RIP1、MLKL蛋白在未分化甲状腺癌中的表达及临床意义

目的探讨受体相互作用蛋白激酶1(RIP1)、混合系激酶区域样蛋白(MLKL)在未分化甲状腺癌(ATC)中的表达及其临床意义。方法选取48例ATC患者为研究对象,检测手术标本组织中RIP1、MLKL的表达,收集患者临床病理参数并随访,统计分析RIP1、MLKL在ATC组织标本中的表达模式及对患者预后的影响。培养人未分化型甲状腺癌THJ-11T、THJ-16T、THJ-21T、ASH-3、BHT101细胞系、分化型甲状腺癌细胞系CAL-62、PDTC-1、正常人甲状腺细胞系Nthy-ori 3-1、HTORI-3,利用Western blot法及RT-PCR检测细胞系中RIP1、MLKL的蛋白mRNA的表达水平。结果(1)RT-PCR及Western blot检测显示,与正常人甲状腺细胞系及分化型甲状腺癌细胞系相比,未分化甲状腺癌细胞系中RIP1、MLKL蛋白和mRNA相对表达水平明显更高。(2)48例ATC患者中,14例起源于乳头状甲状腺癌(PTC),34例起源于滤泡状甲状腺癌(FTC)。肿瘤细胞表现出明显的多形性。形态学特征包括梭形细胞为主的肉瘤样及鳞状细胞样。(3)免疫组化染色显示,RIP1表达主要定位于ATC细胞膜。48例ATCs中有24例(50.0%)RIP1染色阳性。组织中含有混合岛状或低分化癌成分。MLKL阳性细胞核表达清晰,48例ATC患者中有29例(60.4%)患者MLKL染色阳性。(4)Kaplan-Meier生存分析显示,RIP1和MLKL过度表达会缩短ATC患者的无病生存期(DFS)(P<0.05),但对患者的总体生存率(OS)无明显影响(P>0.05)。Cox多因素分析显示,RIP1高表达、MLKL高表达、N分期、M分期均是影响ATC患者DFS的独立性危险因素(P<0.05)。结论RIP1、MLKL高表达与ATC的发生及DFS密切相关,或可作为ATC潜在的治疗靶点及预后预测的生物学标记物。

芍药苷调节RIP1/RIP3/MLKL信号通路对慢性结肠炎大鼠坏死性凋亡的影响

目的:探究芍药苷(PAE)调节受体相互作用蛋白1(RIP1)/受体相互作用蛋白3(RIP3)/混合系激酶区域样蛋白(MLKL)信号通路对慢性结肠炎大鼠坏死性凋亡的影响。方法:取健康SD大鼠随机分组,每组6只,包括对照组(Control组)、模型组(Model组)、药物低、中、高剂量灌胃7d处理组(1.25g·kg^(-1)·d^(-1)PAE-L组、2.5g·kg^(-1)·d^(-1)PAE-M组、5g·kg^(-1)·d^(-1)PAE-H组)和高剂量芍药苷灌胃7d+尾静脉注射7d RIP1激活剂组(5g·kg^(-1)·d^(-1)PAE-H+1.5mg·kg^(-1)·d^(-1)Z-VAD-fmk组)。建立慢性结肠炎模型,造模成功后,大鼠眼眶采血,取其结肠黏膜组织,用HE染色观察结肠组织形态;分析结肠黏膜组织损伤指数(CMDI)评分;用TUNEL检测试剂盒检测结肠组织细胞凋亡;用免疫组化检测结肠组织中基质金属蛋白酶(MMP-1、MMP-2)表达;用ELISA法检测大鼠血清炎症因子(IL-6、TNF-α)水平;用免疫印迹法检测结肠组织中RIP1/RIP3/MLKL通路蛋白表达。结果:与Control组相比,Model组结肠黏膜组织糜烂、水肿,出现炎性细胞浸润,CMDI评分、细胞凋亡率、IL-6、TNF-α水平上升,MMP-1、MMP-2、p-RIP1/RIP1、p-RIP3/RIP3、p-MLKL/MLKL蛋白表达上调(P<0.05);与Model组比较,PAE-L、PAE-M、PAE-H组结肠黏膜组织炎症细胞浸润逐渐减少,CMDI评分、细胞凋亡率、IL-6、TNF-α水平降低,MMP-1、MMP-2、p-RIP1/RIP1、p-RIP3/RIP3、p-MLKL/MLKL蛋白表达下调(P<0.05);与PAE-H组相比,PAE-H+Z-VAD-fmk组结肠黏膜组织炎症加重,CMDI评分、细胞凋亡率、IL-6、TNF-α水平升高,MMP-1、MMP-2、p-RIP1/RIP1、p-RIP3/RIP3、p-MLKL/MLKL蛋白表达上调(P<0.05)。结论:芍药苷能够抑制RIP1/RIP3/MLKL信号通路缓解慢性结肠炎大鼠坏死性凋亡。

坏死性凋亡在奶牛乳房炎源性无乳链球菌诱导bMECs炎性反应中的机制研究

奶牛乳房炎是牧场最常见的疾病之一,无乳链球菌引发的奶牛乳房炎在发达国家和我国的流行率逐年上升。假激酶混合谱系激酶样蛋白(MLKL)是细胞坏死性凋亡的关键信号蛋白,当MLKL被磷酸化激活后,可易位至细胞膜并诱导膜透化,从而导致坏死性凋亡。为了探究MLKL介导的坏死性凋亡在无乳链球菌诱导奶牛乳腺上皮细胞(bMECs)炎性反应中的分子机制,本试验通过构建无乳链球菌C28和B19菌株感染bMECs的体外模型,采用Annexin V-FITC/PI双染法、Western blot试验、免疫荧光和酶联免疫吸附试验对凋亡、坏死、坏死性凋亡和炎性指标进行检测。结果显示,与感染0 h相比,C28和B19菌株感染9 h时bMECs凋亡细胞数量开始下降,坏死细胞数量增多,丝氨酸/苏氨酸激酶3(RIPK3)和磷酸化假激酶混合谱系激酶样蛋白(p-MLKL)表达量显著升高(P<0.05或P<0.01),含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-8(Caspase-8)表达量显著降低(P<0.05),表明无乳链球菌诱导bMECs死亡的方式为程序性坏死。无乳链球菌诱导bMECs中大量MLKL定位至线粒体,p-MLKL向细胞膜转位。与C28和B19菌株感染组相比,沉默MLKL基因可显著降低p-MLKL表达量(P<0.05),表明MLKL参与无乳链球菌诱导的bMECs程序性坏死。与C28和B19菌株感染组相比,沉默MLKL基因可显著降低无乳链球菌诱导的bMECs中核苷酸结合寡聚化结构域样受体热蛋白结构域相关蛋白3(NLRP3)、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-1(Caspase-1)和含半胱天冬酶募集结构域表达的凋亡相关斑点样蛋白(ASC)的表达量(P<0.05),极显著降低TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-18的释放量(P<0.01,P<0.001或P<0.000 1)。结果表明,MLKL作为无乳链球菌诱导bMECs引发坏死性凋亡的执行蛋白,可激活bMECs中NLRP3炎性小体信号通路,最终促进炎性反应的发生。

化浊解毒方对慢性萎缩性胃炎大鼠Hippo信号通路相关蛋白RASSF1A、SAV1、MST2表达的影响

目的观察化浊解毒方对慢性萎缩性胃炎(CAG)大鼠Hippo信号通路哺乳动物不育系20样激酶2(MST2)、RAS相关区域家族亚型A(RASSF1A)、含WW结构域的人同源重组蛋白1(SAV1)表达的影响,探讨其可能的作用机制。方法采用联合造模法制备CAG大鼠模型,成模大鼠随机分为模型组、维酶素组和化浊解毒方高、中、低剂量组,每组10只,同时设正常组10只。正常组和模型组给予蒸馏水灌胃,维酶素组给予维酶素混悬液灌胃,化浊解毒方高、中、低剂量组给予相应剂量药液灌胃,连续12周。HE染色观察大鼠胃黏膜组织病理变化,RT-qPCR和Western blot分别检测大鼠胃黏膜组织RASSF1A、SAV1、MST2 mRNA和蛋白的表达。结果与正常组比较,模型组大鼠胃黏膜组织RASSF1A、SAV1、MST2 mRNA和蛋白表达明显降低(P<0.05);与模型组比较,化浊解毒方高、中剂量组和维酶素组大鼠胃黏膜组织RASSF1A、SAV1、MST2 mRNA和蛋白表达均明显升高(P<0.05),其中化浊解毒方高剂量组升高最明显。结论化浊解毒方具有干预CAG大鼠和延缓癌变进展的作用,其机制可能与上调模型大鼠抑癌基因RASSF1A、SAV1、MST2的表达相关。

坏死性凋亡经典通路在心血管疾病中的研究进展

坏死性凋亡作为一种程序性细胞死亡,参与了动脉粥样硬化、心肌缺血再灌注、心肌梗死、心力衰竭等多种心血管疾病的病理生理过程。综述坏死性凋亡经典通路受体相互作用激酶1(RIP1)-受体相互作用激酶3(RIP3)-底物混合谱系激酶样蛋白(MLKL)的分子机制、抗坏死性凋亡相关治疗药物及这一通路在常见心血管疾病中的研究进展。为探寻新的治疗方式、降低心血管疾病的死亡率、改善心血管病人的预后提供参考。

程序性坏死在非酒精性脂肪性肝病发病中的研究进展

非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)已逐渐取代乙型病毒性肝炎(viral hepatitis B,HBV)成为进展性肝病的主要病因。但NAFLD的发病机制涉及多种理论研究,目前尚无定论。程序性坏死(necroptosis)是细胞生理活动中关键的一环,在NAFLD的进展中具有举重若轻的作用。因此本文就程序性坏死的发生、调控及与NAFLD的作用进行概述,为NAFLD的治疗方案提供新的思路。

汉黄芩素对慢性阻塞性肺疾病模型大鼠气道炎症的影响及机制

目的研究汉黄芩素(Wog)对慢性阻塞性肺疾病(COPD)模型大鼠气道炎症的影响及可能机制。方法将84只大鼠按随机数字表法分为对照组,模型组,Wog低、高剂量组(灌胃给药,50、100 mg/kg),氨茶碱组(阳性对照,灌胃给药,2.3 mg/kg),重组大鼠受体相互作用蛋白激酶1[rRIPK1,受体相互作用蛋白激酶1(RIPK1)激活剂]组(尾静脉注射给药,8μg/kg),Wog高剂量+rRIPK1组(灌胃100 mg/kg Wog并尾静脉注射8μg/kg rRIPK1),每组12只。除对照组外,其余各组大鼠均利用烟熏联合气管注射脂多糖的方法构建COPD模型。建模24 h后,进行给药处理;每天给药1次,持续4周。末次给药后,测定各组大鼠的吸气峰流量(PIF)、呼气峰流量(PEF)、每分钟通气量(MV)和第1秒用力呼气容积(FEV_(1))/用力肺活量(FVC)比值,测定大鼠血清中白细胞介素1β(IL-1β)、IL-6、肿瘤坏死因子α(TNF-α)水平,观察大鼠肺组织病理形态学变化,测定大鼠肺上皮细胞凋亡率,并测定大鼠肺组织中RIPK1、RIPK3、混合系激酶区域样蛋白(MLKL)mRNA和RIPK1、RIPK3、磷酸化MLKL(p-MLKL)蛋白表达水平。结果与对照组比较,模型组大鼠PIF、PEF、MV、FEV_(1)/FVC比值显著降低(P<0.05),IL-1β、IL-6、TNF-α水平显著升高(P<0.05),肺组织有大量炎症细胞浸润、支气管壁增厚,肺上皮细胞凋亡率及RIPK1、RIPK3、MLKL mRNA和RIPK1、RIPK3、p-MLKL蛋白表达水平也显著升高(P<0.05)。与模型组比较,Wog低、高剂量组大鼠上述指标均显著改善(P<0.05),病理损伤明显减轻;而rRIPK1组大鼠对应指标却显著恶化(P<0.05),病理损伤也进一步加重;并且,rRIPK1可明显减弱高剂量Wog对COPD大鼠气道炎症和RIPK1/RIPK3/MLKL通路的抑制作用(P<0.05)。结论Wog可能通过抑制RIPK1/RIPK3/MLKL信号通路改善COPD大鼠的气道炎症。

炎症性肠病中的坏死性凋亡:一个潜在的治疗靶点

炎症性肠病(inflammatory bowel diseases,IBD)的发病率近年来呈快速上升趋势,目前尚无有效的方法防止其复发。程序性细胞死亡对维持内环境稳态至关重要。坏死性凋亡作为一种新发现的程序性细胞死亡方式,其在IBD中的作用值得探讨。坏死性凋亡由受体相互作用蛋白激酶1(receptor interacting protein kinase 1,RIPK1)、RIPK3和混合系激酶区域样蛋白(mixed lineage kinase domain-like protein,MLKL)介导,导致细胞肿胀、质膜破裂、细胞内容物流出,继而引起细胞死亡并促进炎症的发生。研究发现IBD患者病变标本的坏死性凋亡水平升高,在IBD动物模型中抑制坏死性凋亡能够减轻炎症程度,表明坏死性凋亡与IBD的发病机制相关。然而,由于细胞坏死性凋亡调控的复杂性及其相关信号分子功能的多样性,其具体机制仍未明确。坏死性凋亡在IBD的发病过程中可能发挥了重要的调控作用,为进一步探究IBD的治疗靶点提供了新的思路和方法。

程序性坏死诱导剂抗肿瘤作用研究进展

程序性坏死,是一种不依赖于Caspase的细胞死亡方式,主要由受体相互作用蛋白激酶1(RIPK1)、受体相互作用蛋白激酶3(RIPK3)和混合系激酶区域样蛋白(MLKL)介导。近年研究表明,程序性坏死具有促进和抑制肿瘤生长的双重作用,通过调控程序性坏死可以影响肿瘤的发展。许多能够诱导程序性坏死的药物显示出潜在的抗肿瘤活性。此外,诱导程序性坏死还是克服肿瘤凋亡耐受的有效途径。本文概述了程序性坏死的相关机制及其与肿瘤之间的关系,重点介绍通过诱导程序性坏死而产生抗肿瘤作用的药物,包括天然产物、化疗药物、死亡受体配体、激酶抑制剂、无机盐、金属配合物和金属纳米颗粒等,以期为肿瘤尤其是凋亡耐受肿瘤的治疗提供新的思路。

细胞程序性坏死在急性肺损伤中作用的研究进展

程序性坏死作为一种新的细胞程序性死亡方式参与急性肺损伤(acute lung injury,ALI)的病理过程,主要在疾病前期由各类高危因素触发,由受体相互作用蛋白激酶1(receptor-interacting protein kinase 1,RIPK1)、RIPK3、混合谱系激酶结构域样蛋白(mixed-lineage kinase domain-like protein,MLKL)介导,导致肺泡上皮细胞、血管内皮细胞、肺泡巨噬细胞等细胞死亡,直接或通过调节机体炎症反应造成严重的肺泡结构损伤及肺水肿,应用抑制剂阻断程序性坏死可以减轻肺损伤。本文就程序性坏死在ALI中的作用进行综述,以期为临床筛选高危患者和治疗提供依据。

程序性细胞坏死参与急慢性损伤脑内神经元死亡的研究进展

程序性细胞坏死是一种新发现的细胞死亡形式。这类死亡细胞形态类似坏死,而其死亡过程受胞内主动机制的调节,由此改变了坏死细胞不受内在机制调控的经典概念。当细胞膜上死亡受体与其配体结合,细胞内凋亡因子caspase-8被抑制时,激活受体相互作用蛋白(receptor interaction protein,RIPK1/RIPK3)激酶及关键底物——混合谱系激酶结构域样蛋白(mixed lineage kinase domain-like protein,MLKL)的信号通路,从而触发细胞发生程序性细胞坏死。后者参与多种疾病的病理过程,如肿瘤、免疫炎症、神经退行性疾病、脑缺血损伤等。本文就程序性细胞坏死的信号通路、重要调控分子及在神经损伤相关疾病致病机制进行综述,并对研究方法和分析工具药物进行了归纳总结。

基于RIPK1/RIPK3/MLKL信号通路探讨当归补血汤对糖尿病肾病大鼠足细胞损伤的影响

目的:观察当归补血汤对糖尿病肾病(DKD)大鼠足细胞损伤及受体相互作用蛋白激酶1/受体相互作用蛋白激酶3/混合系激酶区域样蛋白(RIPK1/RIPK3/MLKL)信号通路的影响,探讨其治疗DKD的可能作用机制。方法:50只SD大鼠随机选取8只设为正常组,其余大鼠6周高糖高脂饮食结合一次性腹腔注射链脲佐菌素(STZ)0.035 g·kg^(-1)制备2型糖尿病大鼠模型。模型制备成功后随机分为模型组,当归补血汤高、低剂量(1.44,0.72 g·kg^(-1))组,厄贝沙坦(0.017 g·kg^(-1))组。药物干预20周后检测各组大鼠空腹血糖(FBG),肾重指数(KI),尿微量白蛋白与尿肌酐比值(UACR);苏木素-伊红(HE)染色观察肾组织病理形态学变化;透射电镜观察足细胞超微结构变化;酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测大鼠肾组织肿瘤坏死因子-α(TNF-α),白细胞介素-6(IL-6)水平;免疫组化法检测大鼠肾组织RIPK1,RIPK3,MLKL蛋白表达;原位末端标记法(TUNEL)检测大鼠肾脏足细胞凋亡率;实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)检测大鼠肾组织RIPK1,RIPK3,MLKL mRNA表达水平;蛋白免疫印迹法(Western blot)检测大鼠肾组织RIPK1,RIPK3,MLKL蛋白及足细胞标志蛋白肿瘤蛋白-1(WT-1)表达水平。结果:与正常组比较,模型组大鼠FBG,UACR,KI显著升高(P<0.01),肾小球肥大,基底膜增厚,系膜外基质增多,系膜增生,足突融合或丢失,肾组织凋亡细胞明显增多,TNF-α及IL-6水平显著升高(P<0.01),WT-1蛋白表达水平显著降低,RIPK1/RIPK3/MLKL mRNA及蛋白表达水平显著升高(P<0.01);与模型组比较,当归补血汤高剂量组明显降低FBG,UACR,KI水平,明显改善肾组织病理学,减少足细胞的丢失,减少肾组织细胞凋亡,降低TNF-α及IL-6水平,升高WT-1蛋白表达水平,降低RIPK1/RIPK3/MLKL mRNA及蛋白表达水平(P<0.05,P<0.01)。结论:当归补血汤可能通过调控RIPK1/RIPK3/MLKL信号通路,改善足细胞损伤,从而延缓DKD的发展进程。

PI3K在肿瘤坏死因子诱导L929细胞程序性坏死过程中的调控作用研究

目的探讨磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol-3-kinase,PI3K)在肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor alpha,TNFα)诱导细胞程序性坏死过程中的调控作用与机制。方法利用慢病毒介导的RNA干涉技术构建PI3K催化亚基p110α敲低、RIP1敲低及RIP1与p110α双敲低的L929细胞株,Western印迹或RT-PCR验证敲低效果。同时,利用Western印迹检测AKT和混合系激酶区域样蛋白(MLKL)磷酸化及MLKL多聚化。流式细胞术和显微拍照术检测细胞死亡。结果 PI3K和AKT抑制剂及p110α敲低都可降低AKT磷酸化水平,并阻断TNFα诱导的L929细胞程序性坏死。敲低RIP1并不抑制TNFα与Z-VAD联合诱导的L929细胞程序性坏死,但这种RIP1非依赖性细胞程序性坏死能为p110α敲低抑制。此外,p110α敲低可抑制TNFα与Z-VAD联合诱导的MLKL活化及其介导的细胞程序性坏死。结论 PI3K是调控细胞程序性坏死的重要靶点,可通过RIP1依赖及非依赖性方式激活,进而活化AKT与MLKL,启动TNFα诱导的细胞程序性坏死。

干扰素γ和TRAIL联合对HaCaT细胞程序性坏死的影响及机制研究

目的观察干扰素γ(IFN-γ)和肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)联合对HaCaT人角质形成细胞程序性坏死的诱导作用,并探讨其作用机制。方法HaCaT细胞分为阴性对照组(不加药物处理)和实验组,实验组分别加入50μg/LIFN-γ(IFN-γ组)、4μg/LTRAIL(TRAIL组)、50μg/LIFN-γ+4μg/LTRAIL(细胞因子联合组),或40μmo/LzVAD预处理1h后同时加入50μg/LIFN-γ及4μg/LTRAIL(zVAD联合组)。作用48h后,光镜下观察细胞形态,噻唑蓝法检测药物对细胞的增殖抑制作用,双染色法流式细胞仪检测细胞坏死情况,qPCR检测RIP3、MLKLmRNA相对表达量,Western印迹检测细胞RIP1、RIP3、MLKL及其磷酸化蛋白等的表达,免疫荧光染色观察pRIP3、pMLKL在细胞中的表达分布,以2′,7′-二氯荧光素二乙酸酯为荧光探针检测各处理对细胞内活性氧产生的影响。采用SPSS22进行统计学分析,不同组间观察指标的变化采用单因素方差分析,两两多重比较采用LSD-t检验。结果细胞因子联合组及zVAD联合组作用48h后HaCaT细胞出现坏死样形态特征。噻唑蓝实验显示作用48h后,IFN-γ组、TRAIL组、细胞因子联合组、zVAD联合组、阴性对照组细胞存活率分别为73.16%±5.71%、81.46%±4,68%、72.18%±2.93%、69.67%±3.24%、100%,5组间差异有统计学意义(F=24,34,P<0.001)。细胞因子联合组、zVAD联合组细胞坏死率分别为9.86%±1.31%、10.33%±2.16%,均高于阴性对照组(5.26%±0.91%,t值分别为4.61、5.07.均P<0.05)。qPCR结果示,细胞因子联合组、zVAD联合组RIP3、MLKLmRNA表达水平明显高于阴性对照组(tRIP3分别为0.99、1.84,tMLKL分别为1.51、2.17.均P<0.05)。Western印迹结果示,与阴性对照组相比,细胞因子联合组RIP1、RIP3、MLKL及其磷酸化蛋白表达水平升高(均P<0.05),且zVAD预处理后caspase8水平下降,上述蛋白表达进一步升高。荧光显微镜示IFN-γ和TRAIL联合作用后,细胞质中可见强绿色点状或团块状荧光斑点(pRIP3),在细胞膜可见明显红色荧光斑点(pMLKL)。活性氧检测示细胞因子联合组平均荧光强度高于阴性对照组,t=702.00,P<0.05。结论IFN-γ和TRAIL可联合诱导HaCaT细胞程序性坏死,并伴有活性氧水平上升。