噬菌体抗体库淘筛方法的比较研究

目的:比较噬菌体抗体库的淘筛方法,从而为得到亲和力高、特异性强的抗体克隆打下基础。方法:在包被好抗原的2个细胞培养瓶中加入噬菌体抗体库,一个采用先直接加入宿主菌感染后,再将培养瓶内残留结合物洗脱中和后感染的方法,另一个则采用先洗脱并中和的噬菌体感染宿主菌,与抗原结合的剩余的噬菌体再行直接感染,将2种方法所得到的感染菌和援救所得的噬菌体进行CFU和PFU测定。结果:从实验的数据中可以发现,采用第一种方法所得次级库的容量要大于后一种方法所得的初级库。结论:噬菌体抗体库的淘筛方法必须按照实验的具体情况进行选择,如果要求严谨度适中,则可以采用直接感染的方法淘筛。

全合成噬菌体展示抗体库淘筛策略与多样性分析

大容量全合成噬菌体展示抗体库可用于针对特异靶点生产高亲和力抗体,是重要的单克隆抗体来源,其中亲和淘筛策略是影响抗体筛选效果的关键。亲和淘筛中的多样性损失会降低高亲和力抗体获得概率,为探究亲和淘筛多样性损失最小的筛选策略,分别以PCSK9,CD20为靶点,用全合成噬菌体展示抗体库淘筛,通过滴度测定与测序分析比较首轮淘筛中酸洗脱与宿主菌直接感染所得洗脱物的框架与多样性差异。同时采取直接液体扩增、刮板后液体扩增,以及30、37℃两种扩增温度探究不同扩增条件对次级库框架分布的影响。最佳淘筛方法效果通过PCSK9,CD20多轮淘筛后的单克隆phage-Elisa结果验证。研究结果表明合并酸洗脱与宿主菌洗脱噬菌体,30℃直接液体扩增可以使合成库首轮淘筛多样性损失最低,采用此法获得了靶向PCSK9与CD20的阳性序列。最终开发了一种保留全合成噬菌体抗体库多样性效果好、实验周期短的淘筛方法。可供全合成噬菌体抗体库进行高效的抗体筛选,有效推进了抗体药物早期发现进程。

基于复杂生物体系的噬菌体随机肽库筛选

近年来 ,噬菌体肽库生物淘筛方法又取得了新的进展 ,出现了以活细胞、病毒及组织器官等复杂生物体系 ,代替纯化的抗原、抗体或受体分子等作为筛选靶标的方法 ,并取得了较好的应用效果 .其中 ,以肿瘤组织筛选噬菌体肽库获得的短肽能选择性富集于肿瘤组织 ,在肿瘤靶向性治疗中具有潜在的应用前景 .

靶向巨噬细胞膜蛋白Vsig4特异性纳米抗体的构建和筛选

目的构建V-set and immunoglobulin domain containing 4(Vsig4)特异性纳米抗体,以期作为巨噬细胞的分子探针。方法用Vsig4重组蛋白对羊驼进行免疫,分离血液中的淋巴细胞,利用噬菌体展示技术,构建噬菌体展示文库,经过连续3次生物淘筛获得与Vsig4蛋白结合的噬菌体,经测序和基因比对所得VHH序列,用ELISA法筛选出抗Vsig4的高亲和力纳米抗体,并用Vsig4稳定表达细胞系验证纳米抗体的结合能力。结果成功构建了插入率为70%、库容量为7.27×107的噬菌体表达文库,经过克隆筛选获得136个Vsig4阳性单克隆,经测序获得15个不同的VHH基因,将这些基因克隆至原核表达体系,表达和纯化后获得了高纯度的Vsig4纳米抗体,其中Nb119的亲和力最高,并且可以与Vsig4稳定表达细胞系结合。结论成功构建并筛选了特异性、高亲和力的Vsig4纳米抗体,以期用于检测巨噬细胞表面Vsig4的表达和构建特异性分子探针。

人离体骨肉瘤组织血管噬菌体肽库筛选模型的建立及其意义

目的建立人离体骨肉瘤血管亲和筛选模型。方法(1)建立模型。术前对患肢局部行数字减影造影检查,标记肿瘤固有动脉大致走行,术后小心修剪,并连接类似于Langendorff的灌流装置,监控模型血管内的pH值、温度、氧分压等;(2)对噬菌体十二肽库进行筛选。结果28例骨肉瘤离体标本均建模成功,可直接用于灌流实验,并筛选出具有较高特异性的亲和短肽(基序为RLTR),各项指标显示离体骨肉瘤较好模拟了人体内的环境。结论建立人离体骨肉瘤血管亲和筛选模型是可行的,可直接用于对噬菌体随机肽库的亲和筛选,为骨肉瘤的靶向化疗提供参考。

应用激光显微分离技术在骨肉瘤组织原位筛选噬菌体肽库

目的将激光显微分离(laser capture microdissection, LCM) 技术应用于噬菌体表面呈现肽库的筛选过程,建立一种可以直接在天然组织中筛选肽库的方法。方法将新鲜人骨肉瘤组织块在噬菌体肽库溶液振荡孵育后制成组织冰冻切片,免疫组化染色检测噬菌体在组织中的浸润扩散。改进常规LCM切片处理方法,以冻干法替代酒精/二甲苯法脱水,以期在LCM操作过程中提高切片上噬菌体的存活率。LCM法分离摄取骨肉瘤切片上的肿瘤靶细胞,转染回收这些细胞上特异结合的噬菌体。滴定法检测所筛选的噬菌体对特异性细胞的亲和力。结果利用LCM技术,可以由肿瘤冰冻切片上收集到足够的与特异性噬菌体短肽,应用于噬菌体表面呈现肽库筛选。经过3轮筛选后所获得的噬菌体与人骨肉瘤组织的特异性亲和力提高16倍。结论本研究首次将LCM技术应用于噬菌体表面呈现肽库的筛选,可以使我们直接在新鲜人肿瘤组织中筛选与特定细胞群甚至单个细胞亲合的短肽;同时又避免了天然组织中其他杂质细胞的污染,为研制细胞特异性导向载体提供了一个新的途径。

噬菌体呈现技术在生物活体组织器官筛选中的应用

噬菌体呈现技术近年来得到了广泛的应用,靶标也由纯化的抗原、抗体等发展到病毒、活细胞,尤其是以正常活体组织器官及肿瘤组织血管作为靶标的亲和筛选,在动物体内的研究取得了可喜的进展,不久的将来有望进入临床辅助诊断及靶向化疗。

亲环素A抗原表位氨基酸序列及三维结构研究

目的 :研究人抗亲环素 A(Cy PA) Mc Ab D4识别的抗原表位的氨基酸组成及其在蛋白分子上的三维定位。 方法 :以抗人亲环素 A Mc Ab D4作捕获抗体 ,对噬菌体展示肽库进行淘筛 ,并对筛选出的噬菌体中插入片段进行 DNA序列测定和氨基酸序列分析 ,再用 Ras Mol蛋白质三维结构分析软件在亲环素 A分子的三维结构中查找相应的抗原表位。 结果 :经过三轮淘筛和扩增 ,选择 7个克隆进行序列测定 ,其中 5个克隆共有一致氨基酸序列WSL QSFL。与人 Cy PA一级结构比较未找到同源序列 ,提示该抗原表位是构象性的。用 Ras Mol蛋白质三维结构分析软件在亲环素 A分子的三维结构中 ,找到由 W12 1、S99、L 98、Q111、S110、F112、L 12 2构成的疏水袋状结构 ,可能就是 Mc Ab D4的抗原表位。 结论 :人亲环素 A分子上 W12 1、S99、L 98、Q 111、S110、F112、L 12

亲环素A抗原表位在三维结构中的初步定位

以抗人亲环素A单克隆抗体D4作捕获抗体 ,用噬菌体展示文库鉴定出亲环素A模拟抗原表位的氨基酸序列为WSLQSFL ,在亲环素A的一级结构中没有相同的序列 ,提示亲环素A抗原表位为构象型的 .亲环素A的三维空间结构已测定 ,利用RasMol等蛋白质三维结构观察软件 ,可以初步确定亲环素A的抗原表位的空间位置 。

噬菌体呈现技术在肿瘤研究中的应用

随着噬菌体呈现技术的日益广泛应用 ,其在肿瘤的研究中也发挥了越来越大的作用。用于生物淘筛的靶标包括肿瘤相关抗原、各种肿瘤相关生长因子、受体、酶类及肿瘤细胞、肿瘤组织血管等。通过此技术也发现了一些肿瘤组织特有的分子标识物 。

微囊藻毒素纳米抗体的制备及其间接竞争酶联免疫分析方法的建立

微囊藻毒素(MC)作为肝毒性最强的藻毒素之一,在受污染的水体中时常检出,严重威胁着人畜饮水安全,加强其检测十分重要。在前期研究中,已成功构建抗MC-LR噬菌体展示纳米抗体文库。本研究以MC-LR-OVA作为包被原,经4轮固相淘筛,获得纳米抗体M110。该抗体可识别MC-LR,且具有良好的稳定性。基于纳米抗体M110建立了检测MC-LR的间接竞争酶联免疫分析法(ic-ELISA),检测的半抑制浓度IC50值为3.55 ng/mL,检测限0.65 ng/mL,线性范围1.28~9.88 ng/mL。与UPLC-MS/MS方法检测结果相关系数达0.998,提示本方法可用于水体中微囊藻毒素残留的检测。

旅游地前驱性与应对性市场细分的技术研究

本文基于对旅游地市场细分的意义，在分析了旅游目的地市场细分的要求、前驱性（Proactive）和应对性（Reactive）市场细分的内涵与依据的基础上，研究了旅游目的地市场细分的集群细分、感知细分和数据筛淘细分的三个市场细分技术。