混合系白血病基因重排的检测方法及其临床意义

为了研究混合系白血病(MLL)基因重排在急性白血病(AL)中的发生率、融合基因类型及其临床意义,用荧光原位杂交技术检测60例急性白血病(AL)患者MLL基因重排,对于MLL基因重排阳性的患者,用巢式RT-PCR方法检测MLL基因重排形成的6种常见融合基因类型。结果表明:7例AL患者有MLL基因重排,发生率为11.67%,其中2例为急性髓细胞白血病M5(AML-M5),融合基因均为MLL/AF9;另5例为B细胞系急性淋巴细胞白血病(B-ALL),其中2例融合基因为MLL/ENL,1例MLL/AF4,2例未扩增出融合基因产物。结论:荧光原位杂交技术是检测ALMLL基因易位重排的快速、特异、灵敏的方法,巢式RT-PCR是检测MLL基因重排产生的融合基因类型的简便可行的方法;MLL基因重排的检测对急性白血病预后判断和治疗方案的选择具有重要意义。

混合系白血病全长基因在AML-M4/M5患者中的突变检测

急性髓系白血病(AML)-M4、M5常有11号染色体异常,定位于11q23的混合系白血病(MLL)基因异常所形成的MLL-PTD和MLL融合基因在该病的发病机理中具有重要作用。但在该类白血病绝大多数未能检测出染色体水平异常,是否存在MLL基因的其他突变?本研究对MLL全长基因的外显子进行了测序分析。选取25例初发核型正常的AML M4、M5患者(排除MLL融合基因和MLL-PTD及M4eo),进行了MLL全长基因的外显子PCR扩增直接测序分析,对发现的突变在基因组DNA水平进行验证。利用Mass Array方法在正常对照样本和AML扩大样本中对发现的点突变进行检测。结果发现,在MLL的RD、PHD、TAD和SET功能域中存在着高频的缺失、插入及多个点突变;同时对照研究正常样本,发现也存在上述的变异,且突变频率无统计学差别(P>0.05)。结论:检测到的MLL基因发生在mRNA水平的缺失、插入和多个点突变,分别是MLL在转录水平的选择性剪接和MLL的单核苷酸多态性,它们共同构成了MLL的遗传多态性;这些MLL基因遗传多态性可能与AML M4、M5的发病不直接相关,对于治疗、预后及其他生物学表型的意义还有待进一步探讨。

混合系白血病基因相关白血病骨髓细胞形态学特征

目的观察混合系白血病(MLL)基因相关白血病患者的骨髓细胞形态学特征,来明确混合系白血病基因的重排特征和FAB形态学分型之间的关系。方法用多重巢式的RT-PCR方法对300例白血病以及淋巴瘤的白血病关联融合基因进行检查,从中选择出现MLL基因异常白血病患者的骨髓细胞涂片后进行形态学观察,并对不同的形态进行比较。结果 300例患者中14例MLL基因重排,其中有9例FABM5型MLL/AF6融合基因,跟典型原始单核细胞白血病存在较多相同特征:细胞体积很大,细胞核折叠且染色体很疏松,核仁清晰,胞质毛玻璃状嗜碱性。大部分细胞核的旁边有明显的淡染区,胞浆中有细长奥氏小体和纤细染色体。经非特异脂酶染色之后呈阳性,可以被氟化钠抑制。12例MLLPTD,其中包括3例M1型,5例M4型,2例M5型,2例幼淋细胞白血病MLLPTD阳性。结论 MLL基因异常主要在和单核细胞关联的白血病中,发生MLL/AF6重排是急性原始单核细胞型白血病一种独立亚型的重要标志,融合基因和单核细胞的分化关系密切。

MLL基因重排在成人急性白血病中的检测和临床特征研究

混合系白血病(MLL)发生基因重排在成人急性白血病中相关研究较少。本研究通过3种技术组合检测MLL基因重排,探究其在成人急性白血病中的发生率、伙伴基因类型、伴MLL基因重排的急性白血病临床特征和预后并评估该组合检测的临床应用价值。对183例成人急性白血病患者采用常规细胞遗传学、分离信号FISH和多重巢式PCR 3种技术组合检测MLL基因重排。结果显示,成人急性白血病中MLL基因重排发生率低(8.2%);重排类型在急性淋巴细胞白血病(ALL)中MLL-AF4最常见,急性髓系白血病(AML)中MLL-AF6和MLL-AF9最常见;MLL基因重排患者髓外浸润占40%,诱导治疗30 d内完全缓解率33.3%,3个月复发率和6个月生存率各为50.0%和50.0%。结论:本研究中常规细胞遗传学技术对MLL基因重排的漏检率高达60%,因此常规细胞遗传学,分离信号FISH和多重巢式PCR结合检测MLL基因重排具有重要的预后意义和指导临床治疗价值。

婴儿白血病

婴儿白血病发病率在婴儿期恶性肿瘤中占第二位,常见的有急性淋巴细胞白血病(acute lymphocytic leukemia,ALL)及急性髓细胞白血病(acute myeloid leukemi,AML),各有自己的临床特点。混合系白血病基因重排为婴儿白血病特征,与婴儿白血病的发生、发展、治疗、预后密切相关。强化的联合化疗可提高生存率,但增加了非复发相关并发症的发生。高危病例可通过骨髓移植获得收益。目前新型药物,包括新型核苷酸类似物、去甲基化药物、基因靶向药物,已在临床或实验室阶段证明有效,对高危患儿通过进行异基因造血干细胞移植治疗可获得较长生存期。

MLL在HOXA10表达调控中作用的实验研究

目的通过研究在急性髓性白血病细胞中HOXA10表达调控机制,探讨HOXA10调控作为AML防治新靶点的可能性。方法以不同剂量雌二醇(E2)在不同时间点刺激急性粒细胞白血病细胞株(HL-60),以不刺激的HL-60细胞作参照应用RT-PCR检测HOXA10基因表达活性的差异明确E2对HOXA10表达的活化作用,并在E2刺激下以反义寡核苷酸转染技术分别敲除ERα、ERβ和MLLs(MLL1-4)后再检测HOXA10 mRNA和蛋白表达的变化确定哪一种雌激素受体的活化与HOXA10的表达相关,哪一种MLL对HOXA10表达有调控作用。以ChIP实验检测MLL和HOXA10的相互作用,再以Western blot检测E2刺激前后组蛋白H3K4甲基化状态以明确MLL是否通过表观遗传学途径调控HOXA10的表达。结果在E250 nmol/L 6 h刺激下HOXA10表达明显升高,ERα和ERβ反义寡核苷酸转染后HOXA10表达均有下降,MLL1表达沉默时HOXA10表达明显降低(P<0.05),MLL1可以结合到HOXA10启动子上的ERE区域而组蛋白H3K4甲基化状态在E2刺激后明显高于刺激前(P<0.05)。结论急性髓性白血病细胞的HOXA10基因表达受MLL1蛋白调控,可能为急性髓性白血病的致病机制分析提供了一个新的方向,MLL1介导的HOXA10表达的改变有可能成为急性髓性白血病的防治新靶点。

AFF4在人类HEL细胞中广泛地影响RNA聚合酶Ⅱ的停滞释放

在转录延伸过程中,P-TEFb激酶(由激酶CDK9和Cyclin T1组成的二聚体)是释放停滞的Pol Ⅱ这一步的关键调节因子。在人类细胞中,它可参与形成三个更大的复合体,即超级延伸复合体(super elongation complex,SEC)、BRD4/P-TEFb和7SKsnRNP,其活性在前两者中不被抑制,而在后者中被抑制。除P-TEFb外,SEC还含有AFF1或4、AF9或ENL、ELL1、2或3,EAF1或2等无酶活亚基,这些亚基被认为可通过P-TEFb影响转录延伸。本课题组前期的研究和其他实验室的研究工作均已表明AFF1、AF9和ENL亚基均可调控转录启始,但尚不清楚AFF4是否具有相似的功能。在调控基因表达的选择性方面,近期有研究表明BRD4/P-TEFb在人类结直肠腺癌细胞DLD-1中主要负责除热激基因以外的其他基因的停滞释放,而SEC负责热激基因的停滞释放。为了深入理解AFF4的功能,本研究利用RNA干扰技术在人类红系白血病细胞HEL中敲低了AFF4,发现RNA聚合酶Ⅱ (Pol Ⅱ)的羧基端重复区(C-terminal domain,CTD)内第二个丝氨酸(Serine 2,Ser-2)的磷酸化水平降低。利用RNA-seq和CUT&Tag确定了AFF4的直接靶基因,利用ChIP-seq和PRO-seq发现AFF4对转录启始的影响不明确、对Pol Ⅱ的停滞释放的调控不局限于热激基因,利用ChIP-qPCR发现AFF4缺失降低了P-TEFb的染色质结合。上述研究结果表明,AFF4对Pol Ⅱ的停滞释放的调控可能具有一定的细胞类型特异性,即在一些细胞内仅调控热激基因的停滞释放,而在另一些细胞中调控的对象却不仅限于热激基因。

MLL3基因对宫颈癌细胞放射敏感性和DNA损伤修复能力的影响

目的:探究髓系/淋巴系或混合谱系白血病3基因(myeloid/lymphoid or mixed-lineage leukemia 3,MLL3)对宫颈癌细胞生长、转移、放射敏感性的影响。方法:选择60例宫颈鳞癌患者的癌组织及配对癌旁组织,采用实时定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)检测检测MLL3 mRNA水平。体外培养SiHa细胞,将其分为以下5组:Control组(不转染)、NC-sh组(转染阴性对照shRNA慢病毒)、MLL3-sh组(转染MLL3 shRNA慢病毒)、NC-OE组(转染阴性对照过表达慢病毒)和MLL3-OE组(转染MLL3过表达慢病毒)。进一步采用2300EX直线加速器9 MeVβ射线照射细胞建立放射抵抗SiHa细胞(SiHaR),然后将其分为:NC-sh组、MLL3-sh组、8 Gy+NC-sh组和8 Gy+MLL3-sh组。NC-sh组和MLL3-sh组细胞不照射,8 Gy+NC-sh组和8 Gy+MLL3-sh组细胞用9 MeVβ射线照射8 Gy。采用MTT法检测细胞增殖情况;Annexin V-FITC/PI双染色法检测细胞凋亡;Transwell检测细胞侵袭能力;qRT-PCR检测MLL3、共济失调毛细血管扩张征突变基因(ATM)、ATM-Rad3相关基因(ATR)、乳腺癌易感基因(BRCA1)和RAD50双链断裂修复蛋白(RAD50)的mRNA水平;Western blot检测MLL3、Bcl-2相关X蛋白基因(Bax)、B细胞淋巴瘤/白血病-2基因(Bcl-2)、cleaved caspase 3、基质金属蛋白酶(MMP)2、MMP9和γ-H2AX的表达;免疫荧光染色检测γ-H2AX的表达。结果:与癌旁组织相比,宫颈鳞癌组织中的MLL3 mRNA水平显著降低(P<0.001)。与NC-sh组比较,MLL3-sh组SiHa细胞的MLL3 mRNA和蛋白相对表达量降低,细胞活力升高,细胞凋亡率、Bax和cleaved caspase 3蛋白相对表达量降低,Bcl-2蛋白相对表达量升高,侵袭细胞数量、MMP2和MMP9蛋白相对表达量升高(P<0.05)。与NC-OE组比较,MLL3-OE组SiHa细胞的MLL3 mRNA和蛋白相对表达量升高,细胞活力降低,细胞凋亡率、Bax和cleaved caspase 3蛋白相对表达量升高,Bcl-2蛋白相对表达量降低,侵袭细胞数量、MMP2和MMP9蛋白相对表达量降低(P<0.05)。与SiHa细胞相比,SiHaR细胞中的MLL3 mRNA和蛋白相对表达量均升高(P<0.001)。与8 Gy+NC-sh组比较,8 Gy+MLL3-sh组SiHaR细胞的细胞活力降低,γ-H2AX的蛋白相对表达量和γ-H2AX foci数目升高,ATM、ATR、BRCA1和RAD50的mRNA水平降低(P<0.05)。结论:宫颈癌细胞MLL3的表达下调促进了其生长和转移,但降低DNA损伤修复能力,提高宫颈癌细胞的放射敏感性。