椎间盘退变程度与髓核中miRNA-142-3p、混合谱系激酶3及白细胞介素1β的相关性

背景:研究表明,miRNA水平与椎间盘细胞的凋亡和增殖、细胞外基质代谢和炎症反应密切相关,而miR-142-3p在椎间盘退变中的具体作用尚不清楚。目的:探讨人腰椎间盘髓核组织中miRNA-142-3p、混合谱系激酶3、白细胞介素1β表达与椎间盘退变程度的相关性。方法:选择2020年1月至2022年3月在苏州市第九人民医院因腰椎间盘退行性疾病而行手术的患者82例,术前均行MRI检查,根据Videman分级标准将患者分为轻度退变组(n=36)、中度退变组(n=26)和重度退变组(n=20),获取82份髓核组织标本,检测各组髓核组织中miRNA-142-3p、混合谱系激酶3、白细胞介素1β、Ⅰ型胶原和Ⅱ型胶原的基因表达,以及混合谱系激酶3、白细胞介素1β、Ⅰ型胶原和Ⅱ型胶原的蛋白表达,采用Spearman相关系数法评估miRNA-142-3p、混合谱系激酶3、白细胞介素β表达与腰椎间盘退变程度的相关性。采用随机数字表法将30只成年SD大鼠分为假手术组(仅穿刺皮肤与肌肉后处死)、轻度退变组(穿刺Co7/8椎间盘1周后处死)与重度退变组(穿刺Co7/8椎间盘2周后处死),每组10只,检测各组髓核组织中混合谱系激酶3、白细胞介素1β的蛋白表达,以及miRNA-142-3p、混合谱系激酶3、白细胞介素1β的基因表达。结果与结论:①人髓核组织:miRNA-142-3p的表达由高到低的顺序为轻度退变组>中度退变组>重度退变组(P<0.05),混合谱系激酶3、白细胞介素1β基因与蛋白表达由低到高的顺序为:轻度退变组<中度退变组<重度退变组(P<0.05),Ⅰ型胶原基因与蛋白表达由低到高的顺序为:轻度退变组<中度退变组<重度退变组(P<0.05),Ⅱ型胶原基因与蛋白表达由高到低的顺序为:轻度退变组>中度退变组>重度退变组的趋势(P<0.05);Spearman相关分析显示,椎间盘退变程度与miRNA-142-3p表达呈负相关(P<0.05),与混合谱系激酶3、白细胞介素1β表达呈正相关(P<0.05);②大鼠髓核组织:与假手术组比较,轻度退变组髓核组织中混合谱系激酶3、白细胞介素1β基因与蛋白表达升高(P<0.05),miRNA-142-3p表达降低(P<0.05);与轻度退变组比较,重度退变组髓核组织中混合谱系激酶3、白细胞介素1β基因与蛋白表达升高(P<0.05),miRNA-142-3p表达降低(P<0.05);③结果表明,人腰椎间盘退变程度与髓核组织中miRNA-142-3p表达呈负相关,与混合谱系激酶3和白细胞介素1β表达呈正相关。

外周血受体相互作用蛋白激酶3、混合系列蛋白激酶样结构域水平与新生儿坏死性小肠结肠炎病情严重程度的关系

目的分析新生儿坏死性小肠结肠炎(NEC)患儿外周血受体相互作用蛋白激酶3(RIPK3)、混合系列蛋白激酶样结构域(MLKL)的表达情况及其与病情严重程度的关系。方法选取92例NEC患儿纳入NEC组,并根据病情严重程度进一步分为轻度NEC组(Ⅰ级)60例和重度NEC组(Ⅱ~Ⅲ级)32例,另选取同期诊治的60例腹股沟斜疝患儿纳入对照组。采用实时荧光定量聚合酶链反应检测外周血RIPK3 mRNA、MLKL mRNA表达;采用Pearson相关分析法明确NEC组外周血RIPK3 mRNA与MLKL mRNA表达的相关性;采用免疫印迹法检测NEC回肠组织和正常回肠组织中RIPK3、MLKL蛋白表达;采用多因素Logistic回归分析明确重度NEC发生的独立危险因素。绘制受试者工作特征曲线,分析外周血RIPK3 mRNA、MLKL mRNA单独及联合预测重度NEC的价值。结果NEC组外周血RIPK3 mRNA、MLKL mRNA相对表达量分别为(2.41±0.52)、(3.03±0.64),高于对照组的(1.02±0.21)、(0.93±0.20),差异有统计学意义(P<0.001)。NEC回肠组织中RIPK3、MLKL蛋白相对灰度值分别为(1.20±0.21)、(1.13±0.24),高于正常回肠组织的(0.34±0.12)、(0.32±0.11),差异有统计学意义(P<0.05)。NEC组患儿外周血RIPK3 mRNA与MLKL mRNA相对表达量呈正相关(r=0.623,P<0.001)。重度NEC组合并气腹征、多器官功能障碍综合征、败血症者占比和RIPK3 mRNA、MLKL mRNA相对表达量均高于轻度NEC组,差异有统计学意义(P<0.05);RIPK3 mRNA、MLKL mRNA相对表达量升高是重度NEC发生的独立危险因素(P<0.05)。外周血RIPK3 mRNA、MLKL mRNA联合预测重度NEC的曲线下面积大于RIPK3 mRNA、MLKL mRNA单独预测(Z=4.127、4.261,P<0.05)。结论RIPK3 mRNA、MLKL mRNA在NEC患儿外周血中表达升高,两者均与NEC病情严重程度有关,且两者联合检测对重度NEC具有较高的预测价值。

混合谱系激酶结构域样蛋白、caspase-8及受体相互作用蛋白激酶3 mRNA在不同阶段乙型肝炎病毒感染患者中的表达及诊断价值

目的探讨混合谱系激酶结构域样蛋白(MLKL)、caspase-8及受体相互作用蛋白激酶3(RIPK3)mRNA在不同阶段乙型肝炎病毒(HBV)感染患者中的表达水平及诊断价值。方法选择2016年11月至2019年11月新乡市传染病医院收治的175例HBV感染患者为研究对象,根据病情程度将患者分为慢性乙型肝炎(CHB)组(n=67)、肝硬化(LC)组(n=61)和肝细胞肝癌(HCC)组(n=47);另选择同期于本院体检的80例体检健康者为对照组。采集各组受试者外周静脉血,应用实时荧光定量聚合酶链反应法检测外周血单个核细胞(PBMC)中MLKL、caspase-8及RIPK3 mRNA表达水平;采用Pearson相关检验分析HBV感染不同阶段患者PBMC中MLKL、caspase-8及RIPK3 mRNA表达水平的相关性,受试者操作特征曲线下面积(AUC)评估MLKL、caspase-8及RIPK3 mRNA表达水平对不同阶段HBV感染患者的鉴别诊断价值。结果4组受试者PBMC中MLKL、RIPK3、caspase-8 mRNA表达水平比较差异有统计学意义(F=1019.364、1009.381、159.407,P<0.05)。CHB组、LC组、HCC组患者PBMC中MLKL、RIPK3 mRNA表达水平显著高于对照组,caspase-8 mRNA表达水平显著低于对照组(P<0.05)。LC组、HCC组患者PBMC中MLKL、RIPK3 mRNA表达水平显著高于CHB组,caspase-8 mRNA表达水平显著低于CHB组(P<0.05)。HCC组患者PBMC中MLKL、RIPK3 mRNA表达水平显著高于LC组,caspase-8 mRNA表达水平显著低于LC组(P<0.05)。Pearson相关检验结果显示,不同阶段HBV感染组患者PBMC中MLKL mRNA表达与RIPK3 mRNA表达呈正相关(r=0.414、0.432、0.449,P<0.01),MLKL mRNA表达与caspase-8 mRNA表达呈负相关(r=-0.556、-0.378、-0.721,P<0.01),RIPK3 mRNA表达与caspase-8 mRNA表达呈负相关(r=-0.415、-0.400、-0.416,P<0.01)。PBMC中MLKL、caspase-8及RIPK3 mRNA表达水平鉴别CHB和HCC的AUC分别为0.918、0.859和0.912,三者联合鉴别CHB和HCC的AUC为0.945。PBMC中MLKL、caspase-8及RIPK3 mRNA表达水平鉴别LC和HCC的AUC分别为0.768、0.834和0.839,三者联合鉴别LC和HCC的AUC为0.895。结论HBV感染不同阶段患者PBMC中MLKL、caspase-8及RIPK3 mRNA表达水平显著上升,且三者之间存在显著相关性,MLKL、caspase-8及RIPK3 mRNA表达水平可作为鉴别诊断不同阶段HBV感染患者的生物学标志物。

归脾汤对心脾两虚型孤独症谱系障碍大鼠谷氨酸及PI3K/Akt/mTOR信号通路的影响

目的观察归脾汤对心脾两虚型孤独症谱系障碍大鼠磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号通路相关蛋白表达情况的影响,探讨归脾汤可能的作用机制。方法取20只受孕SD大鼠,随机选择16只给予心脾两虚型孤独症谱系障碍患儿粪便配制的液体灌胃,其余4只给予等体积生理盐水灌胃作为正常对照组,灌胃持续至分娩后21 d,通过三箱社交实验并结合大鼠体重、摄食量、大便情况、活动量、神态等筛选出心脾两虚型孤独症谱系障碍造模成功的子代大鼠。随机选取造模成功的子代21日龄大鼠40只,然后随机分为模型组、双歧杆菌组和归脾汤低、中、高剂量组,每组8只,另选择正常对照组子代大鼠8只作为正常组。双歧杆菌组给予双歧杆菌0.45 g/kg灌胃,归脾汤低、中、高剂量组分别给予2.2 g/kg、4.4 g/kg、8.8 g/kg的归脾汤灌胃,正常组和模型组给予等体积生理盐水灌胃,均1次/d,连续灌胃14 d。记录大鼠灌胃第7天、第14天时体重,三箱社交实验评估大鼠社交能力、社交新颖性,比色法检测大鼠海马组织中谷氨酸含量,Western blot法检测大鼠海马组织中N-甲基-D-天冬氨酸受体2B亚基(NR2B)、磷酸酶张力蛋白同源物(PTEN)、PI3K、Akt、mTOR、p70核糖体蛋白S6激酶(p70S6K)蛋白表达情况,RT-qPCR法检测大鼠海马组织中NR2B、PTEN、PI3K、Akt、mTOR、p70S6K mRNA表达情况。结果与正常组比较,模型组大鼠体重明显降低,大鼠与空笼接触时间明显延长(P<0.05),与陌生鼠2接触时间明显缩短(P<0.05);海马组织中谷氨酸含量和海马组织中NR2B、PI3K、Akt、mTOR、p70S6K蛋白及mRNA相对表达量均明显升高(P均<0.05),海马组织中PTEN蛋白及mRNA相对表达量均明显降低(P均<0.05)。与模型组比较,归脾汤各组及双歧杆菌组大鼠体重均明显增加(P均<0.05),大鼠与空笼接触时间明显缩短(P均<0.05),与陌生鼠2接触时间均明显延长(P均<0.05),海马组织中谷氨酸含量和海马组织中NR2B、PI3K、Akt、mTOR、p70S6K蛋白及mRNA相对表达量均明显降低(P均<0.05),海马组织中PTEN蛋白及mRNA相对表达量均明显升高(P均<0.05)。归脾汤中、高剂量组大鼠体重及海马组织中PTEN蛋白及mRNA相对表达量均明显高于双歧杆菌组(P均<0.05),海马组织中谷氨酸含量和海马组织中NR2B、PI3K、mTOR、p70S6K蛋白及mRNA相对表达量均明显低于双歧杆菌组(P均<0.05)。结论归脾汤能有效改善心脾两虚型孤独症谱系障碍大鼠社交能力和社交新颖性,作用机制可能与下调谷氨酸含量、抑制谷氨酸与NR2B受体结合,从而抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路活化有关。

血浆RIP1、RIP3和MLKL在慢性萎缩性胃炎中表达及与幽门螺杆菌关系

目的探讨血浆受体相互作用蛋白激酶1(RIP1)、受体相互作用蛋白激酶3(RIP3)和混合系列蛋白激酶结构域样蛋白(MLKL)在慢性萎缩性胃炎(CAG)中的表达及与幽门螺杆菌(Hp)关系。方法选取2022年6月至2023年12月于河南省胸科医院消化内科收治的Hp阳性CAG患者117例(感染组),Hp阴性CAG患者133例(CAG组),另选取同期于本院行健康体检者150例(对照组),其中感染组依据可操作的与胃癌风险联系的胃炎评估(OLGA)标准分为Ⅰ期39例、Ⅱ期26例、Ⅲ期32例、Ⅳ期20例。采用酶联免疫吸附法检测并比较各组受检者血浆RIP1、RIP3、MLKL水平;采用Pearson相关分析法分析血浆RIP1、RIP3、MLKL水平与OLGA分期和Hp感染相关性;采用多因素Logistic回归分析CAG患者Hp感染的影响因素,绘制受试者工作特征曲线(ROC)分析血浆RIP1、RIP3、MLKL对CAG患者Hp感染的预测价值。结果感染组患者的血浆RIP1、RIP3、MLKL水平分别为(8.70±0.54)μg/mL、(16.49±0.51)μg/mL、(5.70±1.29)μg/mL,明显高于CAG组的(5.70±1.24)μg/mL、(9.02±0.46)μg/mL、(4.49±0.51)μg/mL和对照组的(1.12±0.34)μg/mL、(5.69±0.74)μg/mL、(1.26±0.48)μg/mL,差异均有统计学意义(P<0.05),且CAG组明显高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05);随着OLGA分期增加,血浆RIP1、RIP3、MLKL水平逐渐升高,结果为Ⅳ期>Ⅲ期>Ⅱ期>Ⅰ期,差异均有统计学意义(P<0.05);Pearson相关分析法分析结果显示,RIP1、RIP3、MLKL与OLGA分期均呈正相关(r=0.693、0.721、0.774,P<0.05),与Hp感染均呈正相关(r=0.0.785、0.711、0.806,P<0.05);多因素Logistic回归分析结果显示,RIP1、RIP3和MLKL是CAG患者Hp感染的影响因素(P<0.05);ROC分析结果显示,血浆RIP1、RIP3和MLKL联合预测CAG患者Hp感染的曲线下面积(AUC)为0.875,明显高于血浆RIP1、RIP3、MLKL单独检测(AUC分别为0.717、0.734、0.676),差异均有统计学意义(P<0.05)。结论Hp阳性CAG患者的血浆RIP1、RIP3、MLKL水平明显升高,并且与OLGA分期和Hp感染关系密切,三者联合检测可提高CAG患者Hp感染的诊断价值。

丁苯酞通过混合谱系激酶3信号通路对1-甲基-4-苯基-吡啶离子诱导的SH-SY5Y细胞增殖和凋亡的影响

目的探讨丁苯酞对1-甲基-4-苯基-吡啶离子(MPP+)诱导的SH-SY5Y细胞混合谱系激酶3(MLK3)通路的影响,及其对细胞增殖与凋亡的作用机制。方法对数生长期SH-SY5Y细胞分为对照组、MPP+组、丁苯酞组和URMC-099组,对照组正常培养,MPP+组加1 mmol/L MPP+培养24 h,丁苯酞组予10μmol/L丁苯酞预处理3 h后,加入MPP+培养24 h,URMC-099组予200nmol/L MLK3通路特异性抑制剂URMC-099预处理3 h后,加入MPP+培养24 h。倒置相差显微镜观察细胞形态,噻唑蓝比色法检测细胞活性,Annexin-V/PI双染流式细胞术检测细胞凋亡率,Hoechst33342荧光染色法观察凋亡细胞,Western blotting检测MLK3磷酸化蛋白(p-MLK3)、c-Jun氨基末端激酶磷酸化蛋白(p-JNK)和细胞外调节蛋白激酶磷酸化蛋白(p-ERK1/2)的表达。结果 MPP+组细胞存活率低于对照组(P<0.05),丁苯酞组和URMC-099组细胞存活率高于MPP+组(P<0.05);MPP+组细胞凋亡率高于对照组(P<0.05),丁苯酞组和URMC-099组细胞凋亡率低于MPP+组(P<0.05);与对照组相比,MPP+组p-MLK3、p-JNK蛋白表达量增加(P<0.05),p-ERK1/2蛋白表达量降低(P<0.05);与MPP+组相比,丁苯酞组和URMC-099组p-MLK3、p-JNK蛋白表达量降低(P<0.05),p-ERK1/2蛋白表达量升高(P<0.05)。结论丁苯酞可减少MPP+诱导的SH-SY5Y细胞凋亡,促进细胞增殖,其机制可能是通过抑制MLK3通路,调节下游p-JNK、p-ERK1/2蛋白表达。

“柴胡三参胶囊”预处理对大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用及其与MLK3-p38 MAPK-NLRP3信号通路的关系

目的:探讨柴胡三参胶囊通过MLK3-p38 MAPK-NLRP3信号通路减轻炎症反应对心肌缺血再灌注损伤(MIRI)大鼠心脏的保护作用。方法:将72只SD雄性大鼠随机分为假手术组、模型组、地尔硫卓组(每日给药量:51 mg/kg)及柴胡三参胶囊低、中、高剂量组(每日给药量:216、432、864 mg/kg),每组12只。各给药组灌胃给予相应药液,假手术组、模型组灌胃等体积生理盐水,均每日1次,连续7 d。预处理结束后,除假手术组外,其余各组大鼠采用结扎冠状动脉左前降支并再灌注的方法建立MIRI模型,再灌注结束后立即取血、取全心,假手术组只穿线,不结扎。采用酶联免疫吸附测定(ELISA)法检测每组6只大鼠血清肌酸激酶同工酶(CK-MB)、心肌肌钙蛋白I(cTnI)含量,苏木素-伊红(HE)染色法观察每组3只大鼠心肌组织病理变化,2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)染色法观察每组5只大鼠心肌梗死范围,蛋白质免疫印迹(Western blot)法检测每组3只大鼠心肌组织中混合谱系酶3(MLK3)、p38丝裂原激活蛋白激酶(p38 MAPK)、NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3(NLRP3)、白细胞介素-1β(IL-1β)蛋白表达水平。结果:模型组大鼠血清CK-MB、cTnI含量显著高于假手术组(P<0.01),心肌细胞排列紊乱、肥大水肿,心肌梗死面积占比明显大于假手术组(P<0.01),缺血区心肌组织炎症相关蛋白MLK3、p38 MAPK、NLRP3、IL-1β的表达均显著高于假手术组(P<0.01,P<0.05)。各给药组大鼠血清CK-MB、cTnI水平均显著低于模型组(P<0.01);柴胡三参胶囊中、高剂量组与地尔硫卓组大鼠血清CK-MB、cTnI水平显著低于柴胡三参胶囊低剂量组(P<0.01),而此3组大鼠上述指标组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。柴胡三参胶囊中、高剂量组及地尔硫卓组大鼠心肌细胞排列较整齐,心肌细胞水肿范围少于模型组,其中以柴胡三参胶囊高剂量组及地尔硫卓组改善最明显。柴胡三参胶囊中、高剂量组与地尔硫卓组大鼠心肌梗死面积占比明显低于模型组(P<0.01),3组大鼠心肌梗死面积占比组间比较差异无统计学意义(P>0.05),柴胡三参胶囊中剂量组、地尔硫卓组大鼠心肌梗死面积占比明显低于低剂量组(P<0.01)。柴胡三参胶囊中、高剂量组及地尔硫卓组大鼠心肌组织MLK3、p38 MAPK、NLRP3、IL-1β蛋白表达水平明显低于模型组和柴胡三参胶囊低剂量组(P<0.01),其中地尔硫卓组MLK3蛋白表达明显低于柴胡三参胶囊高剂量组(P<0.05),NLRP3蛋白表达明显低于柴胡三参胶囊中、高剂量组(P<0.01)。结论:柴胡三参胶囊中、高剂量预处理可减轻大鼠心肌缺血再灌注损伤,其可能通过MLK3-p38 MAPK-NLRP3信号通路减轻炎症反应实现对MIRI模型大鼠的心肌保护作用。

结直肠癌组织miR-331-3p、MLLT10 mRNA表达变化及其临床意义

目的观察结直肠癌(CRC)组织微小RNA-331-3p(miR-331-3p)、混合谱系白血病转位辅因子10(MLLT10)mRNA表达变化,并探讨其表达与临床病理特征和上皮间质转化的关系。方法选择CRC患者156例,取术中获取的CRC组织及其配对的癌旁正常组织,采用实时荧光定量聚合酶链反应检测miR-331-3p、MLLT10mRNA表达以及上皮间质转化相关基因E-钙黏蛋白(E-cadherin)、N-钙黏蛋白(N-cadherin)、锌指转录因子Snail mRNA表达。比较CRC组织与癌旁正常组织miR-331-3p及MLLT10、E-cadherin、N-cadherin、Snail mRNA表达;分析CRC组织miR-331-3p、MLLT10 mRNA表达与临床病理特征的关系,二者表达的关系及其与E-cadherin、N-cadherin、Snail mRNA表达的关系。结果CRC组织MLLT10、N-cadherin、Snail mRNA相对表达量均高于癌旁正常组织,miR-331-3p、E-cadherin mRNA相对表达量均低于癌旁正常组织(P均<0.01)。CRC组织miR-331-3p、MLLT10 mRNA表达与TNM分期、淋巴结转移有关(P均<0.05),而与性别、年龄、肿瘤最大径、肿瘤位置、组织分化程度无关(P均>0.05)。Pearson相关分析显示,CRC组织miR-331-3p表达与MLLT10 mRNA表达呈负相关(r=-0.678,P<0.05);CRC组织miR-331-3p表达与E-cadherin mRNA表达呈正相关(r=0.589,P<0.05),与N-cadherin、Snail mRNA表达呈负相关(r分别为-0.712、-0.654,P均<0.05);CRC组织MLLT10 mRNA表达与E-cadherin mRNA表达呈负相关(r=-0.549,P<0.05),与N-cadherin、Snail mRNA表达呈正相关(r分别为0.668、0.714,P均<0.05)。结论CRC组织miR-331-3p低表达、MLLT10 mRNA高表达,二者表达与TNM分期、淋巴结转移以及上皮间质转化密切相关。

RIP3/MLKL通过激活4EBP1-eIF4E通路诱导程序性坏死

目的:程序性坏死是一种由受体相互作用蛋白3(receptor interacting protein 3,RIP3)和混合谱系激酶域样蛋白(mixed lineage kinase domain-like protein,MLKL)介导的细胞死亡形式,有研究指出哺乳动物雷帕霉素靶蛋白通路可能参与程序性坏死的调控,真核细胞翻译起始因子4E结合蛋白1(eukaryotic translation initiation factor 4Ebinding protein 1,4EBP1)-真核起始因子4E(eukaryotic initiation factor 4E,eIF4E)通路是哺乳动物雷帕霉素靶蛋白最重要的下游分子通路之一,然而此通路是否参与程序性坏死的发生,目前尚无相关研究。本研究旨在探索4EBP1-eIF4E通路在程序性坏死中是否发生改变。方法:首先向小鼠上皮样成纤维细胞系L929细胞中加入程序性坏死诱导剂TSZ(TNF-α/SM-164/Z-VAD-FMK),在光学显微镜下观察细胞坏死情况;进一步向敲除RIP3和MLKL基因的L929细胞中加入TSZ,采用碘化丙啶(propidium iodide,PI)染色观察细胞坏死情况,实时荧光定量聚合酶链反应和蛋白质印迹法检测4EBP1和eIF4E的mRNA和蛋白质表达水平。结果:野生型L929细胞用TSZ处理后,坏死细胞增加,4EBP1的mRNA和蛋白质表达水平明显下调且磷酸化的4EBP1(phosphorylated 4EBP1,p-4EBP1)/4EBP1值增加(P<0.05或P<0.01),eIF4E的mRNA表达水平明显上调且磷酸化的eIF4E(phosphorylated eIF4E,p-eIF4E)/eIF4E值增加(均P<0.01);在敲除L929细胞中的RIP3和MLKL基因后,PI阳性坏死细胞明显减少,4EBP1的mRNA和蛋白质表达水平明显上调且p-4EBP1/4EBP1值下降(P<0.05或P<0.01),eIF4E的mRNA表达水平明显下调且p-eIF4E/eIF4E值下降(均P<0.01)。结论:4EBP1-eIF4E通路在RIP3/MLKL介导的程序性坏死中发生活化。

抑制MLK3对铁过载肾衰竭小鼠心肌纤维化的作用观察

目的探讨抑制混合谱系激酶3(MLK3)对铁过载肾衰竭小鼠心肌纤维化的作用。方法将75只小鼠随机分为肾衰竭模型组60只和假手术组15只,肾衰竭模型组采用5/6肾切除术构建肾衰竭模型,假手术组仅切开背部皮肤后缝合。将造模成功的肾衰竭模型组小鼠分为肾衰竭组、肾衰竭铁过载组、MLK3抑制组、MLK3恢复组,每组各15只。肾衰竭铁过载组、MLK3抑制组、MLK3恢复组均给予0.2 mg/g右旋糖酐铁腹腔注射构建铁过载模型。MLK3抑制组于末次注射右旋糖酐铁后,给予MLK3抑制剂腹腔注射;MLK3恢复组先给予MLK3抑制剂灌胃,2周后给予尾静脉注射MLK3腺相关病毒。小鼠处死,取心脏组织,采用普鲁士蓝染色法检查心脏组织铁沉积情况;采用HE染色法观察心脏组织结构改变;采用Masson染色法观察心脏组织纤维化情况;采用免疫荧光法检测心脏组织纤维化相关蛋白波形蛋白(Vimentin)表达。结果普鲁士蓝染色显示,假手术组和肾衰竭组心脏组织无明显铁沉积,铁过载组心脏组织铁沉积明显增多。HE染色显示,假手术组和肾衰竭组心肌纤维排列整齐,细胞结构完整;铁过载组心肌纤维排列紊乱,结构破坏,细胞着色不均匀;MLK3抑制组心肌组织纤维排列较铁过载组整齐,但偶有少许纤维破裂;与MLK3抑制组比较,MLK3恢复组心肌纤维排列杂乱无章,断裂痕迹明显。Masson染色显示,铁过载组有明显蓝色胶原纤维;与铁过载组比较,MLK3抑制组蓝色胶原纤维沉积减少;与MLK3抑制组比较,MLK3恢复组蓝色胶原纤维明显增多。肾衰竭组心脏组织Vimentin表达较假手术组升高;与肾衰竭组比较,铁过载组Vimentin表达升高;与铁过载组比较,MLK3抑制组Vimentin表达降低;与MLK3抑制组比较,MLK3恢复组Vimentin表达升高(P<0.05或<0.01)。结论铁过载可能通过影响MLK3促进心肌纤维化的发生;抑制MLK3能够改善铁过载肾衰竭小鼠心肌纤维化程度。

混合谱系酶3与神经细胞凋亡的研究进展

混合谱系酶3(MLK3)是丝裂原活化蛋白激酶激酶激酶(MAP3Ks)中的一员,广泛表达于人体组织中,可以激活不同的MAPK途径来调控细胞的增殖、分化、迁移和凋亡。近几年的研究发现其活性的变化在神经细胞的凋亡中发挥重要作用,可通过激活JNK或p38MAPK通路介导神经细胞凋亡,并且对MLK3活性的抑制可以减少神经细胞的凋亡及相应的脑损害。因此,深入、系统的研究MLK3在神经细胞凋亡的作用机制,可能为神经系统疾病中神经细胞的凋亡提供新的靶点。

冠状动脉粥样硬化性心脏病患者血浆RIPK1,RIPK3及MLKL水平变化及其临床预测价值

目的:冠状动脉粥样硬化性心脏病(coronary atherosclerotic heart disease,CHD)为冠状动脉发生粥样硬化引起管腔狭窄甚至闭塞,导致心肌缺血、缺氧或坏死而引起的心脏病,其发病率长期居高不下,CHD的防治具有重要意义。本研究旨在探讨CHD患者血浆程序性坏死标志蛋白受体相互作用蛋白激酶1(receptor-interacting protein kinase 1,RIPK1)、受体相互作用蛋白激酶3(receptor-interacting protein kinase 3,RIPK3)及混合系列蛋白激酶结构域蛋白(mixed-lineage kinase domain-like protein,MLKL)水平变化及其临床预测价值。方法:纳入2015年9月至2017年5月经冠状动脉造影确诊的CHD住院患者190例以及健康受试者70例。根据CHD类型分为稳定型心绞痛组(SAP,n=46)、不稳定型心绞痛组(UAP,n=56)、非ST段抬高型心肌梗死组(NSTEMI,n=42)和ST段抬高型心肌梗死组(STEMI,n=46)。根据冠状动脉造影结果将CHD患者分为单支病变组、双支病变组及多支病变组,同时采用Gensini评分评估冠状动脉狭窄程度。采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测患者血浆RIPK1,RIPK3,MLKL水平。结果:CHD患者血浆RIPK1,RIPK3,MLKL水平显著高于对照组(P<0.05),且UAP组血浆RIPK1,RIPK3,MLKL水平显著高于SAP组(P<0.05),NSTEMI组及STEMI组显著高于UAP组(P<0.05)。而NSTEMI组与STEMI组血浆RIPK1,RIPK3及MLKL水平差异无统计学意义(P>0.05)。血浆RIPK1,RIPK3,MLKL水平随着冠状动脉病变支数的增加而升高(P<0.05),并且与Gensini评分呈正相关。多因素logistic回归显示:RIPK1,RIPK3,MLKL是冠状动脉严重狭窄的独立危险因素。出院后平均随访24个月,根据是否发生主要不良心血管事件(major adverse cardiovascular events,MACE),将患者分为发生MACE组及未发生MACE组。与未发生MACE组相比较,发生MACE组血浆RIPK1,RIPK3及MLKL水平显著升高(P<0.05)。受试者操作特征(receiver operator characteristic,ROC)曲线分析显示:血浆RIPK1曲线下面积为0.72(P<0.001),RIPK3曲线下面积为0.83(P<0.001),MLKL曲线下面积为0.75(P<0.001)。结论:血浆程序性坏死标志蛋白质RIPK1,RIPK3及MLKL水平与CHD密切相关,且对CHD患者预后的评估具有一定的预测价值。

新型受体相互作用蛋白激酶3突变体的激酶活性研究

目的·研究新型受体相互作用蛋白激酶3(receptor interacting protein kinase 3,RIPK3)突变体的激酶活性。方法·分别对RIPK3中的4个氨基酸(Q84WDF87)进行突变,并将这些突变体与混合谱系蛋白激酶样假激酶(mixed lineage kinase domain likepseudokinase,MLKL)共同转染到HEK293T细胞中。通过Western blotting检测新型RIPK3突变体S232位点自磷酸化的情况及其对MLKL S345位点磷酸化的影响;通过免疫共沉淀法观察RIPK3与MLKL之间的相互作用;采用非还原裂解法检测MLKL的寡聚化情况。结果·RIPK3ΔQ84、RIPK3ΔW85和RIPK3ΔD86的激酶活性显著降低,RIPK3Q84A/RIPK3Q84E、RIPK3W85Y和RIPK3D86A/RIPK3D86Y的激酶活性无明显改变;RIPK3W85A的自磷酸化减少,但不影响MLKL的磷酸化与寡聚化。结论·Q84、W85与D86是调节RIPK3激酶活性的关键氨基酸位点,RIPK3W85A的激酶活性减弱,但其对MLKL无影响。

LncRNA NR003508通过海绵吸附miR-483-3p并靶向MLKL调控BCG感染小鼠巨噬细胞坏死

旨在探讨LncRNA NR_003508在牛分枝杆菌卡介苗(Bacillus Calmette-Guérin, BCG)感染中对小鼠巨噬细胞坏死的调控作用。本研究利用小干扰RNA技术干扰小鼠巨噬细胞系RAW264.7中LncRNA NR_003508的表达,并结合BCG感染,采用Western blot、免疫荧光和流式细胞术等技术检测坏死相关调控因子混合谱系激酶结构域样蛋白(MLKL)的表达水平和细胞坏死率,以及通过生物信息学和双荧光素酶报告基因技术分别预测和验证LncRNA NR_003508与miR-483-3p的靶向结合。结果表明,BCG感染巨噬细胞后,LncRNA NR_003508表达水平显著上调(P<0.01);转染siRNA-LncRNA NR_003508后,MLKL蛋白表达显著下调(P<0.01),同时巨噬细胞坏死率也显著降低(P<0.05);LncRNA NR_003508可以与miR-483-3p特异性结合并发挥海绵吸附作用,并且干扰LncRNA NR_003508可显著上调miR-483-3p的表达(P<0.01),而过表达miR-483-3p显著抑制MLKL的表达(P<0.01),同时抑制巨噬细胞坏死。以上研究结果表明,LncRNA NR_003508通过海绵吸附miR-483-3p并靶向MLKL的表达来促进BCG诱导的巨噬细胞坏死。

寻常型银屑病患者皮损组织中miR-145-5p、MLK3表达变化及意义

目的探讨寻常型银屑病(PV)患者皮损组织中微小RNA(miR)-145-5p、混合谱系酶3(MLK3)表达及意义。方法选取78例PV患者,根据病情严重程度分为轻度组(n=31)、中度组(n=28)、重度组(n=19)。采用RT-qPCR检测皮损组织和相邻非皮损组织中miR-145-5p和MLK3、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、干扰素-γ(IFN-γ)、白细胞介素-2(IL-2)、IL-17 mRNA表达。采用免疫组化法检测皮损组织和相邻非皮损组织中MLK3蛋白阳性表达率。比较不同病情严重程度PV患者皮损组织中miR-145-5p和MLK3、TNF-α、IFN-γ、IL-2、IL-10、IL-17 mRNA表达。Pearson法分析PV患者皮损组织中miR-145-5p、MLK3 mRNA表达与TNF-α、IFN-γ、IL-2、IL-10、IL-17 mRNA表达的相关性。结果与非皮损组织比较,皮损组织中miR-145-5p、IL-10 mRNA表达降低,MLK3、TNF-α、IFN-γ、IL-2、IL-17 mRNA表达升高(t分别为21.552、18.539、28.414、8.540、26.356、15.010、11.952,P均<0.01)。轻度组、中度组、重度组皮损组织中miR-145-5p、IL-10 mRNA表达依次降低,MLK3、TNF-α、IFN-γ、IL-2、IL-17 mRNA表达依次升高(P均<0.01)。与非皮损组织比较,皮损组织中MLK3蛋白阳性表达率升高,重度组MLK3蛋白阳性表达率高于轻度组、中度组,中度组MLK3蛋白阳性表达率高于轻度组(P均<0.01)。Pearson相关性分析显示,PV患者皮损组织中miR-145-5p表达与MLK3、TNF-α、IFN-γ、IL-2、IL-17 mRNA表达呈负相关(r分别为-0.627、-0.433、-0.546、-0.499、-0.502,P均<0.01),与IL-10 mRNA表达呈正相关(r=0.652,P<0.01);MLK3与TNF-α、IFN-γ、IL-2、IL-17 mRNA表达呈正相关(r分别为0.620、0.595、0.556、0.597,P均<0.01),与IL-10 mRNA表达呈负相关(r=-0.733,P<0.01)。结论PV患者皮损组织中miR-145-5p低表达,MLK3 mRNA高表达;检测二者表达有助于病情判断。

平滑肌细胞特异性MLK3基因敲除小鼠模型的构建

目的:构建平滑肌细胞特异性混合谱系激酶3(MLK3)基因敲除小鼠模型。方法:利用胚胎干细胞基因打靶技术在MLK3基因第4~8外显子两端插入loxP位点以制备MLK3-loxP小鼠,该小鼠与平滑肌细胞特异性启动子Tagln介导表达Cre重组酶的小鼠杂交,以获得平滑肌细胞特异性MLK3基因敲除小鼠;提取鼠尾基因组DNA,PCR鉴定基因型;收取主动脉组织进行免疫荧光染色,检测平滑肌细胞MLK3的表达;收取主动脉组织进行免疫组化染色,分析平滑肌细胞收缩标志物肌球蛋白重链11(Myh11)的表达;尾套法测定小鼠血压;全自动生化仪测定葡萄糖、甘油三脂、总胆固醇、高密度脂蛋白和低密度脂蛋白等生化指标。结果:PCR鉴定基因型确认Cre基因型为阳性,MLK3-loxP基因型为纯合阳性;免疫荧光共定位染色显示野生型小鼠主动脉平滑肌细胞有MLK3蛋白表达,而特异性敲除小鼠平滑肌细胞的MLK3蛋白表达缺失;免疫组化显示平滑肌细胞特异性MLK3基因敲除小鼠主动脉平滑肌细胞收缩表型标志物Myh11蛋白表达减少;特异性敲除小鼠基础状态下的血压、血糖和血脂与野生小鼠相比均无显著差异。结论:平滑肌细胞特异性MLK3基因敲除小鼠构建成功,为进一步实验奠定基础。

MLK3基因敲除抑制骨骼肌损伤后再生

目的:探讨混合谱系激酶3(MLK3)在骨骼肌损伤后再生中的作用及其机制。方法:小鼠胫骨前肌注射心脏毒素制备骨骼肌损伤模型;RT-qPCR及Western blot检测损伤后0、1、3、5 d胫骨前肌中MLK3的表达变化;损伤7 d的骨骼肌进行麦胚凝集素染色和Masson染色,观察损伤后骨骼肌再生和纤维化程度;损伤3 d的骨骼肌进行免疫荧光染色观察肌卫星细胞标志物配对盒蛋白7(PAX7)的表达;RT-qPCR检测肌卫星细胞分化相关基因Myod和Myog表达;Western blot检测细胞外信号调节激酶1/2(ERK1/2)、c-Jun氨基末端激酶和p38的磷酸化水平。结果:损伤后3 d,骨骼肌中MLK3表达显著升高。损伤后7 d,MLK3基因敲除小鼠的新生肌纤维面积显著减小,间质纤维化面积增加。损伤后3 d,MLK3基因敲除小鼠骨骼肌中PAX7阳性肌卫星细胞比例、Myod和Myog表达水平及ERK1/2磷酸化水平均显著低于野生型小鼠。结论:MLK3通过调控ERK1/2信号通路在骨骼肌再生过程中发挥重要作用。

电针调节RIP1/RIP3/MLKL通路对脑缺血再灌注损伤大鼠神经元程序性坏死的影响

目的:探讨电针“曲池”“足三里”对脑缺血再灌注损伤大鼠的神经保护作用及对大脑皮层神经元程序性坏死的影响。方法:SD大鼠随机分为假手术组、模型组、电针组、抑制剂组,每组15只。模型组、电针组及抑制剂组大鼠采用改良线栓法制备左侧大脑中动脉阻塞模型;假手术组大鼠仅暴露颈动脉。给予电针组大鼠右侧“曲池“”足三里”电针治疗,30 min/次,1次/d,给予抑制剂组大鼠腹腔注射坏死抑素-1(0.6 mg/kg),均连续干预7 d。观察各组大鼠神经功能缺损评分;HE染色检测梗死区大脑皮层病理损伤程度;TUNEL染色检测梗死区大脑皮层神经元凋亡情况;ELISA法检测梗死区大脑皮层肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素(IL)-1β、IL-6含量;荧光定量PCR及Western blot法分别检测梗死区大脑皮层受体相互作用蛋白(RIP)1、RIP3、底物混合谱系激酶样蛋白(MLKL)mRNA及蛋白的表达水平。结果:与假手术组相比,模型组大鼠神经功能缺损评分明显升高(P<0.01);HE染色显示,梗死区大脑皮层表现出明显脑缺血再灌注病理损伤;梗死区大脑皮层神经元凋亡率,梗死区大脑皮层中TNF-α、IL-1β、IL-6含量,梗死区大脑皮层RIP1、RIP3、MLKL mRNA及蛋白表达水平均明显升高(P<0.01)。与模型组相比,电针组大鼠神经功能缺损评分降低(P<0.01);HE染色显示,梗死区大脑皮层病理损伤程度明显改善;梗死区大脑皮层神经元凋亡率,梗死区大脑皮层中TNF-α、IL-1β、IL-6含量,梗死区大脑皮层RIP1、RIP3、MLKL mRNA及蛋白表达水平均明显降低(P<0.05,P<0.01)。结论:电针干预可能通过抑制大鼠大脑皮层神经元程序性坏死,缓解脑缺血再灌注损伤,发挥神经保护作用。

梓醇调节RIP1/RIP3/MLKL信号通路对急性心肌梗死大鼠坏死性凋亡的影响

目的探究梓醇(CAT)对急性心肌梗死(AMI)大鼠坏死性凋亡的影响。方法用结扎左冠状动脉前降支的方法构建大鼠AMI模型。将60只SPF级SD雄性大鼠随机分为假手术组(Sham组)、AMI模型组(Model组)、低剂量CAT组(CAT-L组,30 mg·kg^(-1) CAT)、高剂量CAT组(CAT-H组,60 mg·kg^(-1) CAT)和高剂量CAT+RIP1激活剂重组RIP1组[CAT-H+rRIP1组,60 mg·kg^(-1) CAT+8μg·kg^(-1)重组大鼠受体相互作用蛋白激酶-1(rRIP1)],每组12只。CAT采取灌胃给药,每日1次,共给药4周。rRIP1采取尾静脉注射,隔天给药,共4周。Sham组、Model组分别灌胃和尾静脉注射等量的0.9%NaCl。CAT-L组、CAT-H组灌胃的同时需隔天尾静脉注射0.9%NaCl。TUNEL染色法观察大鼠心肌细胞凋亡情况。蛋白质印迹法检测大鼠心肌组织RIP1/RIP3/MLKL信号通路相关蛋白的表达。结果Sham组、Model组、CAT-H组和CAT-H+rRIP1组大鼠的心肌细胞凋亡率分别为(4.23±0.63)%、(33.48±3.94)%、(13.50±1.86)%和(29.62±3.08)%,心肌组织RIP1蛋白相对表达水平分别为0.21±0.02、0.86±0.09、0.43±0.04和0.72±0.07,RIP3蛋白相对表达水平分别为0.30±0.03、0.94±0.09、0.49±0.05和0.83±0.08,MLKL蛋白磷酸化水平分别为0.35±0.04、1.13±0.11、0.64±0.06和0.97±0.10。Model组上述指标与Sham组比较,CAT-H组的上述指标与Model组和CAT-H+rRIP1组比较,在统计学上差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论CAT可能通过下调RIP1/RIP3/MLKL信号通路抑制AMI大鼠心肌细胞的坏死性凋亡。

MLL3基因对宫颈癌细胞放射敏感性和DNA损伤修复能力的影响

目的:探究髓系/淋巴系或混合谱系白血病3基因(myeloid/lymphoid or mixed-lineage leukemia 3,MLL3)对宫颈癌细胞生长、转移、放射敏感性的影响。方法:选择60例宫颈鳞癌患者的癌组织及配对癌旁组织,采用实时定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)检测检测MLL3 mRNA水平。体外培养SiHa细胞,将其分为以下5组:Control组(不转染)、NC-sh组(转染阴性对照shRNA慢病毒)、MLL3-sh组(转染MLL3 shRNA慢病毒)、NC-OE组(转染阴性对照过表达慢病毒)和MLL3-OE组(转染MLL3过表达慢病毒)。进一步采用2300EX直线加速器9 MeVβ射线照射细胞建立放射抵抗SiHa细胞(SiHaR),然后将其分为:NC-sh组、MLL3-sh组、8 Gy+NC-sh组和8 Gy+MLL3-sh组。NC-sh组和MLL3-sh组细胞不照射,8 Gy+NC-sh组和8 Gy+MLL3-sh组细胞用9 MeVβ射线照射8 Gy。采用MTT法检测细胞增殖情况;Annexin V-FITC/PI双染色法检测细胞凋亡;Transwell检测细胞侵袭能力;qRT-PCR检测MLL3、共济失调毛细血管扩张征突变基因(ATM)、ATM-Rad3相关基因(ATR)、乳腺癌易感基因(BRCA1)和RAD50双链断裂修复蛋白(RAD50)的mRNA水平;Western blot检测MLL3、Bcl-2相关X蛋白基因(Bax)、B细胞淋巴瘤/白血病-2基因(Bcl-2)、cleaved caspase 3、基质金属蛋白酶(MMP)2、MMP9和γ-H2AX的表达;免疫荧光染色检测γ-H2AX的表达。结果:与癌旁组织相比,宫颈鳞癌组织中的MLL3 mRNA水平显著降低(P<0.001)。与NC-sh组比较,MLL3-sh组SiHa细胞的MLL3 mRNA和蛋白相对表达量降低,细胞活力升高,细胞凋亡率、Bax和cleaved caspase 3蛋白相对表达量降低,Bcl-2蛋白相对表达量升高,侵袭细胞数量、MMP2和MMP9蛋白相对表达量升高(P<0.05)。与NC-OE组比较,MLL3-OE组SiHa细胞的MLL3 mRNA和蛋白相对表达量升高,细胞活力降低,细胞凋亡率、Bax和cleaved caspase 3蛋白相对表达量升高,Bcl-2蛋白相对表达量降低,侵袭细胞数量、MMP2和MMP9蛋白相对表达量降低(P<0.05)。与SiHa细胞相比,SiHaR细胞中的MLL3 mRNA和蛋白相对表达量均升高(P<0.001)。与8 Gy+NC-sh组比较,8 Gy+MLL3-sh组SiHaR细胞的细胞活力降低,γ-H2AX的蛋白相对表达量和γ-H2AX foci数目升高,ATM、ATR、BRCA1和RAD50的mRNA水平降低(P<0.05)。结论:宫颈癌细胞MLL3的表达下调促进了其生长和转移,但降低DNA损伤修复能力,提高宫颈癌细胞的放射敏感性。