ) %vs [2 9 4 6±2 2 6 0 ) %vs (38 81± 31 5 3) % ,P <0 0 5 ]。家系分析显示 :TNFα基因 LTα基因与哮喘连锁关系不肯定 ,LOD值 <1。TNFα 2 2基因型与哮喘的易感性相关 。

淋巴毒素A基因多态性与慢性阻塞性肺疾病的关系

目的探讨淋巴毒素A(LTA)基因多态性与中国北方汉族人群慢性阻塞性肺疾病(COPD)的遗传易感性和严重程度的关系。方法采用PCR直接测序法检测122例COPD患者与163名健康对照6个LTA基因的标签单核苷酸多态性(tSNP)位点(rs2844482,rs2071590,rs2239704,rs909253,rs2229094,rs1041981)的基因型分布。用χ2检验进行Hardy-Weinberg平衡检验,用非条件logistic回归模型计算比数比(OR)及95%可信区间(CI)。结果LTA基因6个tSNP位点在COPD患者中的基因型分布与正常对照无显著差异,但在COPD患者中,4个tSNP位点(rs2071590、rs2239704、rs909253、rs1041981)在轻度COPD患者与中、重度以上患者的基因型分布中存在显著差异(P<0.05),提示LTA基因的功能性tSNP可能影响COPD患者的严重程度。结论LTA基因多态性与COPD的易感性无关,但与COPD病程进展有关。

注射用重组人淋巴毒素α衍生物Ⅰ期临床耐受性研究

背景与目的:注射用重组人淋巴毒素α衍生物(rhLTα-Da)是我国研制的一全新抗肿瘤生物制品。本研究旨在考察肿瘤患者对rhLTα-Da的耐受性,确定人体的最大耐受剂量(MTD),推荐Ⅱ期临床试验剂量。方法:剂量递增Ⅰ期临床试验。rhLTα-Da剂量分3级,即10μg·(m·2d)-1、20μg·(m·2d)-1和33μg·(m·2d)-1,每剂量组至少有3例患者。将rhLTα-Da溶于5%葡萄糖注射液100ml,静脉恒速滴注30min,每天1次,连续5天。结果:24例患者入组。主要不良反应为发热和寒战,为Ⅰ～Ⅲ度,发生率79.2%(19/24),消炎痛可一定程度减轻寒战和发热,其它不良反应包括呼吸困难(3/24)、恶心呕吐(3/24)、头痛(4/24)、乏力(2/24)、血压下降(2/24)和放疗区皮肤感觉异常(2/24)等,血生化指标未见明显的肝肾功能异常。剂量限制性毒性见于33μg·(m·2d)-1剂量组,表现为1例Ⅲ度寒战,1例Ⅲ度发热,1例Ⅲ度呼吸困难。在本临床研究的剂量范围内,未见rhLTα-Da的明确疗效,但在个别肿瘤患者(恶性黑色素瘤、皮肤蕈样霉菌病和肾癌)中看到部分病变好转。结论:rhLTα-Da的MTD为33μg·(m·2d)-1,推荐Ⅱ期临床试验剂量为20μg·(m2·d)-1。

噬菌体展示重组人淋巴毒素突变体库及受体亲和筛选

淋巴毒素(lymphotoxin,LT) 通过TNFR1受体传递凋亡信号,从而发挥抗肿瘤活性. 对LT的受体结合区域进行多点随机突变,利用噬菌体展示重组人淋巴毒素(rhLT) R46,S106,L130三点随机突变组合文库和S106～F110区域随机突变体库. 噬菌体库与固相化TNFR1受体进行亲和筛选,富集了能与TNFR1受体结合的rhLT突变体. 随机挑选20个单克隆噬菌体进行ELISA受体结合鉴定,其中80%的克隆与TNFR1受体特异性结合,有4个克隆与TNFR1受体的结合能力高于野生型序列的rhLT. 将这4个结合力高的突变体克隆于pET32a(+)载体,经过大肠杆菌表达和纯化操作后,检测这些突变体蛋白与TNFR1受体的结合活性和对L929细胞的杀伤活性,发现3个克隆的受体结合性质与其展示于噬菌体上时基本吻合,其中C199克隆与TNFR1的结合活性比野生型序列的rhLT提高了近30%,且其对L929细胞的杀伤活性提高了近90%. 应用噬菌体展示技术对淋巴毒素进行体外进化研究的尝试,为下一步的蛋白质结构和功能研究提供了思路,可成为大分子药物开发的有效工具.

重组人淋巴毒素随机点突变组合文库的构建

构建重组人淋巴毒素 (rhLT)随机点突变组合文库以进行体外分子进化及结构和功能的研究。应用含随机核苷酸序列的引物 ,通过OverlapPCR的方法分别对rhLT的 4 6、10 6和 130位氨基酸进行定点随机突变 ,获得各单点随机突变体库。通过基因操作将这三个单点随机突变体库拼接并克隆于pMD_18T载体建立三点组合突变体文库 ,DNA测序鉴定突变位点的随机性和多样性 ,原核表达该变异体库 ,体外测定生物学活性。成功获得rhLT三点随机点突变组合文库 ,其转化克隆数达到 1 5× 10 5,是多样性理论值的 4 5倍。 5 0个样品的序列分析显示各个位点的核苷酸和氨基酸序列的突变都呈随机性分布。对原核表达的 30个样品进行生物学活性测定 ,结果 70 % (2 1个 )的样品无活性、2 3 3% (7个 )的样品活性低于rhLT、6 7% (2个 )的样品活性高于rhLT。成功构建了rhLT随机点突变组合文库 ,该库不仅在一级结构上具有良好的随机性和多样性 ,而且具有生物学活性的多样性 ,为应用噬菌体展示等高通量筛选策略对淋巴毒素进行体外分子进化和结构与功能的深入研究打下了基础。

淋巴毒素α基因多态性与心肌梗死关系的Meta分析

目的采用Meta分析系统评价淋巴毒素α(lymphotoxin-α,LTA)基因A252G、C804A多态性与心肌梗死(my-ocardial infarction,MI)的关系。方法检索PubMed和CNKI数据库(2002-2008年)中所有有关上述两种多态与MI相关性的随机病例对照研究,并用Revman4.2软件进行统计分析。结果共纳入9篇符合条件的文献,累计A252G多态研究例数:MI病例15809例、对照9566例;C804A多态研究人数:MI病例16356例、对照9966例。数据合并结果显示,病例与对照之间GG252/(GA252+AA252)基因型的比值比(oddsratio,OR)为1.14,95%CI:0.94-1.38(P=0.19);AA804/(AG804+GG804)基因型的OR=1.06,95%CI:0.85-1.30(P=0.62)。另外,按东西方人群分组后的分析结果也与上述结果一致(P>0.05)。结论LTA基因GG252和AA804基因型不是MI的风险因子。受纳入文献数量的限制,本Meta分析结果尚有待更多高质量的大样本研究予以进一步证实。

淋巴毒素αNcoⅠ、AspHⅠ基因多态性与胃十二指肠疾病幽门螺旋杆菌的感染无关

目的 :研究我国湖北汉族人LTαNcoⅠ、AspHⅠ基因多态性与胃十二指肠疾病幽门螺旋杆菌 (Hp)感染的相关性 ,探讨宿主对Hp感染的易感性。 方法 :采用PCR 限制性片段长度多态性方法 ,检测 1 1 4例 (5 9例慢性胃炎、38例胃十二指肠溃疡以及 1 7例胃癌 )胃十二指肠疾病患者以及 1 6 4例正常对照者的LTαNcoⅠ、AspHⅠ基因型以及基因频率分布。Hp感染通过胃镜快速尿素酶试验、HpAb IgG及1 4 C 呼气试验综合性诊断。结果 :Hp阳性组LTαNcoⅠ、AspHⅠ基因型和等位基因频率与Hp阴性组、正常对照组差异无显著性。此LTα基因多态性与胃十二指肠疾病亦无相关性。结论 :LT(NcoⅠ。

人淋巴毒素基因5′端上游NF－KB类因子特异性结合位点的研究

淋巴毒素（Ｌｙｍｐｈｏｔｏｘｉｎ，ＬＴ）是由活化的Ｔ淋巴细胞分泌的一种糖蛋白。ＬＴ基因的表达调控主要是在转录水平上。ＰＨＡ＋ＰＭＡ诱导的Ｊｕｒｋａｔ细胞总ＲＮＡ点渍杂交发现，Ｊｕｒｋａｔ细胞的内源性ＬＴｍＲＮＡ的数量随诱导时间的延长而增加。凝胶迟滞电泳分析发现，ＰＨＡ＋ＰＭＡ诱导４小时的Ｊｕｒｋａｔ细胞核抽提物形成多种复合物，且在诱导不同时间后有明显变化。系列缺失片段的竞争反应表明，这些复合物的形成与ＬＴ基因５＇端上游──１２８ｂｐ──９３ｂｐ左右的序列相关。ＤＮａｓｅｌ足迹法及其竞争实验发现，ＬＴ基因５＇端上游─—１０４ｂｐ──８３ｂｐ（共２２ｂｐ）序列具有明显的蛋白质保护足迹。同源性分析发现此２２ｂｐ的序列中存在一个ＫＢ样结合位点：─１００ｂｐ──９０ｂｐ（５’－ＧＧＧＧＧＣＴＴＣＣＣ－３’）。ＮＰ－ＫＢ类蛋白质因子参与了此序列的ＤＮＡ－蛋白质的特异性结合，可能存在多种类型的ＮＰ－ＫＢ类蛋白因子参与了ＬＴ基因的表达调控。

淋巴毒素A基因多态性与慢性阻塞性肺疾病并发骨质疏松的关系

目的探讨淋巴毒素A(LTA)基因多态性与北方汉族人群慢性阻塞性肺疾病(COPD)并发症骨质疏松的关系。方法收集2007年6-12月因COPD急性加重收住院治疗的122例COPD患者,在排除慢性肾功能不全以及甲状腺、甲状旁腺等疾病后,最后纳入101例COPD患者作为研究对象。采用双能X线骨密度测定仪测定患者的腰椎及股骨近端骨密度,根据骨密度情况将患者分为骨质疏松组(n=67)和非骨质疏松组(n=34)。以PCR直接测序法检测两组患者的6个LTA基因的tSNP位点(rs2844482,rs2071590,rs2239704,rs909253,rs2229094,rs1041981)的基因型分布,用χ2检验进行Hardy-Weinberg平衡检验,用非条件logistic回归模型计算比值比及95%可信区间,比较两组的差异。结果骨质疏松与非骨质疏松COPD患者LTA基因6个SNP位点的基因型分布频率均无显著性差异(P>0.05)。结论 LTA基因多态性与COPD并发骨质疏松可能无相关性。

淋巴毒素α基因多态性与冠心病

淋巴毒素α(LT-α)是肿瘤坏死因子家族的主要成员,其主要功能是介导炎症免疫反应,从而影响细胞坏死、分化。目前,LT-α的功能、遗传差异及与冠心病的关系已成为当前心血管疾病研究的一个热点。本文阐述了LT-α的生物学特性、功能及LT-α基因多态性与冠心病的关系。

人淋巴毒素cDNA在大肠杆菌表达的研究

目的：在大肠杆菌表达人淋巴毒素ｃＤＮＡ。方法：将本室克隆的人淋巴毒素ｃＤＮＡ亚克隆于原核表达载体ｐＢＶ２２０，温控法诱导重组菌，ＳＤＳＰＡＧＥ和Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｉｎｇ检测和鉴定结果，ＭＴＴ比色法测定重组ＬＴ活性。结果：成功地表达了人淋巴毒素重组蛋白；重组蛋白占细菌总蛋白的１２％，并具有细胞毒活性，活性单位相当于２×１０５Ｕ／Ｌ菌液。结论：为重组ＬＴ的大量生产、临床应用，为进一步研究人ＬＴ的生物学功能奠定了基础。

注射用重组人淋巴毒素α衍生物的临床药代动力学研究

背景与目的:动物实验研究表明重组人淋巴毒素α衍生物(recombinanthumanlymphotoxin-αderivative,rhLTα-Da)具有良好的抗肿瘤、免疫激活和化疗增敏作用,且毒性较低,连续给药在动物体内不蓄积。本研究目的是考察rhLTα-Da在肿瘤患者体内的药代动力学行为,为Ⅱ期临床安全合理用药提供理论依据。方法:根据耐受性试验确定rhLTα-Da人体药代动力学试验低、中、高剂量级分别为10、20、33μg·m-2·d-1。将rhLTα-Da溶于100ml5%葡萄糖注射液,静脉恒速滴注0.5h,连续5天给药。于给药前、给药后不同时间收集血标本和尿标本。分别采用酶联免疫吸附测定法(enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA)和荧光磁珠免疫分析法(fluorescencebeadimmunoassay,FBI)测定患者给药后血清和尿液中rhLTα-Da浓度。用3p97软件拟合rhLTα-Da体内模型,描绘rhLTα-Da血药浓度-时间曲线,并计算药代动学参数。结果:入组的19例患者中,ELISA法的线性范围、特异性、准确度和精确度满足药代动力学要求,定量下限值为39pg/ml。FBI法的线性、线性范围、定量下限、准确度、特异性符合药代动力学研究,日间变异系数大于20%。rhLTα-Da进入体内后呈一室模型,迅速从血清中清除,给药停止即刻的浓度最高,2h后血清中的rhLTα-Da浓度已低于检测限。20μg·m-2·d-1和33μg·m-2·d-1剂量级药代动力学参数结果:半衰期分别为(0.24±0.09)h和(0.25±0.10)h,表观分布容积分别为(35.8±1.6)L/m2和(43.3±26.0)L/m2,清除率分别为(343.36±63.23)ng·m-2·h-1和(269.60±24.52)ng·m-2·h-1;血药浓度-时间曲线下面积分别为(74.6±18.4)ng·h·L-1和(99.0±17.8)ng·h·L-1。结论:在研究剂量范围内rhLTα-Da血药浓度-时间曲线符合一室模型,消除遵循一级动力学,连续5天给药不蓄积。

人淋巴毒素cDNA克隆及其在大肠杆菌表达的研究

人淋巴毒素ｃＤＮＡ克隆及其在大肠杆菌表达的研究ＣｌｏｎｉｎｇａｎｄｅｘｐｒｅｓｉｏｎｉｎＥ．ｃｏｌｉｏｆｃＤＮＡｆｏｒｈｕｍａｎｌｙｍｐｈｏｔｏｘｉｎ张津利朱锡华（第三军医大学基础部免疫学教研室）重庆，６３００３８淋巴毒素（ＬＴ或ＴＮＦ－β）系由淋...

重组人淋巴毒素α衍生物活性测定国家标准品的研制

目的：建立重组人淋巴毒素α衍生物(rhLT α)生物学活性测定用国家标准品。方法：标准品按WHO重组细胞因子要求制备、检测，采用L929细胞毒法测定rhLT α的生物学活性，并以NBSB提供的国际标准品为标准，由2家实验室对rhLT α国家标准品的效价进行协作标定。结果：rhLT α国家标准品经检定各项指标均符合要求，效价协作标定结果经统计学分析，均数的95％可信区间为4．21×10^4～4．52×10^4IU／支，单次测定的95％标准值范围为3．07×10^4～6．19×10^4IU／支。这批国家标准品效价确定为4．40×10^4IU／支。加速热稳定性实验表明活性在-20℃，4℃，25℃条件下20个月保持稳定。结论：该批rhLT α经协作标定，质量可靠，效价稳定，可作国家标准品使用。

淋巴毒素——一个有肿瘤坏死活性的淋巴因子

淋巴毒素（Lymphotoxin）,又有人叫它肿瘤坏死因子β（TNF-β）,是淋巴细胞经抗原或有丝分裂原活化以后释放出来的一类可溶性蛋白质。它具有抑制肿瘤细胞和病毒感染细胞的生长或裂解它们的活性,Ruddle1和Granger2在1968首先报道了淋巴毒素的这一特性。除了抑制或裂解某些离体生长的肿瘤细胞或转化细胞外。

SLE中淋巴毒素β基因表达及相关性研究

目的:探讨LT-β在SLE发病及免疫调节紊乱中的作用。方法:用ELISA法检测血清LT-β水平,PBLRNA斑点杂交测定LT-β基因转录水平;PCR-RLFP法分析LT-β基因多态性。结果:SLE患者血清LT-β水平比正常显著增高(P<0.05);活动期比正常增高更显著(P<0.01)。SLE患者基因转录水平比正常对照显著增高(P<0.05);活动期比正常亦显著增高(P<0.05);未发现LT-β基因的XhoⅠ酶切位点具有多态性。结论:提示LT-β是导致SLE发生的主要因子;LT-β参与SLE的免疫调节紊乱。

p55 TNFR 选择性淋巴毒素对心肌细胞氧化应激损伤的保护机制研究

目的：研究p55 TNFR选择性淋巴毒素对心肌细胞氧化应激损伤的保护作用及其机制。方法取Wistar乳鼠制备原代心肌细胞，建立H2 O2致心肌细胞的氧化应激损伤模型，将细胞分为正常组、模型组、rhLTα处理组及rhLTα－Q107 E处理组，流式细胞术检测细胞凋亡，免疫印迹法检测细胞内NF－κB的活化；实时定量RT－PCR法检测抗凋亡分子的转录水平（ Bcl－2、Bcl－X、XIAP）；免疫印迹法检测MnSOD水平；WST法检测CuZn／Mn－SOD活性。结果在体外大鼠心肌细胞的氧化应激损伤模型中，细胞凋亡率明显增高，伴随着Caspase－3活性明显增高；抗凋亡分子Bcl－2、Bcl－xL和XIAP的表达水平均减少；进一步检测MnSOD的蛋白表达水平下降，CuZn／Mn－SOD活性减弱。当加入rhLTα－Q107 E处理后，可逆转上述改变情况，伴随NF－κB的激活。而野生型LTα作用不明显（P＜0．05）。结论 p55TNFR选择性淋巴毒素rhLTα－Q107 E可通过激活NF－κB，上调抗凋亡分子表达和诱导线粒体MnSOD活化，发挥对抗氧化应激保护心肌细胞的作用，且优于野生型的LTα。

淋巴毒素α NcoⅠ基因多态性与冠心病的相关研究

目的研究我国汉族LT-αNcoⅠ基因多态性与冠心病遗传易感性之间的相关性。方法选取家族史阳性的汉族冠状动脉粥样硬化患者57例,家族史阴性的汉族正常对照62例,采用聚合酶链反应-限制性片断长度多态分析(PCR-RFLP)的方法,分析LT-α基因型以及基因频率分布。结果LT-αNcoⅠ基因多态性含有两个等位基因(LT-α1和LT-α2)及三种基因型(纯合子LT-α1/1和LT-α2/2,杂合LT-α1/2);冠心病组的LT-α的基因型与正常对照组差异无显著性(x^2=1.479,P>0.05);LT-α的基因型与冠状动脉狭窄程度差异无显著性(x^2=6.495,P>0.05)。结论LT-αNcoⅠ基因多态性与冠心病的遗传易感性无相关性,LT-α的基因型与冠状动脉狭窄程度亦无相关性。

人淋巴毒素cDNA克隆及顺序分析

目的：克隆人淋巴毒素ｃＤＮＡ并测序。方法：采用ＲＴ－ＰＣＲ技术，从ＰＨＡ／ＰＭＡ活化的人Ｔ细胞系Ｊｕｒｋａｔ细胞总ＲＮＡ中扩增人淋巴毒素ｃＤＮＡ，并定向克隆于ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９质粒载体，Ｓａｎｇｅｒ双脱氧链终止法测序。结果：ＲＴ－ＰＣＲ扩增出一个５４１ｂｐ的ＤＮＡ片段，限制性内切酶图谱分析和测序结果显示，该５４１ｂｐ片段为编码人淋巴毒素成熟肽的ｃＤＮＡ，与公布的人淋巴毒素ｃＤＮＡ序列完全一致。结论：本实验成功地克隆了人淋巴毒素ｃＤＮＡ，为在大肠杆菌表达人淋巴毒素并进一步研究其功能，以及淋巴毒素的开发与临床应用奠定了基础。