嵌合抗原受体基因修饰T淋巴细胞治疗肺癌的研究进展和挑战

近年来,免疫疗法尤其是单克隆抗体靶向药物越来越多地应用于肺癌的临床治疗,但仍有很多局限性。嵌合抗原受体基因修饰T淋巴细胞(chimeric antigen receptor gene modified-T lymphocytes,CAR-T)疗法对于部分B细胞淋巴瘤和白血病的疗效显著,也为实体瘤的免疫治疗开辟了新途径。肺癌CAR-T疗法的热门靶点包括间皮素(MSLN)、黏蛋白突变体(TnMUC1)、表皮生长因子受体(EGFR)、人表皮生长因子受体2(HER2)、受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ROR1)和δ样配体3(DLL3)等,但相关临床研究均处于早期探索阶段。所面临的主要障碍包括脱靶毒性、肿瘤免疫抑制微环境和CAR-T细胞体内效能不足等。通过基因编辑改进CAR结构、设计多靶点CAR或组合应用多靶点CAR-T细胞、精细调控CAR-T细胞体内动态分布、改进给药方式或联合其他免疫治疗等策略可能有助于解决这些问题。

嵌合抗原受体T淋巴细胞治疗多发性骨髓瘤疗效及安全性的Meta分析

背景多发性骨髓瘤(MM)是一种浆细胞恶性肿瘤,目前尚无法治愈,面临复发与难治的困境。嵌合抗原受体T淋巴细胞(CAR-T)是一种在MM治疗中有巨大潜力的新型免疫疗法,但目前关于其疗效与安全性的评价较少。目的系统评价CAR-T治疗MM的疗效及安全性,为其安全高效应用提供循证医学证据。方法计算机检索PubMed、EMBase、The Cochrane Library数据库,筛选自建库至2019年11月已发表的CAR-T治疗MM的临床试验英文文献,以总反应率、严重不良事件(AEs)发生率(≥3级)、细胞因子释放综合征(CRS)发生率为结局指标,使用R软件进行单组率的Meta分析,并按照预处理方案、共刺激分子、CAR-T抗原类型分组进行亚组分析及Meta回归分析。结果共纳入8项临床研究,包括191例患者,Meta分析结果显示:CAR-T治疗MM的总反应率为0.88〔95%CI(0.83,0.93)〕,严重AEs发生率为0.90〔95%CI(0.83,0.98)〕,CRS发生率为0.92〔95%CI(0.85,1.00)〕。亚组分析及Meta回归分析结果提示:不同预处理方案MM患者严重AEs发生率、CRS发生率比较,差异均有统计学意义(P=0.013,P<0.001);其中,Flu+Cy组、Cy组、无预处理组严重AEs发生率、CRS发生率高于HDM+ASCT组(P<0.05)。共刺激分子4-1BB组总反应率高于CD28组,严重AEs发生率低于CD28组(P<0.05)。不同抗原类型MM患者总反应率、严重AEs发生率、CRS发生率比较,差异均有统计学意义(P=0.004、0.049、0.023);其中,BCMA组总反应率低于LCAR-B38M组、BCMA+CD19组,严重AEs发生率、CRS发生率高于CD19组(P<0.05);LCAR-B38M组、BCMA+CD19组严重AEs发生率、CRS发生率高于CD19组(P<0.05)。结论CAR-T治疗MM具有良好的疗效,虽然有一定的可控安全风险。预处理方案、共刺激分子以及CAR-T抗原类型均是影响疗效及安全性的因素。因纳入研究样本量较少、质量不一,上述结论尚待大样本、高质量随机对照临床试验进一步验证。

嵌合抗原受体T淋巴细胞免疫疗法在原发性肝癌中的应用

原发性肝癌具有恶性程度高、进展快、易复发转移和病死率高等特点,因此大多数患者就诊时已发生肝内或肝外转移,失去手术治疗机会。嵌合抗原受体T淋巴细胞(CAR-T)免疫疗法已在B细胞急性淋巴性白血病治疗中取得了较好的效果,其在原发性肝癌、胰腺癌、胃癌以及前列腺癌等实体瘤中的应用也陆续开展了临床试验。本文综述了CAR-T免疫疗法在原发性肝癌临床试验中的疗效,并讨论了其在临床应用中需攻克的难题,如缺乏适宜的肿瘤靶点、肿瘤微环境对CAR-T的抑制作用以及CAR-T对肿瘤组织的浸润性差等,以期为临床研究提供参考。

T淋巴细胞激活与凋亡的信号转导及其分子机制

研究发现,人T淋巴细胞抗原受体复合物(TCR/CD3)中,TCR负责接受抗原刺激,CD3负责转导抗原刺激信号。抗TCR或抗CD3抗体的刺激不仅可以激活T淋巴细胞,也可以导致胸腺细胞、激活后的或转化的T淋巴细胞凋亡,但其分子机制和信号转导途径还不清楚。本文着重介绍了近年来这方面的研究工作进展。首先,利用人CD3ε过量表达的转基因小鼠发现,CD3ε分子的过量表达可阻断胎鼠的胸腺细胞发育,而在小鼠出生后,促进小鼠胸腺细胞的凋亡,随着年龄增加,胸腺细胞凋亡的数目增多。进而采用基因定点突变和基因转移等分子生物学研究技术,构建了CD8胞外区与跨膜区和CD3ε胞内区的融合分子及其突变分子,转染CD8^-的T淋巴细胞后,建立了细胞凋亡模型。利用此细胞凋亡模型,发现T细胞激活和凋亡的信号转导均是通过CD3ε分子的胞内区免疫酪氨酸受体激活基序(ITAM)中的2个酪氨酸转导的,其中任何1个或2个酪氨酸突变,均可阻断细胞信号的转导;在T细胞凋亡的过程中,立早基因Nur77和细胞凋亡基因fas表达显著增加,但未发现fas配体表达增加;在T细胞激活过程中,3-磷脂酰肌醇激酶P85α亚基与CD3ε-ITAM中的2个酪氨酸特异性地结合,其中任何1个酪氨酸突变,均大大减低P85α与CD3ε-ITAM的结合能力;

PD-1敲除及GPC3修饰的嵌合抗原受体T细胞治疗肝癌的实验研究

目的构建程序死亡受体1(PD-1)敲除及磷脂酰肌醇蛋白多糖-3(GPC3)修饰的嵌合抗原受体T细胞(GPC3-PD1gRNA-CART cells),研究其对肝癌细胞株HepG2的体外杀伤作用,以及其对肝癌动物模型的体内抗肿瘤作用。方法制备GPC3-PD1gRNA-CART细胞,用流式细胞仪检测PD-1、GPC3 CAR的表达情况。体外实验中,设立不同的效靶比(1:1、2:1、4:1),用LDH法测定刀豆蛋白刺激后的GPC3-PD1gRNA-CART细胞体外对HepG2细胞株的杀伤率,检测刀豆蛋白刺激后的GPC3-PD1gRNA-CART细胞和HepG2细胞株共孵育18 h后的细胞培养上清液中IFN-γ的释放水平。设置受刀豆蛋白A刺激的和未受刀豆蛋白A刺激的GPC3修饰的CART细胞(GPC3 CART cells)作为对照组。于重度免疫缺陷小鼠(NDG小鼠)皮下注射HepG2细胞建立肝癌动物模型,观察GPC3-PD1gRNA-CART细胞体内抑瘤作用。实验分为模型组、实验组(GPC3-PD1gRNA-CART组、GPC3 CART组),模型组和实验组通过皮下注射1×10^6个HepG2细胞造模,在肿瘤长径达3 mm后实验组经尾静脉注射5×10^6个GPC3-PD1gRNA-CART细胞或GPC3 CART细胞,模型组经尾静脉注射0.9%NaCl,每周注射1次,共3周,注射体积均为0.2 ml。每隔2天观测肿瘤体积情况,治疗3周后取皮下肿瘤组织,HE染色检测肿瘤组织情况。结果流式细胞术分析结果显示,GPC3 CAR表达率为98.8%。GPC3 CART细胞PD-1的表达率为11.1%,经刀豆蛋白A刺激后,PD-1的表达率上升至92.1%,而GPC3-PD1gRNA-CART细胞的PD-1表达率仅为60%,证实了PD-1有效敲除。当效靶比为1:1、2:1、4:1时,随着效靶比的增加,刀豆蛋白刺激后的GPC3-PD1gRNA-CART细胞对HepG2的杀伤效果和IFN-γ的释放水平也随着效靶比的增加而增加。相同效靶比的情况下,刀豆蛋白A刺激后的GPC3-PD1gRNA-CART细胞对HepG2细胞的杀伤效果显著高于刀豆蛋白A刺激后的GPC3 CART细胞对HepG2细胞的杀伤效果(P<0.05),且刀豆蛋白A刺激后的GPC3-PD1gRNA-CART细胞和HepG2细胞共孵育后IFN-γ的释放水平也显著高于刀豆蛋白A刺激后的GPC3 CART细胞和HepG2细胞共孵育后IFN-γ的释放水平(P<0.05),证明PD-1的敲除可以逆转CART细胞的功能抑制。治疗3周后GPC3-PD1gRNA-CART组抑瘤率为87.30%,与GPC3 CART组(69.03%)和模型组相比均有显著性差异(P<0.05)。肿瘤组织HE染色检测结果显示,相比模型组,实验组肿瘤细胞显著减少,GPC3-PD1gRNA-CART组治疗效果优于GPC3 CART组。结论GPC3-PD1gRNA-CART细胞可解决肿瘤逃逸问题,能于体内外高效靶向杀伤肿瘤细胞,为后续肝癌治疗提供技术基础。

难治/复发性弥漫大B细胞型淋巴瘤的治疗现状及过继免疫治疗在其中的应用

弥漫大B细胞淋巴瘤是成人非霍奇金淋巴瘤中发病率最高的一种病理类型,其恶性程度较高,完全缓解率较低,耐药率较高。CIK及CAR-T细胞为代表的过继免疫治疗是近年来转化医学领域研究的重点及热点,CAR-T细胞以其靶向性、杀瘤活性、持久性等特点给难治/复发型弥漫大B细胞淋巴瘤的治疗带来新的希望。

CAR-T细胞治疗淋巴造血系统恶性肿瘤临床试验设计相关问题的考虑

嵌合抗原受体T淋巴细胞(CAR-T)在淋巴造血系统恶性肿瘤,如B淋巴细胞白血病、B细胞淋巴瘤和多发性骨髓瘤等的治疗中展现出非常有吸引力的治疗前景。目前有多个课题申请人向中国国家药品监督管理局药品审评中心提交新药临床试验申请,其中很多CAR-T细胞临床试验课题在受试者筛选、疗效预后指标、风险控制等方面存在共性问题,可能影响受试者的安全性和疗效判断。药品审评中心通过总结国内外临床试验设计方面的经验并与国内临床专家交流探讨,对上述共性问题形成了若干考虑,供申办方或研究者开展药品注册临床试验时参考。

嵌合抗原受体T淋巴细胞治疗神经母细胞瘤的研究进展

嵌合抗原受体T淋巴细胞（chimeric antigen receptor T lymphocyte，CAR-T）免疫治疗是近年来开始出现的一种新型肿瘤免疫治疗方法，目前已经在白血病、淋巴瘤等晚期癌症患者中应用，并取得一定疗效。神经母细胞瘤是儿童最常见的颅外恶性实体肿瘤之一，有超过一半的患者在确诊时已经发生了转移。目前高危患儿的预后较差，临床需要寻找新的治疗方法。该文总结了CAR-T的基本结构及优化发展，讨论了其在神经母细胞瘤中的治疗原理及风险，并展望了CAR-T在实体肿瘤中的治疗前景。

双阴性调节性T淋巴细胞对胰腺癌细胞的免疫抑制作用

双阴性调节性T淋巴细胞（DNTreg细胞）是一种可以表达T淋巴细胞抗原受体（TCR），但是并不表达CIM、CD8和自然杀伤细胞表面标志物的一种特殊类型的调节性T淋巴细胞。国内外关于DNTreg细胞发挥抗肿瘤作用和抗肿瘤机制的报道较少，

CAR-T免疫疗法所致细胞因子释放和神经毒性综合征的诊疗研究进展

嵌合抗原受体基因修饰T淋巴细胞(CAR-T)免疫治疗尤其在复发/难治性恶性血液病的临床应用中显示出卓越的疗效,被认为是最有前景的肿瘤治疗方法之一,但是CAR-T免疫治疗中可引发独特的毒性作用,其中细胞因子释放综合征(cytokine release syndrome,CRS)和免疫效应细胞相关神经毒性综合征(immune effector cell-associated neurotoxicity syndrome,ICANS)在临床应用中最为常见,并具有潜在的致死性,使得CRA-T疗法的广泛应用受到一定的限制,因此如何最大程度地利用CAR-T免疫治疗的同时努力减少或预防CRS和ICANS的发生是目前临床研究的重点,深入了解CRS和ICANS的发生机制能为新的预防措施提供思路。早期识别相关危险因素及鉴定生物预测标志物,熟悉其分级与治疗措施,有利于规范CAR-T免疫疗法的临床应用和患者安全管理。本文就CRS和ICANS的危险因素、发生机制、临床表现、分级与治疗和预防措施等方面进行综述,旨在为CAR-T疗法常见毒性作用的规范管理提供帮助。

CD19在儿童B系急性淋巴细胞白血病诊治中的意义与相关研究进展

复发难治B系急性淋巴细胞白血病是儿童白血病相关死亡的重要原因。CD19作为治疗B淋巴细胞恶性肿瘤的潜在靶点近年备受关注。以嵌合抗原受体T淋巴细胞(CAR-T)在儿童B系急性淋巴细胞白血病临床试验中疗效显著。取得疗效的同时,需注意存在细胞因子释放综合征、严重神经毒性、心肌毒性、脱靶效应及复发等多种问题,优化CAR-T细胞的设计、合理的预处理和细胞输注方案,同时注意并发症防治,进一步提高CD19 CAR-T细胞治疗的安全性和有效性,为儿童难治复发急性淋巴细胞白血病治疗提供新方案。

论“恐伤”心理的基因定势表达

本文在基因定势表达研究概况基础上,列举OMIM上部分与恐惧等心理因素定势的基因与疾病,进而探讨心理、基因定势表达与精神病的关系。

慢性淋巴细胞白血病细胞损害CD8^(+)T细胞的线粒体代谢功能影响CAR-T细胞效能的体外试验研究

目的通过体外试验探究慢性淋巴细胞白血病细胞损害CD8^(+)T细胞的线粒体代谢功能影响嵌合抗原受体的T淋巴细胞(chimeric antigen receptors modified T cells,CAR-T)的效能。方法将培养得到的CAR-T细胞和CD8^(+)T细胞作为正常组,感染组为加入慢性淋巴细胞白血病细胞进行侵染的CAR-T细胞和CD8^(+)T细胞。采用FACScan流式细胞仪检测CAR-T细胞的凋亡情况;Western blot检测细胞凋亡相关的蛋白Bcl-2、cleaved-caspase-3和Bax的相对表达量;酶联免疫吸附实验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测炎症因子肿瘤坏死因子(tumour necrosis factor-alpha,TNF-α)、白细胞介素(interleukin,IL)-6和IL-10的变化;使用Pierce BCA蛋白检测试剂盒测定蛋白质浓度;化学发光发检测细胞内三磷酸腺苷(adenosine triphosphate,ATP)水平,分光光度计检测线粒体丙二醛(malondialdehyde,MDA)、还原型谷胱甘肽(glutathione,GSH)的含量;荧光探针法检测胞内钙离子浓度的变化,实时荧光定量PCR检测线粒体DNA表达水平的变化。结果正常组CAR-T细胞凋亡率显著低于感染组CAR-T细胞凋亡率,差异有统计学意义[(4.58±0.16)%比(7.06±0.74)%,χ^(2)=5.674,P<0.05]。感染组的Bax和cleaved-PARP表达量明显高于正常组,Bcl-2表达量明显低于正常组,差异具有统计学意义[(3.51±0.01)%比(1.07±0.01)%,(2.34±0.05)%比(1.36±0.04)%,(0.66±0.02)%比(1.17±0.02)%,χ^(2)值分别为298.838,26.509和31.231,P值均<0.05]。感染组的IL-6、TNF-α表达量较正常组明显升高,IL-10表达量较正常组明显降低,组间差异具有统计学意义[(87.69±21.07)ng/L比(43.25±5.36)ng/L,(65.12±15.75)ng/L比(33.14±5.23)ng/L,(16.02±1.69)ng/L比(24.33±2.33)ng/L,t值分别为3.54,3.338和4.988,P值均<0.05]。感染组的ATP和总钙离子浓度低于正常组,差异具有统计学意义[(0.15±0.03)μmol/g比(0.32±0.06)μmol/g,(12.46±2.74)μmol/L比(25.97±3.49)μmol/L,t值分别为4.389和5.274,P值均<0.05]。感染组的MDA含量高于正常组,GSH含量低于正常组,差异具有统计学意义[(1.84±0.23)μmol/L比(1.34±0.21)μmol/L,(1.07±0.17)pg/mg比(5.23±0.36)pg/mg,t值分别为2.781和18.098,P值均<0.05]。感染组CD8^(+)T细胞线粒体基因蛋白的表达量明显低于正常组,差异具有统计学意义[(0.62±0.03)%比(1.01±0.06)%,χ^(2)=10.070,P<0.05]。结论离体状态下慢性淋巴细胞白血病细胞通过损害CD8^(+)T细胞的线粒体代谢功能促进CAR-T细胞的凋亡。

CAR-T产品医保准入风险分担协议的国际经验及启示

目的:借鉴国外已上市嵌合抗原受体T淋巴细胞(CAR-T)产品在医保准入中签订风险分担协议的经验,为我国医保部门的相关决策提供参考。方法:以目前已上市的CAR-T产品在英国、法国、意大利、德国等4个样本国家的9份风险分担协议为样本,从协议类型、监测指标、数据收集方式、协议周期、支付条件和支付方式等6个维度剖析CAR-T产品医保支付的国际经验,并为该类产品在我国的医保准入提出建议。结果与结论:4个样本国家普遍与医药企业签订了医保准入风险分担协议(包括经济导向协议和疗效导向协议),通过使用数据收集系统或临床研究数据来收集患者个体的疾病进展、无进展生存期等指标数据,从而监测CAR-T产品的疗效与安全性;根据不同协议类型,确定协议周期与支付条件,通过使用“医保先行支付”和“医药企业垫付”2种方式并结合“分期付款”来进行风险控制。解决“疗效不确定性”所带来的医保基金风险是CAR-T产品准入的核心问题,引入风险分担协议可能是解决这一问题的途径,而科学设计风险分担协议的各要素则是确保协议可操作的前提条件。

IL-21和CCL19修饰可提高NKP30 CAR-T细胞对肺癌的杀伤效率并促进其肿瘤浸润

目的探讨细胞因子IL-21和趋化因子CCL19修饰的NKP30 CAR-T细胞是否增强对肺癌的杀伤和浸润作用。方法在NKP30 CAR基础上融合基因IL-21和CCL19构建IL-21-CCL19 NKP30 CAR;CAR-T细胞的培养使用CD3CD28单抗及细胞因子IL-2刺激;流式细胞术检测免疫细胞表型;迁移实验检测IL-21对免疫细胞的迁移作用;乳酸脱氢酶(LDH)及成球实验检测CAR-T细胞的杀伤及浸润能力;酶联免疫斑点技术(ELISPOT)检测IFN-γ的分泌数量;ELISA检测IL-21及CCL19的分泌情况;体内实验中,将肿瘤细胞显微注射到斑马鱼卵黄囊,构建斑马鱼移植瘤模型,24 h后将免疫细胞注射至同样部位,体式荧光显微镜拍摄荧光。结果NKP30配体(B7H6)在正常组织及血液细胞不表达,在肺癌细胞上高表达(90%以上)。IL-21-CCL19 NKP30 CAR-T细胞与NKP30 CAR-T细胞和常规T细胞相比,具有更强的增殖能力、迁移能力及中心记忆T细胞的形成(P<0.001),免疫抑制分子CTLA4与PD1显著降低(P<0.005),对肺癌细胞具有更强的杀伤能力(P<0.001),伴随IFN-γ数量明显增加(P<0.001)。IL-21-CCL19 CAR-T细胞杀伤肺癌细胞中产生大量细胞因子IL‑21(3152.33±526.74 pg/mL)和趋化因子CCL19(1853±211.95 pg/mL)。体内实验中,CAR-T细胞和普通T细胞比较,具有较强的杀伤能力和增殖能力,但2种CAR-T细胞无明显差异(P>0.05)。结论IL-21-CCL19 NKP30 CAR-T细胞更容易浸润到肿瘤内部,有效杀伤肿瘤细胞,同时产生更多的记忆T细胞。

食管癌特异性PTK7-CAR-T细胞的制备及其功能研究

目的:制备食管癌特异性蛋白酪氨酸激酶7(PTK7)-嵌合抗原受体(CAR)-T淋巴细胞(PTK7-CAR-T),并研究其功能。方法:以抗PTK7单链抗体为靶向分子构建CAR慢病毒表达质粒,包装制备慢病毒颗粒lenti-CAR,共同培养并转染T细胞,获得PTK7-CAR-T细胞,鉴定重组慢病毒表达载体,同时构建Control-CAR-T细胞。采用流式细胞术检测各CAR-T细胞增殖活性;靶细胞杀伤实验检测特异杀伤率;酶联免疫吸附试验(ELISA)检测不同CAR-T细胞因子释放能力。结果:成功构建PTK7-CAR-T细胞和Control-CAR-T细胞;与Control-CAR+TE5组、Control-CAR+TE9组相比,嵌合PTK7抗原的CAR-T细胞可以特异性识别TE5、TE9细胞并降低其增殖活性(P<0.05),同时提高自身的杀伤能力和细胞因子释放能力(P<0.05),且其杀伤能力随效靶比的升高而增强(P<0.05);与Control-CAR+HEEC组相比,嵌合PTK7抗原的CAR-T细胞对HEEC增殖活性无影响(P>0.05),且不会影响其自身的特异杀伤率和细胞因子释放能力(P>0.05)。结论:PTK7-CAR-T细胞可特异性识别人食管鳞癌细胞并降低其增殖活性,提高自身的特异杀伤能力和细胞因子释放能力,起到抗癌的效果。

程序性死亡-1及其配体信号通路在移植免疫中的作用

程序性死亡-1（PD-1）为负性调控共刺激分子，系T淋巴细胞和B淋巴细胞表面受体，属于免疫球蛋白超家族Ⅰ型跨膜糖蛋白，在T、B淋巴细胞抗原受体激发后呈诱导性表达。PD-1与其2个配体PD-L1和PD-L2结合，在免疫应答中起着负性调控作用。目前，人们愈加关注PD-1／PD-L信号通路与临床疾病的关系，如移植后排斥反应、哮喘、1型糖尿病等。本文对PD-1／PD-L信号通路在移植免疫中的作用进行如下综述。

心智觉知干预模式对CAR-T治疗多发性骨髓瘤患者心理状况及创伤后成长的影响

目的探讨心智觉知干预模式对嵌合抗原受体T淋巴细胞(CAR-T)治疗多发性骨髓瘤(MM)患者心理状况及创伤后成长的影响。方法选取2020年1月至2021年6月徐州医科大学附属医院血液科接受CAR-T治疗的MM患者84例, 应用随机数字表将患者分为观察组和对照组, 各42例。对照组CAR-T治疗期间行常规健康指导, 观察组在对照组基础上行心智觉知干预模式, 干预时间为8 w, 比较两组干预前后心理状况、创伤后成长、应对方式及生活质量。结果干预后观察组与对照组相比, 汉密尔顿焦虑评分(HAMA)、汉密尔顿抑郁评分(HAMD)、屈服评分、回避评分显著下降(t=5.635、7.111、5.920、4.776, P<0.01), 干预后观察组创伤后成长总评分、面对评分及生活质量综合评定问卷-74(GQOLI-74)较对照组明显提高(t=18.436、5.896、8.907, P<0.05)。结论心智觉知干预模式能有效减轻MM患者CAR-T治疗期间不良情绪, 促使患者创伤后成长, 使患者能以积极的方式面对疾病, 提高患者生活质量。