深黄被孢霉M_(6-22) Δ~6-脂肪酸脱氢酶基因在酿酒酵母中的表达

应用PCR技术 ,从含有深黄被孢霉Δ6 脂肪酸脱氢酶基因的重组质粒pTMICL6中 ,扩增出 1 38kb的目的片段 ,亚克隆到大肠杆菌和酿酒酵母的穿梭表达载体pYES2 .0 ,在大肠杆菌中筛选到含有目的基因的重组质粒pYMID6,用醋酸锂方法转化到酿酒酵母的缺陷型菌株INVSc1中 ,在SC Ura合成培养基中 ,选择到酵母工程株YMID6。在合适的培养基及培养条件下 ,加入外源底物亚油酸 ,经半乳糖诱导后 ,收集菌体。通过GC MS对酵母工程株所含的全部脂肪酸进行色谱分析 ,结果表明 ,γ 亚麻酸的含量占酵母总脂肪酸的 8 69%。

深黄被孢霉Δ~6-脂肪酸脱氢酶基因在大豆中的表达

为在传统的油料作物大豆中产生γ 亚麻酸 ,从深黄被孢霉中克隆的Δ6 脂肪酸脱氢酶基因与植物表达载体pBI12 1连接 ,构建了重组质粒pBMICL6 ,采用农杆菌介导的大豆子叶节转化系统成功的将该基因导入到栽培大豆吉林 35、吉林 4 3、吉林 4 7、绥农 10、绥农 14和黑农 37等品种中 ,获得一批转基因植株。经PCR检测和Southern杂交分析 ,证明外源基因已导入并整合到大豆的基因组中。Northern杂交结果表明该基因在转基因大豆的mRNA水平上获得表达。对转基因大豆种子进行脂肪酸成分分析 ,结果表明Δ6 脂肪酸脱氢酶基因获得表达 ,产生了γ 亚麻酸 ,其含量最高可达 2 7 0 6 7% ,这是国内外深黄被孢霉Δ6

深黄被孢霉△~6-脂肪酸脱氢酶基因的克隆及序列分析

γ－亚麻酸（ＧＬＡ，Ｃ１８：３△６，９，１２）是由△６－脂肪酸脱氢酶以亚油酸（ＬＡ，Ｃ１８：２△９，１２）为底物，在Ｃ６位脱氢形成的。由于在人体中，γ－亚麻酸是花生四烯酸、前列腺素类和白三烯类等生理活性物质的前体物，而深黄被孢霉是目前用于微生物发酵生产γ－亚麻酸的主要菌株。本文根据脂肪酸脱氢酶的保守区设计引物，利用反转录聚合酶链式反应从丝状真菌深黄被孢霉中克隆了编码△６－脂肪酸脱氢酶的ｃＤＮＡ，全长为１３７４个核苷酸，编码４５７ 个氨基酸，但与其他位点的脂肪酸脱氢酶不同的是， △６－脂肪酸脱氢酶在其序列的 Ｎ 端特有细胞色素 ｂ５（Ｃｙｔｂ５）区。这是国际上对深黄被孢霉△６－脂肪酸脱氢酶基因的首次报道。

以潮霉素B抗性为选择标记的深黄被孢霉原生质体转化

利用亚硝基胍（MNNG）诱变方法筛选了一株深黄被孢霉潮霉素B敏感型菌株M6-22-4。采用PEG介导的方法,将含有E.coli潮霉素B抗性标记的PD4质粒转入敏感株M6-22-4原生质体,并在潮霉素B浓度为400μg/mL的选择培养基上筛选转化子,获得了1.6~2.8个转化子/μg质粒DNA的转化频率。稳定性实验表明,质粒线性化后所获得的转化子在PDA培养基上传代10代以后,转接到选择平板上有31.6%仍具有HmB抗性;随机挑选了3个转化子,通过PCR方法检测到潮霉素抗性基因的存在,Southern杂交发现,潮霉素抗性基因已经以1-2拷贝数整合到深黄被孢霉M6-22-4染色体上,这是深黄被孢霉转化系统的首次报道。

深黄被孢霉生物转化十六醇合成油脂的研究

Mortierella isabellina was found to accumulate lipid with 2% hexadecanol and 1% yeast extract as the growth substrates. The amount of lipid reached 64.5% of dry mycelia, and unsaturated acids accounted for 97.05% of the total fatty acids. Mean while, 75% of hexadecanol in medium was converted to lipid. The biosynthetic route from hexadecanol to linoleic acid was presumed as follows: HexadecanolC18∶0（Steric acid）C18∶1（Oleic acid）C18∶2（Linoleic

提高深黄被孢霉菌丝细胞油脂合成总量及其不饱和脂肪酸酯含量的研究

葡萄糖的添加方式对深黄被孢霉（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌａｉｓａｂｅｌｉｎａ）Ｍ０１８菌株细胞油脂的生物合成影响显著，葡萄糖流加（３０ｈ）培养所得菌体细胞油脂含量达８０．５％，比消前一次性加入培养所得菌体细胞油脂含量提高了１７．２％。Ｚｎ２＋可显著提高油脂的碘值，但对细胞油脂合成总量影响甚微。柠檬酸钠有利于菌丝细胞生长，但不利于油脂的生物合成。培养温度在２０～２５℃之间适合菌丝细胞的生长，也有利于细胞合成油脂，低温有利于不饱和脂肪酸酯的合成。Ｍ０１８菌株将葡萄糖转化合成油脂的同时，菌丝细胞形态发生显著改变，丝状细胞逐渐膨大呈球形或椭圆形。以乙醇和正已烷对菌体进行分步抽提，油脂得率最高。

深黄被孢霉Δ~6-脂肪酸脱氢酶基因在转基因烟草中的表达

γ 亚麻酸 (GLA)是人体和动物饮食中具有营养作用的重要的多烯不饱和脂肪酸 ,在大多数油料作物种子中不含有GLA ,而只含有其前体物亚油酸 ,只有少数油料植物种子中含有GLA ,如夜来香 (Oenotheraspp) ,琉璃苣(Boragoofficinalis)等。Δ6 脂肪酸脱氢酶可将亚油酸转化为γ 亚麻酸 ,为了能够在传统的油料作物种子中产生GLA ,我们将从深黄被孢霉中克隆的Δ6 脂肪酸脱氢酶基因 ,与植物表达载体pGA6 43连接 ,构建了重组质粒pGAMICL6 ,将其通过农杆菌介导法 ,导入模式植物烟草中。经PCR和Southern杂交分析表明该基因已导入并整合到烟草的基因组中 ,Northern杂交结果表明该基因在转基因烟草的mRNA水平上获得表达。对转基因植株进行脂肪酸分析 ,结果显示 ,GLA和十八碳四烯酸 (OTA)分别占总脂肪酸含量的 19 7%和 3 5 %。

深黄被孢霉菌粉营养价值和调节血脂作用的研究

目的 : 分析深黄被孢霉菌粉 (菌粉 ,Mortierella isabellina)的一般营养成分及其对大鼠脂代谢紊乱的预防和调节作用。方法 : 菌粉一般营养成分分析按食品常规分析方法。对大鼠脂代谢紊乱的预防试验采用高脂饲料加不同剂量菌粉喂养 1 0 d;对脂代谢紊乱的调节试验先建立大鼠高脂血模型 ,再以不同剂量菌粉饲喂 30 d。结果 : 菌粉含有 2 0 %的蛋白质和超过 5 0 %的油脂 ,蛋白质中必需氨基酸含量非常丰富 ,而油脂中含有很高的亚油酸和亚麻酸等必需脂肪酸 ;菌粉还含有较高的有益微量元素和维生素 E。以 0 .6和 1 .2 g/( kg· d)剂量饲喂大鼠可有效预防 TG、VLDL- C升高 ;以 0 .6、1 .2、2 .4g/( kg· d)三个剂量饲喂的高血脂大鼠的 TG、TC及 VLDL- C都有极显著的下降 ,2 .4g/kg和 1 .2 g/kg剂量组大鼠的 LDL- C也有显著的下降 ,2 .4g/kg剂量组大鼠的 HDL- C水平还有显著的上升。结论 : 菌粉能有效地预防高脂血症 ,对大鼠脂代谢紊乱具有显著的调节作用。

深黄被孢霉△~6-脂肪酸脱氢酶基因导入大豆

采用农杆菌介导的大豆子叶节转化系统成功地将深黄被孢霉△6 -脂肪酸脱氢酶基因导入大豆。从发芽 5 - 7d的大豆无菌苗切取子叶节外植体 ,经农杆菌浸染和共培养后 ,在含 5 0mg L卡那霉素的选择培养基上培养 2 - 4w后 ,从子叶节处诱导出抗性不定芽。将不定芽转移到伸长培养基上 ,4 - 6w后长至 2 - 3cm高的再生苗。再将再生苗切下转入生根培养基 ,2 - 6w生根。生根后的再生植株经逐步锻炼移入花盆中 ,部分移栽成活的T0 植株能正常开花结荚。从T0 植株上收获T1 种子 ,按株系种植。T0 和T1 代经PCR检测和DNA分子杂交分析 。

丝状真菌深黄被孢霉RNA的提取方法

本文在一步法的基础上，提出了一种适合于富含RNase和多糖的丝状真菌的RNA提取方法。该方法可得到完整、均一的RNA样品，且简化了操作，同时建立起一套快速有效的RNA样品质量检验的方法。

深黄被孢霉的化学诱变

以深黄被孢霉为出发菌 ,通过硫酸二乙酯 (DES)诱变 ,获得优化的变异菌株 XM-1 .经初筛、复筛及传代实验 ,表明其是稳定的变异株 .变异株 XM-1在 2 8℃下 ,发酵 1 2 0 h后 ,菌体生物量为 1 5 .1 g/L ,油脂量为 7.5 g/L .与原始菌相比 ,生物量、油脂量分别提高了43.8%和 47% .

深黄被孢霉高产花生四烯酸菌株的微波诱变育种

为获得生长活力较强、产ARA能力强的菌株,以干菌重、微生物油脂产量和花生四烯酸(ARA)产量为评价指标,采用两轮微波诱变的方法,利用单因素试验确定微波累计加热时间,并采用气相色谱分析ARA含量。试验结果表明:微波频率为高档,累计加热时间为35 s,其致死率为78.3%。经过两轮微波诱变及菌种筛选,获得一株高产菌株W35s2-153,其生物量为30.85 g/L,总油脂含量为15.5 g/L,ARA质量浓度为2.61 g/L,ARA产量比原始对照菌株提高3.18倍,并且遗传性能稳定。

向大豆导入深黄被孢霉△^6—脂肪酸脱氢酶基因的初步研究

通过农杆菌介导法 ,将深黄被孢霉△6-脂肪酸脱氢酶基因导入到栽培大豆吉育 4 3、黑农36、黑农 37等品种。采用多种外植体和感染方法 ,从子叶节和胚轴诱导出丛生芽与再生植株。经过在含 5 0mg L卡那霉素的筛选培养基中连续筛选 ,获得一批转基因植株。经PCR检测和DNA分子杂交分析 ,初步证明外源基因已导入并整合到大豆基因组中。

利用深黄被孢霉发酵生产油脂的初步研究

为提高微生物油脂产量,以产油微生物深黄被孢霉为试验菌株,采用单因素试验设计,通过摇瓶培养,研究了产脂培养基中碳源、氮源种类及其浓度、接种量、初始pH值、无机盐离子对菌体生长和油脂积累的影响,确定了深黄被孢霉摇瓶发酵产油脂的优化培养条件为：葡萄糖100 g.L-1,酵母粉3.0 g.L-1,接种量为20%,pH值为5.0-6.0,硫酸镁（MgSO4.7H2O）0.5 g.L-1,磷酸二氢钾（KH2PO4）2.0 g.L-1。在优化培养条件下菌体生物量为20.62 g.L-1,油脂含量为43.02%,油脂产量为8.87 g.L-1。

Co^(60)辐射诱变深黄被孢霉高产多不饱和脂肪酸突变株的选育

用丝状真菌深黄被孢霉发酵生产多不饱和脂肪酸,利用Co60对其进行诱变育种,经筛选,选育出一株含油率高的2W15-2W2-22菌株,其发酵生物量为12.5 g菌体／L发酵液,含油率51.85％,其油脂脂肪酸组成中γ-亚麻酸为8.5％,花生四烯酸为3.2％。

UV、LiCl复合诱变深黄被孢霉选育多不饱和脂肪酸高产菌株

以深黄被孢霉(Mortierellaisabellina)AS3.2793为出发菌株,利用紫外线和LiCl复合诱变处理,反复多次,最终选育出一支突变株MUI0310。其摇瓶发酵8d时,生物量和总脂含量分别达21.80g/L,61.47%,在同等条件下比出发菌株分别提高了107.62%和5.50%,气相色谱分析其油脂组成,多不饱和脂肪酸含量为23.21%。连续传代多次,其产量性状无显著变化。发酵实验表明菌株MUI0310极有潜力改良成为工业化生产菌种。

多不饱和脂肪酸与深黄被孢霉低温适应性的关系(英文)

低温生长的适应是一个复杂的过程,涉及细胞的分子生物学和生物化学等很多方面.前期的研究表明,产油真菌——深黄被孢霉（Mortierella isabellina）M6-22能在5-35℃的温度范围生长.本研究以其为研究对象,分析温度下降引起的M6-22细胞膜流动性、多不饱和脂肪酸含量以及多不饱和脂肪酸合成相关基因的mRNA转录水平的变化.结果显示,在15℃条件下,M6-22的细胞膜流动性明显降低,而多不饱和脂肪酸含量显著提高,由30℃时20.85%增加到15℃时的31.04%,而且15℃时Δ^12-脂肪酸脱氢酶基因mRNA转录水平提高了近3倍,但是Δ^6-脂肪酸脱氢酶基因mRNA转录水平基本不变.这些研究结果表明,深黄被孢霉M6-22可能通过提高Δ^12-脂肪酸脱氢酶基因的表达水平,增加膜脂中多不饱和脂肪酸含量,维持低温条件下细胞膜的流动性来促进细胞低温环境的适应.本研究将为研究低温条件下多不饱和脂肪酸合成调节机制以及进一步多不饱和脂肪酸工业化生产打下基础.

深黄被孢霉产脂的研究

深黄被孢霉在限制氮源的情况下培养，其生物量得到了显著提高，达到35．9g／L，葡萄糖利用率也大大增加，甚至培养基中葡萄糖起始浓度可以达到100g／L。氮源耗尽后，菌体中重要的脂肪酸得到积累，其油脂含量为50％～55％，微生物油脂产量为18．0g／L产脂培养基。每消耗1g葡萄糖，总的生物量增加0．34g，干菌体中的油脂含量增加0．17g。油脂中的γ-亚麻酸含量为3．5％左右，即16～19mg／g干菌体，最多的甚至可以达到0．801g／L发酵培养基。

深黄被孢霉高产花生四烯酸菌株的紫外诱变原生质体育种

【目的】为了获得一株生长活力较强,产花生四烯酸能力强的菌株。【方法】我们以干菌重、微生物油脂产量和花生四烯酸产量为评价指标,采用紫外线诱变原生质体的方法。我们利用单因素实验确定了紫外线诱变剂量,并采用气相色谱分析了花生四烯酸含量。【结果】试验结果表明:紫外灯功率20 W,照射距离30cm,照射时间40 s,其致死率为79.5%。【结论】经过诱变及菌种筛选所获得高产菌株YZ-124的生物量为36.5 g/L,微生物油脂含量为19.2 g/L,花生四烯酸含量为4.72 g/L,花生四烯酸产量比出发菌株AS3.3410提高576%,并且遗传性能稳定。

γ-亚麻酸生产菌深黄被孢霉原生质作的形成和再生

采用2％的溶壁酶加4％的蜗牛酶，从深黄被孢霉的菌丝中获得了大量的原生质体。同时对菌丝的培养时间、渗透压稳定剂、酶解系统和酶解温度等因素进行了系统的观察，从而获得了制备深黄被孢霉原生质体的最适条件。并对该原生质体在高渗培养基上进行了再生实验，其再生率为32％。