外周血受体相互作用蛋白激酶3、混合系列蛋白激酶样结构域水平与新生儿坏死性小肠结肠炎病情严重程度的关系

目的分析新生儿坏死性小肠结肠炎(NEC)患儿外周血受体相互作用蛋白激酶3(RIPK3)、混合系列蛋白激酶样结构域(MLKL)的表达情况及其与病情严重程度的关系。方法选取92例NEC患儿纳入NEC组,并根据病情严重程度进一步分为轻度NEC组(Ⅰ级)60例和重度NEC组(Ⅱ~Ⅲ级)32例,另选取同期诊治的60例腹股沟斜疝患儿纳入对照组。采用实时荧光定量聚合酶链反应检测外周血RIPK3 mRNA、MLKL mRNA表达;采用Pearson相关分析法明确NEC组外周血RIPK3 mRNA与MLKL mRNA表达的相关性;采用免疫印迹法检测NEC回肠组织和正常回肠组织中RIPK3、MLKL蛋白表达;采用多因素Logistic回归分析明确重度NEC发生的独立危险因素。绘制受试者工作特征曲线,分析外周血RIPK3 mRNA、MLKL mRNA单独及联合预测重度NEC的价值。结果NEC组外周血RIPK3 mRNA、MLKL mRNA相对表达量分别为(2.41±0.52)、(3.03±0.64),高于对照组的(1.02±0.21)、(0.93±0.20),差异有统计学意义(P<0.001)。NEC回肠组织中RIPK3、MLKL蛋白相对灰度值分别为(1.20±0.21)、(1.13±0.24),高于正常回肠组织的(0.34±0.12)、(0.32±0.11),差异有统计学意义(P<0.05)。NEC组患儿外周血RIPK3 mRNA与MLKL mRNA相对表达量呈正相关(r=0.623,P<0.001)。重度NEC组合并气腹征、多器官功能障碍综合征、败血症者占比和RIPK3 mRNA、MLKL mRNA相对表达量均高于轻度NEC组,差异有统计学意义(P<0.05);RIPK3 mRNA、MLKL mRNA相对表达量升高是重度NEC发生的独立危险因素(P<0.05)。外周血RIPK3 mRNA、MLKL mRNA联合预测重度NEC的曲线下面积大于RIPK3 mRNA、MLKL mRNA单独预测(Z=4.127、4.261,P<0.05)。结论RIPK3 mRNA、MLKL mRNA在NEC患儿外周血中表达升高,两者均与NEC病情严重程度有关,且两者联合检测对重度NEC具有较高的预测价值。

混合谱系激酶结构域样蛋白、caspase-8及受体相互作用蛋白激酶3 mRNA在不同阶段乙型肝炎病毒感染患者中的表达及诊断价值

目的探讨混合谱系激酶结构域样蛋白(MLKL)、caspase-8及受体相互作用蛋白激酶3(RIPK3)mRNA在不同阶段乙型肝炎病毒(HBV)感染患者中的表达水平及诊断价值。方法选择2016年11月至2019年11月新乡市传染病医院收治的175例HBV感染患者为研究对象,根据病情程度将患者分为慢性乙型肝炎(CHB)组(n=67)、肝硬化(LC)组(n=61)和肝细胞肝癌(HCC)组(n=47);另选择同期于本院体检的80例体检健康者为对照组。采集各组受试者外周静脉血,应用实时荧光定量聚合酶链反应法检测外周血单个核细胞(PBMC)中MLKL、caspase-8及RIPK3 mRNA表达水平;采用Pearson相关检验分析HBV感染不同阶段患者PBMC中MLKL、caspase-8及RIPK3 mRNA表达水平的相关性,受试者操作特征曲线下面积(AUC)评估MLKL、caspase-8及RIPK3 mRNA表达水平对不同阶段HBV感染患者的鉴别诊断价值。结果4组受试者PBMC中MLKL、RIPK3、caspase-8 mRNA表达水平比较差异有统计学意义(F=1019.364、1009.381、159.407,P<0.05)。CHB组、LC组、HCC组患者PBMC中MLKL、RIPK3 mRNA表达水平显著高于对照组,caspase-8 mRNA表达水平显著低于对照组(P<0.05)。LC组、HCC组患者PBMC中MLKL、RIPK3 mRNA表达水平显著高于CHB组,caspase-8 mRNA表达水平显著低于CHB组(P<0.05)。HCC组患者PBMC中MLKL、RIPK3 mRNA表达水平显著高于LC组,caspase-8 mRNA表达水平显著低于LC组(P<0.05)。Pearson相关检验结果显示,不同阶段HBV感染组患者PBMC中MLKL mRNA表达与RIPK3 mRNA表达呈正相关(r=0.414、0.432、0.449,P<0.01),MLKL mRNA表达与caspase-8 mRNA表达呈负相关(r=-0.556、-0.378、-0.721,P<0.01),RIPK3 mRNA表达与caspase-8 mRNA表达呈负相关(r=-0.415、-0.400、-0.416,P<0.01)。PBMC中MLKL、caspase-8及RIPK3 mRNA表达水平鉴别CHB和HCC的AUC分别为0.918、0.859和0.912,三者联合鉴别CHB和HCC的AUC为0.945。PBMC中MLKL、caspase-8及RIPK3 mRNA表达水平鉴别LC和HCC的AUC分别为0.768、0.834和0.839,三者联合鉴别LC和HCC的AUC为0.895。结论HBV感染不同阶段患者PBMC中MLKL、caspase-8及RIPK3 mRNA表达水平显著上升,且三者之间存在显著相关性,MLKL、caspase-8及RIPK3 mRNA表达水平可作为鉴别诊断不同阶段HBV感染患者的生物学标志物。

混合谱系激酶结构域样蛋白非坏死性凋亡功能的研究进展

坏死性凋亡(necroptosis)是Degterev等[1]于2005年命名的一种细胞程序性死亡形式。细胞凋亡受阻时,坏死性凋亡作为一种备用途径确保细胞死亡的进展[2]。不同于凋亡对胱天蛋白酶(caspase)活性的依赖,坏死性凋亡的发生依赖于混合谱系激酶结构域样蛋白(mixed lineage kinase domain-like protein,MLKL)的磷酸化。MLKL属于蛋白激酶超家族,是一种不具有激酶功能的假激酶,作为终末专属效应蛋白在坏死过程中发挥作用[3-4]。

混合谱系激酶结构域样蛋白在小鼠妊娠早期子宫及蜕膜中的表达及调控

目的探讨混合谱系激酶结构域样蛋白(MLKL)在小鼠妊娠早期子宫及蜕膜组织中的表达规律。方法构建小鼠早期妊娠模型、人工诱导子宫蜕膜化模型、雌二醇和(或)孕酮处理子宫模型;体外培养人子宫内膜基质细胞,应用雌二醇、醋酸甲羟孕酮和二丁酰环腺苷酸诱导其蜕膜化。通过实时荧光定量PCR、原位杂交和蛋白质印迹法分析小鼠早期妊娠子宫、蜕膜化子宫和激素处理子宫中MLKL mRNA和蛋白的表达规律,通过实时荧光定量PCR检测MLKL mRNA在体外诱导的人蜕膜化细胞中的表达。结果 (1)在小鼠早期妊娠子宫中,MLKL mRNA及蛋白在妊娠第1～4天的子宫腔上皮表达量较低且不规律,在妊娠第5天的子宫腔上皮及其周围的蜕膜细胞中表达,妊娠第6～8天主要集中在蜕膜组织中表达,着床后表达量逐日增高并在妊娠第7天达到最高峰,妊娠第8天表达稍有下降。(2)在人工诱导蜕膜化的小鼠子宫中,MLKL mRNA表达量很高,整个蜕膜区域均有表达,而在对照组小鼠子宫中则无明显表达。MLKL蛋白的表达与mRNA相一致。MLKL mRNA在体外诱导的人蜕膜化细胞中的表达量高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。(3)在孕酮处理的小鼠子宫中MLKL mRNA及蛋白表达量增高,与对照组相比差异有统计学意义(P<0.05)。结论 MLKL受孕酮的调控参与哺乳动物胚胎着床和蜕膜化过程。

混合谱系激酶结构域样假激酶在小鼠脑缺血后脑水肿组织中的表达

目的:研究混合谱系激酶结构域样假激酶(MLKL)在C57BL/6J小鼠脑缺血后脑水肿组织中的表达及作用。方法:通过向野生型(WT)和MLKL敲除(MLKL^-/^-) C57BL/6J小鼠尾静脉注射浓度为6 mg/ml玫瑰红溶液(剂量为40 mg/kg)构建缺血后脑水肿模型。一周后取组织,利用免疫荧光染色技术观察MLKL在缺血后脑水肿区的表达和分布,Western Blot检测MLKL在小鼠缺血后脑水肿区的表达水平,采用免疫电镜技术观察MLKL的亚细胞水平定位,苏木精-伊红染色(HE)观察组织缺血坏死及水肿情况。结果:免疫荧光染色结果显示正常WT小鼠大脑皮质无MLKL表达,缺血后脑损伤区的WT小鼠有大量MLKL阳性细胞,MLKL主要表达于GFAP阳性星形胶质细胞; Western Blot结果显示脑缺血后脑损伤区的MLKL表达显著增加;免疫电镜结果显示脑水肿区域血管周围的星形胶质细胞内有大量MLKL蛋白胶体金颗粒分布; HE染色结果显示MLKL敲除可显著减轻脑水肿程度。结论:脑缺血可上调WT小鼠缺血部位MLKL表达,提示MLKL可能参与缺血后的脑水肿发生。

RIP1、MLKL蛋白在未分化甲状腺癌中的表达及临床意义

目的探讨受体相互作用蛋白激酶1(RIP1)、混合系激酶区域样蛋白(MLKL)在未分化甲状腺癌(ATC)中的表达及其临床意义。方法选取48例ATC患者为研究对象,检测手术标本组织中RIP1、MLKL的表达,收集患者临床病理参数并随访,统计分析RIP1、MLKL在ATC组织标本中的表达模式及对患者预后的影响。培养人未分化型甲状腺癌THJ-11T、THJ-16T、THJ-21T、ASH-3、BHT101细胞系、分化型甲状腺癌细胞系CAL-62、PDTC-1、正常人甲状腺细胞系Nthy-ori 3-1、HTORI-3,利用Western blot法及RT-PCR检测细胞系中RIP1、MLKL的蛋白mRNA的表达水平。结果(1)RT-PCR及Western blot检测显示,与正常人甲状腺细胞系及分化型甲状腺癌细胞系相比,未分化甲状腺癌细胞系中RIP1、MLKL蛋白和mRNA相对表达水平明显更高。(2)48例ATC患者中,14例起源于乳头状甲状腺癌(PTC),34例起源于滤泡状甲状腺癌(FTC)。肿瘤细胞表现出明显的多形性。形态学特征包括梭形细胞为主的肉瘤样及鳞状细胞样。(3)免疫组化染色显示,RIP1表达主要定位于ATC细胞膜。48例ATCs中有24例(50.0%)RIP1染色阳性。组织中含有混合岛状或低分化癌成分。MLKL阳性细胞核表达清晰,48例ATC患者中有29例(60.4%)患者MLKL染色阳性。(4)Kaplan-Meier生存分析显示,RIP1和MLKL过度表达会缩短ATC患者的无病生存期(DFS)(P<0.05),但对患者的总体生存率(OS)无明显影响(P>0.05)。Cox多因素分析显示,RIP1高表达、MLKL高表达、N分期、M分期均是影响ATC患者DFS的独立性危险因素(P<0.05)。结论RIP1、MLKL高表达与ATC的发生及DFS密切相关,或可作为ATC潜在的治疗靶点及预后预测的生物学标记物。

坏死样凋亡执行分子MLKL及其抑制剂的研究进展

坏死样凋亡是细胞调节性死亡方式之一,由受体相互作用蛋白(receptor interacting protein kinase,RIPK)1/RIPK3/混合系列蛋白激酶样结构域(mixed lineage kinase domain like protein,MLKL)信号通路介导。其中,MLKL对坏死样凋亡最终执行分子有着不可替代的作用。RIPK1/RIPK3/MLKL坏死复合体的形成诱导MLKL磷酸化激活,活化的MLKL插入细胞膜双分子层形成膜孔,破坏膜完整性,从而导致细胞死亡。除参与坏死样凋亡外,MLKL也与其他细胞死亡方式[如中性粒细胞特殊死亡方式(NETosis),细胞焦亡和细胞自噬]密切相关。MLKL参与多种细胞死亡通路异常相关疾病(如心血管疾病、神经退行性疾病和癌症)的病理过程,有可能成为多种疾病的治疗靶点。了解MLKL在不同细胞死亡方式中的作用,可为多种MLKL相关疾病靶点的寻找奠定基础,也可为MLKL抑制剂的开发应用指明方向。

血浆RIP1、RIP3和MLKL在慢性萎缩性胃炎中表达及与幽门螺杆菌关系

目的探讨血浆受体相互作用蛋白激酶1(RIP1)、受体相互作用蛋白激酶3(RIP3)和混合系列蛋白激酶结构域样蛋白(MLKL)在慢性萎缩性胃炎(CAG)中的表达及与幽门螺杆菌(Hp)关系。方法选取2022年6月至2023年12月于河南省胸科医院消化内科收治的Hp阳性CAG患者117例(感染组),Hp阴性CAG患者133例(CAG组),另选取同期于本院行健康体检者150例(对照组),其中感染组依据可操作的与胃癌风险联系的胃炎评估(OLGA)标准分为Ⅰ期39例、Ⅱ期26例、Ⅲ期32例、Ⅳ期20例。采用酶联免疫吸附法检测并比较各组受检者血浆RIP1、RIP3、MLKL水平;采用Pearson相关分析法分析血浆RIP1、RIP3、MLKL水平与OLGA分期和Hp感染相关性;采用多因素Logistic回归分析CAG患者Hp感染的影响因素,绘制受试者工作特征曲线(ROC)分析血浆RIP1、RIP3、MLKL对CAG患者Hp感染的预测价值。结果感染组患者的血浆RIP1、RIP3、MLKL水平分别为(8.70±0.54)μg/mL、(16.49±0.51)μg/mL、(5.70±1.29)μg/mL,明显高于CAG组的(5.70±1.24)μg/mL、(9.02±0.46)μg/mL、(4.49±0.51)μg/mL和对照组的(1.12±0.34)μg/mL、(5.69±0.74)μg/mL、(1.26±0.48)μg/mL,差异均有统计学意义(P<0.05),且CAG组明显高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05);随着OLGA分期增加,血浆RIP1、RIP3、MLKL水平逐渐升高,结果为Ⅳ期>Ⅲ期>Ⅱ期>Ⅰ期,差异均有统计学意义(P<0.05);Pearson相关分析法分析结果显示,RIP1、RIP3、MLKL与OLGA分期均呈正相关(r=0.693、0.721、0.774,P<0.05),与Hp感染均呈正相关(r=0.0.785、0.711、0.806,P<0.05);多因素Logistic回归分析结果显示,RIP1、RIP3和MLKL是CAG患者Hp感染的影响因素(P<0.05);ROC分析结果显示,血浆RIP1、RIP3和MLKL联合预测CAG患者Hp感染的曲线下面积(AUC)为0.875,明显高于血浆RIP1、RIP3、MLKL单独检测(AUC分别为0.717、0.734、0.676),差异均有统计学意义(P<0.05)。结论Hp阳性CAG患者的血浆RIP1、RIP3、MLKL水平明显升高,并且与OLGA分期和Hp感染关系密切,三者联合检测可提高CAG患者Hp感染的诊断价值。

混合系列蛋白激酶样结构域蛋白在非小细胞肺癌组织的表达及其临床意义

目的探讨混合系列蛋白激酶样结构域(MLKL)在非小细胞肺癌(NSCLC)组织的表达水平及其与NSCLC患者临床病理学特征的关系,分析其与NSCLC患者生存的相关性。方法我院65例NSCLC患者手术新鲜标本,采用实时定量聚合酶联反应(Real-timePCR)检测NSCLC肿瘤组织和癌旁组织的MLKL的mRNA表达水平;分析MLKL的mRNA表达水平和NSCLC患者的基本临床病理学特征参数的关系;利用在线Kalpan-MeierPlotter网站分析癌组织中的MLKL表达水平和NSCLC患者生存的相关性。结果在NSCLC癌组织中MLKL的mRNA表达水平明显低于癌旁组织(1.00±0.13比5.69±0.49,P=0.000);NSCLC组织中MLKL的mRNA表达水平与T及N分期呈明显负相关(P=0.026、0.048),较低的MLKL的mRNA表达提示较差的组织分化(P=0.040);MLKL低表达的NSCLC总人群和腺癌人群的总生存期(OS)和进展后生存期(PPS)显著低于MLKL高表达组(P=0.000、0.006、0.014、0.014)。结论MLKL在NSCLC癌组织中显著低表达,与NSLCL的分化程度、T和N分期明显相关,其低表达提示预后较差。

冠状动脉粥样硬化性心脏病患者血浆RIPK1,RIPK3及MLKL水平变化及其临床预测价值

目的:冠状动脉粥样硬化性心脏病(coronary atherosclerotic heart disease,CHD)为冠状动脉发生粥样硬化引起管腔狭窄甚至闭塞,导致心肌缺血、缺氧或坏死而引起的心脏病,其发病率长期居高不下,CHD的防治具有重要意义。本研究旨在探讨CHD患者血浆程序性坏死标志蛋白受体相互作用蛋白激酶1(receptor-interacting protein kinase 1,RIPK1)、受体相互作用蛋白激酶3(receptor-interacting protein kinase 3,RIPK3)及混合系列蛋白激酶结构域蛋白(mixed-lineage kinase domain-like protein,MLKL)水平变化及其临床预测价值。方法:纳入2015年9月至2017年5月经冠状动脉造影确诊的CHD住院患者190例以及健康受试者70例。根据CHD类型分为稳定型心绞痛组(SAP,n=46)、不稳定型心绞痛组(UAP,n=56)、非ST段抬高型心肌梗死组(NSTEMI,n=42)和ST段抬高型心肌梗死组(STEMI,n=46)。根据冠状动脉造影结果将CHD患者分为单支病变组、双支病变组及多支病变组,同时采用Gensini评分评估冠状动脉狭窄程度。采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测患者血浆RIPK1,RIPK3,MLKL水平。结果:CHD患者血浆RIPK1,RIPK3,MLKL水平显著高于对照组(P<0.05),且UAP组血浆RIPK1,RIPK3,MLKL水平显著高于SAP组(P<0.05),NSTEMI组及STEMI组显著高于UAP组(P<0.05)。而NSTEMI组与STEMI组血浆RIPK1,RIPK3及MLKL水平差异无统计学意义(P>0.05)。血浆RIPK1,RIPK3,MLKL水平随着冠状动脉病变支数的增加而升高(P<0.05),并且与Gensini评分呈正相关。多因素logistic回归显示:RIPK1,RIPK3,MLKL是冠状动脉严重狭窄的独立危险因素。出院后平均随访24个月,根据是否发生主要不良心血管事件(major adverse cardiovascular events,MACE),将患者分为发生MACE组及未发生MACE组。与未发生MACE组相比较,发生MACE组血浆RIPK1,RIPK3及MLKL水平显著升高(P<0.05)。受试者操作特征(receiver operator characteristic,ROC)曲线分析显示:血浆RIPK1曲线下面积为0.72(P<0.001),RIPK3曲线下面积为0.83(P<0.001),MLKL曲线下面积为0.75(P<0.001)。结论:血浆程序性坏死标志蛋白质RIPK1,RIPK3及MLKL水平与CHD密切相关,且对CHD患者预后的评估具有一定的预测价值。

新型受体相互作用蛋白激酶3突变体的激酶活性研究

目的·研究新型受体相互作用蛋白激酶3(receptor interacting protein kinase 3,RIPK3)突变体的激酶活性。方法·分别对RIPK3中的4个氨基酸(Q84WDF87)进行突变,并将这些突变体与混合谱系蛋白激酶样假激酶(mixed lineage kinase domain likepseudokinase,MLKL)共同转染到HEK293T细胞中。通过Western blotting检测新型RIPK3突变体S232位点自磷酸化的情况及其对MLKL S345位点磷酸化的影响;通过免疫共沉淀法观察RIPK3与MLKL之间的相互作用;采用非还原裂解法检测MLKL的寡聚化情况。结果·RIPK3ΔQ84、RIPK3ΔW85和RIPK3ΔD86的激酶活性显著降低,RIPK3Q84A/RIPK3Q84E、RIPK3W85Y和RIPK3D86A/RIPK3D86Y的激酶活性无明显改变;RIPK3W85A的自磷酸化减少,但不影响MLKL的磷酸化与寡聚化。结论·Q84、W85与D86是调节RIPK3激酶活性的关键氨基酸位点,RIPK3W85A的激酶活性减弱,但其对MLKL无影响。

MLKL蛋白在乳腺癌根治术后患者中的应用

目的混合系列蛋白激酶样结构域(mixed lineage kinase domain-like,MLKL)蛋白认为参与多种肿瘤的发生发展过程。本研究的目的旨在探讨MLKL蛋白在乳腺癌组织中的表达,分析MLKL的表达在乳腺癌根治术后患者中的临床价值。方法采用免疫组织化学的方法分析正常乳腺组织及乳腺癌组织中MLKL蛋白的表达水平,并根据制定的免疫组化评分系统计算MLKL蛋白的表达情况。采用Kaplan-Meier生存曲线法绘制两组患者生存曲线。结果正常乳腺组织及乳腺癌组织中低MLKL表达的比例分别为30.0%(6/20)及63.5%(47/74),差异具有显著的统计学意义(P=0.007)。本组研究中低MLKL表达提示乳腺癌组织分化类型不佳、肿瘤浸润、淋巴转移、TNM分期的比例较高。在74例接受根治手术的患者中,低MLKL表达的患者提示5年生存率较差(46.8%vs 77.0%,P=0.006)。结论低MLKL表达提示根治术后的乳腺癌患者生存预后不佳,MLKL可能作为生物学标记物为乳腺癌患者提供预后信息。

程序性坏死与脑梗死相关的研究进展

脑梗死是一种严重危害人类健康的重大疾病,程序性坏死是细胞程序性死亡形式之一。近些年研究认为程序性坏死参与了脑梗死后神经元损伤,但其分子调控机制尚不清楚。作者就程序性坏死的概念及相关通路、程序性坏死与脑梗死神经元损伤的关系、程序性坏死标志物在脑梗死患者血浆中的水平、程序性坏死与脑梗死治疗等几个方面进行综述,归纳总结了二者的相关性,为制定新的脑梗死治疗策略提供理论依据。

坏死性凋亡在胰腺疾病中的作用机制研究进展

坏死性凋亡介于细胞凋亡和坏死之间,是一种受调控的天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶非依赖性程序性细胞死亡,可诱导炎症反应发生。研究表明,它与胰腺疾病的病程进展及预后密切相关,在胰腺疾病进展中发挥重要的双向调控作用,且相关的坏死性凋亡抑制剂与诱导剂有望用于胰腺疾病的治疗。基于此,本文对坏死性凋亡发生的机制及其在胰腺疾病进展中的作用进行综述,旨在为胰腺疾病的发病机制和治疗提供新的认识,为其靶向性药物的研发提供理论依据。

LncRNA NR003508通过海绵吸附miR-483-3p并靶向MLKL调控BCG感染小鼠巨噬细胞坏死

旨在探讨LncRNA NR_003508在牛分枝杆菌卡介苗(Bacillus Calmette-Guérin, BCG)感染中对小鼠巨噬细胞坏死的调控作用。本研究利用小干扰RNA技术干扰小鼠巨噬细胞系RAW264.7中LncRNA NR_003508的表达,并结合BCG感染,采用Western blot、免疫荧光和流式细胞术等技术检测坏死相关调控因子混合谱系激酶结构域样蛋白(MLKL)的表达水平和细胞坏死率,以及通过生物信息学和双荧光素酶报告基因技术分别预测和验证LncRNA NR_003508与miR-483-3p的靶向结合。结果表明,BCG感染巨噬细胞后,LncRNA NR_003508表达水平显著上调(P<0.01);转染siRNA-LncRNA NR_003508后,MLKL蛋白表达显著下调(P<0.01),同时巨噬细胞坏死率也显著降低(P<0.05);LncRNA NR_003508可以与miR-483-3p特异性结合并发挥海绵吸附作用,并且干扰LncRNA NR_003508可显著上调miR-483-3p的表达(P<0.01),而过表达miR-483-3p显著抑制MLKL的表达(P<0.01),同时抑制巨噬细胞坏死。以上研究结果表明,LncRNA NR_003508通过海绵吸附miR-483-3p并靶向MLKL的表达来促进BCG诱导的巨噬细胞坏死。

细胞程序性坏死在动脉粥样硬化中作用的研究进展

真核细胞死亡的机制是高度进化保守的,在维持机体发育、生理平衡和疾病发生过程中具有重要意义。成年人体内每天约有100~1 000亿个细胞死亡,而后被新生的健康细胞所代替,以维持整个机体的稳态[1]。《cell death&differentiation》期刊细胞死亡命名委员会(nomenclature committee on cell death,NCCD)依据细胞死亡的形态学特点,将细胞死亡分为三大经典类型:凋亡、自噬和坏死[2]。既往研究认为,细胞凋亡和自噬是主动的可被调控的细胞死亡过程,而细胞坏死是被动的不可调控的细胞死亡形式。

RSV感染气液相界面培养人支气管上皮细胞模型的建立及其对HMGB1和pMLKL表达的影响

目的构建呼吸道合胞病毒(RSV)感染气液相界面(ALI)培养的人支气管上皮细胞(hBEC)模型,为深入研究呼吸道病毒致病机制提供更接近体内环境的细胞模型;通过分析RSV感染对高迁移率族蛋白1(HMGB1)和磷酸化混合系列蛋白激酶样结构域(pMLKL)表达的影响,探讨RSV感染损伤支气管上皮的致病机制。方法将hBEC接种到Transwell膜上,进行液体浸没式培养,细胞汇合度达100%后转ALI培养,倒置显微镜观察细胞生长状态。细胞分化成熟后按照以下分组分别感染RSV病毒:6 h对照组,6 h感染复数(MOI)1.0组,6 h MOI 3.0组,24 h对照组,24 h MOI 1.0组,24 h MOI 3.0组。每组3个复孔。通过免疫荧光染色确认RSV感染效果和RSV感染对细胞核蛋白HMGB1和pMLKL表达的影响。结果经细胞扩展期液体浸没式培养4~10 d后,细胞汇合度达100%。转ALI培养约4周后,细胞条索状分布越来越清晰,且分泌肉眼可见的黏液,形成黏液层,将Transwell膜石蜡包埋切片,得到典型的假复层上皮HE染色结果。经抗RSV抗体免疫荧光染色确认,MOI为3.0感染24 h RSV病毒成功感染细胞;抗HMGB1和抗pMLKL免疫荧光双染色结果显示,该感染条件下,细胞核内出现粉色荧光[为蓝色4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)和红色HMGB1荧光Merge结果],证实RSV感染后出现HMGB1核表达;而RSV感染前后均未见pMLKL表达。结论通过在Transwell膜上液体浸没式扩展培养和ALI分化培养,可获得分化良好的hBEC,且能较长时间维持其形态及功能,可为呼吸道病毒感染及其他常见呼吸道疾病研究提供更接近体内环境的细胞模型。在MOI 3.024 h条件下,RSV成功感染该细胞模型,并引起损伤相关分子蛋白HMGB1核表达。

“柴胡三参胶囊”预处理对大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用及其与MLK3-p38 MAPK-NLRP3信号通路的关系

目的:探讨柴胡三参胶囊通过MLK3-p38 MAPK-NLRP3信号通路减轻炎症反应对心肌缺血再灌注损伤(MIRI)大鼠心脏的保护作用。方法:将72只SD雄性大鼠随机分为假手术组、模型组、地尔硫卓组(每日给药量:51 mg/kg)及柴胡三参胶囊低、中、高剂量组(每日给药量:216、432、864 mg/kg),每组12只。各给药组灌胃给予相应药液,假手术组、模型组灌胃等体积生理盐水,均每日1次,连续7 d。预处理结束后,除假手术组外,其余各组大鼠采用结扎冠状动脉左前降支并再灌注的方法建立MIRI模型,再灌注结束后立即取血、取全心,假手术组只穿线,不结扎。采用酶联免疫吸附测定(ELISA)法检测每组6只大鼠血清肌酸激酶同工酶(CK-MB)、心肌肌钙蛋白I(cTnI)含量,苏木素-伊红(HE)染色法观察每组3只大鼠心肌组织病理变化,2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)染色法观察每组5只大鼠心肌梗死范围,蛋白质免疫印迹(Western blot)法检测每组3只大鼠心肌组织中混合谱系酶3(MLK3)、p38丝裂原激活蛋白激酶(p38 MAPK)、NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3(NLRP3)、白细胞介素-1β(IL-1β)蛋白表达水平。结果:模型组大鼠血清CK-MB、cTnI含量显著高于假手术组(P<0.01),心肌细胞排列紊乱、肥大水肿,心肌梗死面积占比明显大于假手术组(P<0.01),缺血区心肌组织炎症相关蛋白MLK3、p38 MAPK、NLRP3、IL-1β的表达均显著高于假手术组(P<0.01,P<0.05)。各给药组大鼠血清CK-MB、cTnI水平均显著低于模型组(P<0.01);柴胡三参胶囊中、高剂量组与地尔硫卓组大鼠血清CK-MB、cTnI水平显著低于柴胡三参胶囊低剂量组(P<0.01),而此3组大鼠上述指标组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。柴胡三参胶囊中、高剂量组及地尔硫卓组大鼠心肌细胞排列较整齐,心肌细胞水肿范围少于模型组,其中以柴胡三参胶囊高剂量组及地尔硫卓组改善最明显。柴胡三参胶囊中、高剂量组与地尔硫卓组大鼠心肌梗死面积占比明显低于模型组(P<0.01),3组大鼠心肌梗死面积占比组间比较差异无统计学意义(P>0.05),柴胡三参胶囊中剂量组、地尔硫卓组大鼠心肌梗死面积占比明显低于低剂量组(P<0.01)。柴胡三参胶囊中、高剂量组及地尔硫卓组大鼠心肌组织MLK3、p38 MAPK、NLRP3、IL-1β蛋白表达水平明显低于模型组和柴胡三参胶囊低剂量组(P<0.01),其中地尔硫卓组MLK3蛋白表达明显低于柴胡三参胶囊高剂量组(P<0.05),NLRP3蛋白表达明显低于柴胡三参胶囊中、高剂量组(P<0.01)。结论:柴胡三参胶囊中、高剂量预处理可减轻大鼠心肌缺血再灌注损伤,其可能通过MLK3-p38 MAPK-NLRP3信号通路减轻炎症反应实现对MIRI模型大鼠的心肌保护作用。

MLKL对金黄色葡萄球菌感染所致小鼠肝脏和肾脏损伤的调控作用

运用ELISA、免疫荧光法、苏木素-伊红染色法以及流式细胞术分析了金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,S.aureus)分别感染MLKL基因敲除(MLKL^(-/-))和C57BL/6J小鼠后肝脏和肾脏中促炎性细胞因子(TNF-α和IL-1β)和抗炎因子(IL-10)的分泌、组织脏器的损伤水平、血液中中性粒细胞募集和小鼠存活情况。结果显示,在S.aureus感染MLKL^(-/-)小鼠肝脏和肾脏中TNF-α的分泌水平显著高于C57BL/6J小鼠肝脏和肾脏中TNF-α的分泌水平(P<0.001)。此外,S.aureus感染C57BL/6J小鼠肝脏和肾脏中,IL-10的分泌水平显著高于MLKL^(-/-)小鼠(P<0.05)。免疫荧光检测结果显示,与C57BL/6J小鼠相比,S.aureus感染MLKL^(-/-)小鼠后肝脏和肾脏中组织损伤标志物HMGB1蛋白表达处于较高水平(P<0.01)。病理切片结果显示,使用S.aureus感染后,MLKL^(-/-)小鼠肝脏和肾脏损伤程度显著高于C57BL/6J小鼠。S.aureus感染后,MLKL^(-/-)小鼠血液中CD11b和Gr-1双阳性的比例显著高于C57BL/6J小鼠血液中的比例(P<0.01)。使用高低剂量S.aureus分别感染小鼠后,发现MLKL^(-/-)小鼠的生存率低于C57BL/6J小鼠。结果表明,MLKL对S.aureus感染诱导的宿主细胞因子分泌具有一定的下调作用,进而发挥对宿主脏器损伤的保护作用,降低小鼠的病死率。

坏死性凋亡经典通路在心血管疾病中的研究进展

坏死性凋亡作为一种程序性细胞死亡,参与了动脉粥样硬化、心肌缺血再灌注、心肌梗死、心力衰竭等多种心血管疾病的病理生理过程。综述坏死性凋亡经典通路受体相互作用激酶1(RIP1)-受体相互作用激酶3(RIP3)-底物混合谱系激酶样蛋白(MLKL)的分子机制、抗坏死性凋亡相关治疗药物及这一通路在常见心血管疾病中的研究进展。为探寻新的治疗方式、降低心血管疾病的死亡率、改善心血管病人的预后提供参考。