淋巴细胞连接蛋白调控JAK-STAT信号通路在高血压血管重构中的作用

目的:探讨淋巴细胞连接蛋白(LNK)调控Janus激酶(JAK)/信号转导与转录激活子(STAT)信号通路在高血压血管重构中的作用。方法:选取大鼠胸主动脉平滑肌细胞,构建高血压细胞模型。实验分组为对照组、血管紧张素(Ang)Ⅱ组、AngⅡ+空载组、AngⅡ+LNK组。流式细胞仪检测血管平滑肌细胞(VSMC)的细胞周期、凋亡及增殖水平;实时荧光定量聚合酶链反应检测各组LNK、JAK2、STAT3的mRNA表达水平;Western blot检测各组LNK、STAT3、磷酸化STAT3(p-STAT3)、JAK2、磷酸化JAK2(p-JAK2)的蛋白表达水平。结果:(1)各组细胞周期、凋亡及增殖水平比较:与对照组比较,Ang组和AngⅡ+空载组处于细胞休眠期(G0期)/DNA合成前期(G1期)的细胞减少,处于DNA合成期(S期)和DNA合成后期(G2期)/分裂期(M期)的细胞增加;与AngⅡ+空载组比较,AngⅡ+LNK组处于G0/G1期的细胞增加,处于S期、G2/M期的细胞减少。AngⅡ组和AngⅡ+LNK组细胞增殖水平高于对照组,凋亡率明显低于对照组;AngⅡ+LNK组细胞增殖水平低于AngⅡ组和AngⅡ+空载组,凋亡率明显高于AngⅡ组和AngⅡ+空载组(P均<0.05)。(2)各组mRNA表达水平比较:AngⅡ组和AngⅡ+空载组中STAT3、JAK2的mRNA表达水平明显高于对照组;AngⅡ+LNK组中STAT3、JAK2的mRNA表达水平明显低于AngⅡ组和AngⅡ+空载组(P均<0.05)。(3)各组蛋白表达水平比较:AngⅡ组和AngⅡ+空载组p-STAT3、p-JAK2的蛋白表达水平明显高于对照组;AngⅡ+LNK组p-STAT3、p-JAK2的蛋白表达水平明显低于AngⅡ组和AngⅡ+空载组(P均<0.05)。结论:LNK可能通过负性调节JAK/STAT信号通路参与高血压的血管重构。

LNK基因沉默对THP-1细胞EPO、EPOR表达影响的研究

目的:探讨LNK基因沉默对人单核细胞白血病细胞(THP-1)EPO、EPOR表达的影响。方法:培养THP-1细胞,以慢病毒为载体介导SiRNA稳定沉默LNK基因,感染72h后在荧光倒置显微镜下观察GFP表达水平;应用流式细胞术检测慢病毒感染效率,RT-PCR验证LNK沉默效应,并检测EPO及EPOR mRNA表达水平;应用Western blot检测LNK、EPO及EPOR蛋白水平。结果:慢病毒感染72h在荧光倒置显微镜下观察GFP表达水平达85%以上,流式细胞术检测感染效率均在99%以上;LNK沉默组LNK、EPO及EPORmRNA表述水平明显低于对照组(P<0.05)。LNK沉默组LNK、EPO及EPOR蛋白水平明显低于对照组(P<0.05)。结论:成功建立了LNK基因沉默的THP-1细胞株。沉默LNK基因,则EPO及EPOR表达下调,提示LNK可能参与了EPO及EPOR的调控。

LNK基因沉默和过表达对THP-1细胞STAT3表达影响的研究

目的:探讨LNK基因沉默和过表达对人单核细胞白血病细胞(THP-1)STAT3基因表达的影响。方法:培养THP-1细胞;以慢病毒为载体介导SiRNA、LNK(SH2B3)稳定沉默及过表达LNK基因;转染72h后于倒置荧光显微镜下观察细胞的GFP表达量;应用流式细胞术检测慢病毒感染效率;RT-PCR验证LNK沉默及过表达效应,检测STAT3 mRNA表达量;Western blot检测LNK、STAT3蛋白水平。结果:慢病毒感染72 h THP-1细胞GFP表达量达85%以上,细胞感染效率在99%以上。LNK沉默组LNK及STAT3 mRNA表达量明显低于对照组,而LNK过表达组的LNK和STAT3 mRNA表达水平明显高于对照组(P<0.05)。LNK沉默组LNK、STAT3蛋白水平明显低于对照组,而在LNK过表达组明显高于对照组(P<0.05)。结论:成功建立了LNK基因沉默及过表达的THP-1细胞株。沉默LNK基因导致STAT3表达下调;过表达LNK基因,使STAT3表达上调;此结果提示LNK可能参与了STAT3的调控。

LNK对人巨细胞病毒感染平滑肌细胞血管新生微环境的影响

目的研究淋巴细胞连接蛋白(LNK)对人巨细胞病毒(HCMV)感染平滑肌细胞(VSMC)血管新生微环境的影响及作用机制.方法经过细胞培养及细胞转染将细胞分为正常组、对照组、空载组和LNK组.进行细胞增殖实验,酶联免疫吸附法检测白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、干扰素γ(IFN-γ)水平,化学发光法检测促血管生成素-1(Ang-1)、促血管生成素-2(Ang-2)及血管内皮生长因子-A(VEGF-A)水平,Western blot法检测血清转化生长因子β1(TGFβ1)、转化生长因子β1受体(TGFβ1R1)相对表达量.结果与正常组比较,对照组、空载组、LNK组OD值均升高(P<0.05).与对照组比较,空载组、LNK组OD值较低(P<0.05).与空载组相比,LNK组OD值较低(P<0.05).与正常组细胞比较,对照组、空载组、LNK组细胞IL-6、TNF-α、IFN-γ水平均升高(P<0.05),与对照组、空载组细胞比较,LNK组细胞IL-6、TNF-α、IFN-γ水平均降低(P<0.05).与正常组比较,对照组、空载组、LNK组Ang-1降低,Ang-2、VEGF-A升高(P<0.05),与对照组比较,空载组、LNK组Ang-1升高,Ang-2、VEGF-A降低(P<0.05),与空载组比较,LNK组Ang-1升高,Ang-2、VEGF-A降低(P<0.05).与正常组比较,对照组、空载组、LNK组TGFβ1及TGFβR1表达升高(P<0.05),与对照组比较,空载组TGFβ1、TGFβR1表达升高,LNK组TGFβ1、TGFβR1表达降低(P<0.05),与空载组比较,LNK组TGFβ1、TGFβR1表达降低(P<0.05).结论LNK转染对HCMV感染VSMC有一定干预作用,能够降低炎症反应,通过调控Ang-2、VEGF-A、TGFβ1、TGFβ1R1蛋白水平,改善血管新生微环境.