利用CFSE标记检测CD8^+淋巴细胞增殖

[目的 ]介绍一种新的检测淋巴细胞增殖的方法。 [方法 ]用本室构建的重组蛋白疫苗hsp6 5-CAP3对C5 7小鼠进行 3次免疫后 ,分离小鼠的脾细胞 ,以照射灭活的CAP3转基因细胞为刺激细胞 ,在体外刺激淋巴细胞的增殖反应。淋巴细胞在与刺激细胞共培养之前用绿色荧光染料羧乙基锗倍半氧化物 (CFSE)进行标记。在共培养 72h后 ,用PE标记的抗鼠CD8分子的单抗标记淋巴细胞。收集细胞进行FACS检测 ,出现在二维点图左上象限的细胞代表CFSE含量减少的CD8+淋巴细胞 (CD8+CFSElow)即增殖的CD8+淋巴细胞 ,利用流式细胞仪记数左上象限CD8+CFSElow细胞的比例。 [结果 ]经体外刺激的脾淋巴细胞中 ,实验组CD8+CFSElow的平均百分比值为 (16 .4 7± 2 .10 ) % ,对照组CD8+CFSElow 的平均百分比值为 (7.6 9± 1.6 5 ) % (P <0 .0 5 )。 [结论 ]通过FACS结果判定CD8+淋巴细胞发生了特异性的增殖。CFSE标记是一种有效的检测淋巴细胞增殖的方法。

建立小鼠免疫功能低下模型的研究

[目的 ]为满足保健食品功能评价体系的需要 ,建立一套抑制较浅、持续时间较长的免疫功能低下动物模型。 [方法 ]采用一次给药 ,适时强化的方法建模 ,并用已通过审批的具有免疫调节作用的保健食品进行验证。分别进行血清溶血素检测、迟发型超敏反应、淋巴细胞增殖实验和NK细胞活性检测。 [结果 ]血清溶血素和迟发型超敏反应组中 ,模型组小鼠的相应指标显著低于对照组 ,应用期给予保健食品的验证组 ,其受抑指标显著改善。模型组小鼠淋巴细胞增殖指标显著受抑 ,而验证组与模型组相比差异不明显。模型组小鼠NK细胞活性显著降低 ,验证组从造模第 1天起给予保健食品 ,其NK细胞活性与模型组相比显著增高。 [结论 ]采用合理的造模方法 。

小鼠β-防御素6与甲型流感病毒M2e基因融合表达及其免疫特性研究

目的构建小鼠β-防御素6(mBD6)与甲型流感病毒M2蛋白胞外功能区(M2e)真核表达质粒,并研究其在真核细胞中的表达与免疫特性。方法通过重叠延伸PCR法(overlap-PCR)将M2e与mBD6通过一段多肽接头Gly4Ser融合成为mBD6-M2e。将其插入载体pcDNA3.1(+),构建成pcDNA3.1(+)/mBD6-M2e。鉴定正确后,转染MDCK细胞,免疫荧光、MTT检测mBD6-M2e表达和分泌。免疫小鼠,半定量PCR检测脾细胞因子IL-2、IFN-γ、TNF-α、CCR7表达。结果融合基因mBD6-M2e真核表达载体pcDNA3.1(+)/mBD6-M2e构建成功,在MDCK细胞膜上成功表达融和蛋白,转染细胞的培养上清刺激淋巴细胞增殖。免疫小鼠细胞因子表达改变。结论融合基因mBD6-M2e真核表达载体成功构建,为研究防御素在流感病毒核酸疫苗中的佐剂作用奠定了基础。

免疫抑制对EIAV弱毒疫苗免疫马体内疫苗弱毒株载量的影响

为了研究马传染性贫血弱毒疫苗EIAVFDDV在体内的生物学特性,特别是在免疫马血浆中低拷贝存在状态的形成原因,使用连续给予地塞米松的方法,对EIAVFDDV免疫马匹进行了免疫功能抑制.连续给药10天后,以植物血凝素(PHA)作为刺激原的淋巴细胞非特异性增殖实验表明,实验马匹的免疫系统功能受到了明显抑制.使用实时RT-PCR对免疫抑制前后实验马匹体内EIAVFDDV的载量进行了定量检测.结果显示,EIAVFDDV免疫马匹体内的病毒载量在2匹马中未见升高,1匹马体内略有增高,但仍处于EIAVFDDV在免疫马匹体内载量的正常范围.作为对照,强毒株隐性携带马的病毒载量提高了约25000倍,并出现了典型的临床症状.实验结果提示,致弱后病毒特有的生物学特性,而非免疫压力,是EIAV疫苗株在宿主血浆中低拷贝存在的主要原因.同时,在免疫系统功能受抑制状态下,疫苗株在免疫马体内仍然表现出了相对稳定的低拷贝复制状态,进一步显示了EIAVFDDV在应用中的安全性.

甲型流感病毒M_2蛋白胞外功能区真核表达质粒的构建和表达分析

目的构建流感病毒M2蛋白胞外功能区(M2e)真核表达质粒,并研究其在真核细胞中的表达。方法根据Genbank(NCBI ISDN13425)中查得的M2e编码序列,设计并合成两条DNA单链;在两条链两端添加碱基构成酶切位点的粘性末端,退火后使之互补结合成为M2e编码序列;然后将其插入到经双酶切的真核表达载体pcDNA3.1(+)中,构建重组真核表达质粒pcDNA3.1(+)-M2e;经酶切和DNA测序鉴定后,转染HEK293细胞,用免疫荧光技术检测pcD-NA3.1(+)-M2e在HEK293细胞的表达,并通过MTT检测刺激淋巴细胞增殖及M2e蛋白的分泌情况。结果合成的寡核苷酸链经退火形成双链,插入酶切的真核表达载体后构建成pcDNA3.1(+)-M2e。免疫荧光技术证实该质粒表达的M2e蛋白定位于细胞膜上,转染细胞的培养上清经MTT实验证实能刺激淋巴细胞增殖,表明表达的M2e蛋白也可分泌至细胞外。结论成功构建了流感病毒M2e的真核表达质粒pcDNA3.1(+)-M2e,表达的M2e蛋白不仅存在于细胞膜上,也可分泌到细胞外。流感病毒M2e基因真核表达质粒的构建及成功表达为流感病毒基因工程疫苗、通用疫苗和核酸疫苗的研究奠定了基础。

检测口蹄疫病毒样颗粒疫苗对机体免疫机制的影响

口蹄疫病毒样颗粒(FMDV VLPs)是不含有口蹄疫病毒RNA的空衣壳结构,由口蹄疫病毒的4种结构蛋白体外自组装形成的,形态上与天然病毒粒子相似,具有很强的免疫原性和生物学活性[1].但口蹄疫病毒样颗粒疫苗对机体免疫功能影响的具体机制不清楚,作者对此进行了研究,发现:1)淋巴细胞增殖实验证实,该疫苗刺激淋巴细胞分化,增强机体的免疫应答;2)酶联免疫吸附实验证实,口蹄疫病毒样颗粒疫苗刺激小鼠产生更多的外周血细胞因子.总之,口蹄疫病毒样颗粒疫苗通过改变抗原的物理形状,延长抗原在动物机体内存留时间,刺激淋巴细胞分化,增强机体的免疫应答.