基于BSA混池测序分析开发胡杨性别鉴定的标记

胡杨是中国西北地区重要的乔木树种,其在新疆的分布最为广泛,具有较强的耐旱、耐寒、抗盐碱的能力,在遏制沙漠扩展、保护生物多样性、保障工农业生产生态安全等诸多方面具有不可替代的作用。为了能够在胡杨幼苗阶段对雌雄个体进行性别鉴定,本研究提取雌雄胡杨叶片高质量的基因组DNA,分别构建文库以进行Illumina、PacBio和Hi-C测序。基于PacBio测序得到的reads进行初步组装。并采用Illumina测序得到的reads对组装结果进行纠错得到草图版本的基因组。利用Hi-C测序技术将雌雄基因组组装,对雌雄基因组进行注释、评估,获得到染色体水平的高质量雌雄基因组序列。基于BSA混池测序分析,以胡杨雄株高质量基因组为参考,对96个雌株和97个雄株的BSA-seq数据进行关联分析,筛选出雌性混池深度连续为0,同时雄性混池深度连续大于10的区域。对这些区域提取包括上下游150 bp在内的序列作为性别鉴定候选区域,将性别候选区域与胡杨高质量雌株基因组进行Blast同源比对,根据性别候选区最终筛选出胡杨雌雄共有的3对特异性引物和雄性性别连锁的4对特异性引物。结果表明胡杨待测样品在雌雄共有引物对扩增出条带的基础上,若扩增出100~300 bp大小的特有条带则为雄性,若未扩增出目标条带,则为雌性。这为在幼苗期对胡杨性别进行鉴定提供了重要的理论依据,为解决行道树旁胡杨飞絮污染问题和商业化种植与应用提供了可靠的解决方案。

基于混池测序的抗玉米灰斑病QTL定位

玉米灰斑病是由玉米尾孢菌(Cercospora zeine)和玉蜀黍尾孢菌(Cercospora zeae-maydis)引起的真菌性病害,是世界范围内重要的玉米叶部病害之一。以玉米灰斑病抗病自交系Suwan1和感病自交系HM01构建的BC1F1群体为研究材料,在自然发病条件下通过对BC1F1群体中玉米灰斑病的抗性鉴定,选择30株抗病材料和30株感病材料分别构建DNA抗、感混池。在对两个混池进行高通量测序后,通过质量控制和数据分析得到两个极端混池中的变异信息。利用高质量SNP标记对应的两个混池中测序深度差异进行统计检验,成功鉴定了29个玉米灰斑病抗性QTL(quantitative trait loci)。利用Maize GDB网站在29个抗病QTL内共搜索到2 768个基因,通过Phytozome网站与拟南芥和水稻基因组进行同源比对,在1号、5号和10号染色体上分别确定了1个基因作为抗玉米灰斑病的候选基因。

基于基因混池测序技术的小麦条锈菌对三唑酮抗性位点相关分析

为探究小麦条锈菌Puccinia striiformis f. sp. tritici对三唑类杀菌剂产生抗药性的相关机理,以小麦条锈菌抗药性菌株YQ324与敏感性菌株贵1-2在转主寄主堆花小檗Berberis aggregata上构建的有性遗传群体为材料,通过离体叶段法对F1代杂交及F2代自交后代的夏孢子群体进行三唑酮敏感性生物学测定,并在F2代夏孢子群体中筛选20株抗药性菌株和20株敏感性菌株分别构建DNA抗、感池。在对抗、感混池进行高通量测序之后,通过质量检测和数据分析得到2个极端混池中的变异信息。根据ΔIndex为1的筛选标准在小麦条锈菌中鉴定出67个与三唑酮抗性显著相关的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)位点;利用SNPEff软件对这些SNP位点引起氨基酸非同义突变所在的基因序列进行功能注释,最终在pcontig030上筛选到Pst104E09436和Pst104E09437这2个基因作为小麦条锈菌对三唑酮抗性相关的候选基因。

基于混池测序的犬恐惧行为相关变异位点的初步筛选

为了初步筛选与犬恐惧行为相关的变异位点,对6~8月龄的犬进行严格的恐惧行为测试,根据测试结果选取恐惧行为极端差异的史宾格犬20头,分为高恐惧行为组(FBH)和低恐惧行为组(FBL),每组各10头,采用混池测序的方法检测史宾格犬全基因组的单核苷酸多态性位点(SNP)和插入缺失位点(InDel),筛选与史宾格犬恐惧行为相关的变异位点。结果显示:通过特定条件的筛选,FBH组和FBL组存在差异的SNPs共14个,InDels共2个,这16个位点位于9个基因上。研究表明,通过混池测序的方法可以初步筛选出与犬恐惧行为相关的变异位点,进一步分析确定与恐惧行为遗传效应相关的变异位点,可以为犬遗传育种改良提供理论依据。

控制玉米株高基因PHR1的基因克隆

株高属于玉米理想株型育种的一个重要指标,不但影响玉米机械化收获,更与玉米的倒伏性和生物产量密切相关。本研究以低剂量快中子(4.19 Gy)辐照诱变玉米自交系KWS39获得的矮秆低穗位突变体为研究对象,该突变体命名为plant height reducing mutant-1(phr-1),开展了表型性状的田间调查分析,并利用phr-1×B73获得的F2分离群体,借助极端性状混池测序分析法(BSA-seq)及目标区段重组交换鉴定的方法,基于B73参考基因组对目标区段内的基因进行挖掘和功能注释,定位候选基因。研究结果表明,在1号染色体Bin1.06区间可能存在变异位点,进而利用大的分离群体结合目标区段多态性标记开发,将目标区段精细定位分子标记到Umc1122和Umc1583a两个标记之间约600 kb区间,该区段内存在一个控制株高的已知基因Brachytic2(BR2),BR2编码一个调控玉米茎秆中生长素极性运输的糖蛋白。候选基因测序结果表明,phr-1是BR2基因在第4个外显子处插入了165 bp的序列,导致第547位氨基酸变为终止子,蛋白翻译提前终止。phr-1的基因突变位点和变异方式与已报道的br2-1单个碱基发生变异位点完全不同,通过等位杂交实验证明了phr-1突变体就是br2-1的一个新等位突变体,候选基因就是BR2基因。本研究为玉米BR2基因在玉米株高遗传改良中提供了新的种质资源。

小尾寒羊线粒体基因组遗传变异分析

本试验旨在利用基因组扫描策略和DNA混池测序技术分析小尾寒羊线粒体基因组遗传变异。结果表明,小尾寒羊线粒体基因组编码区共有95个变异位点,多肽编码区除ATPase8基因无突变外,其余12个多肽编码基因均有突变位点,变异位点总数为83个,错义突变为19个,分别为:T3544A、T4209C、C7501A、A8040G、G8265C、A9376G、C9975T、G10119A、G10938A、G11046A、G12571C、G13041A、C13576T、T13588C、C13777T、C13789T、T13837C、T13855C、A13876G。12SrRNA区域有3个变异位点,分别为:T281C、C291T、A538G;16SrRNA区域有5个变异位点,分别为:A1099T、T1112C、T2200C、C2444T、T2635C;tRNA区域有4个突变位点,分别为:tRNA-Tyr(G5295A)、tRNA-Lys(T7720G)、tRNA-His(C11607T)、tRNA-Ser(G11669A)。由此可知,小尾寒羊线粒体基因组编码区多态性较丰富,该试验结果为核外遗传效应研究提供了分子生物学基础。

基于BSA-Seq技术挖掘大豆中黄622的多小叶基因

栽培大豆(Glycine max)叶片一般为三出复叶,也有个别品种或植株突变体产生4~7个小叶,为多小叶。复叶的形成使植物对外界环境的适应能力增强,对大豆多小叶相关基因的挖掘和研究有助于改善大豆农艺性状和产量表现。本研究从大豆栽培品种中品661的突变体库中鉴定出一个多小叶突变体——中黄622,每个复叶有4~9个小叶。利用该突变体与中品661配制组合,分别于北京和海南调查F_2和F_(2:3)植株叶片表型,结果表明,多小叶性状受1对不完全显性基因控制。采用BSA-seq方法进行定位,利用F2正常三出复叶和多小叶个体分别构建混池,测序结果与参考基因组平均比对效率为98.83%,平均覆盖深度为32.75×,基因组覆盖度为99.22%。ED方法关联分析发现,在11号染色体定位到2个区域,总长度为5.29 Mb,共包含1103个基因。根据SNP-index方法关联分析,当置信度为0.99时,在11号染色体鉴定出3个区域,总长度为3.42 Mb,共包含701个基因。2种关联分析方法同时定位的基因有690个,亲本之间存在SNP的基因有6个。本研究结果为大豆多小叶基因图位克隆奠定了基础。

基于BSA-seq技术挖掘芝麻株高相关候选基因

为了进一步挖掘芝麻株高相关基因,为适机收芝麻新品种选育提供理论指导,以冀航芝1号和DW607为亲本构建F 2群体,并构建以株高为目标性状的极端混池,利用BSA-seq技术,采用ED和Δ(SNP-index或InDel-index)2种方法挖掘株高相关的染色体区段,注释区段内的基因信息,利用GO和KEGG等数据库分析注释基因的功能。结果发现,亲本之间共获得298634个SNP和76360个InDel,混池之间共获得24048个SNP和9630个InDel;基于SNP标记的ED方法关联到5个染色体区段,ΔSNP-index方法关联到3个染色体区段,两者的交集有3个;基于InDel标记的ED方法关联到5个染色体区段,ΔInDel-index方法关联到8个染色体区段,两者的交集有8个;4个染色体区段同时被SNP和InDel标记关联到,共注释到330个基因,比对到的前20个KEGG通路主要包括植物激素信号转导和能量代谢;GO富集结果表明,有18个基因参与生长素响应,可能是参与株高调控的关键基因。

四倍体马铃薯块茎蛋白含量分子标记的开发与验证

块茎蛋白含量是马铃薯的重要品质性状之一,相关分子标记的开发研究较少。本研究以马铃薯高蛋白品种大西洋、低蛋白品种定薯1号及包含173份子代的蛋白含量分离群体为材料,通过高通量简化基因组测序技术与集群分离分析(BSA)相结合,开发了SCAR8-107标记,并以此标记对分离群体的74份高蛋白、42份低蛋白子代及54个四倍体马铃薯品种验证表明,SCAR8-107标记在后代分离群体和四倍体马铃薯品种中的检测结果与表型蛋白含量的对应度分别达到了90.51%和72.97%,经过Pearson’s双侧相关性分析,相关性均达到了极显著水平。SCAR8-107的开发对于四倍体马铃薯块茎蛋白含量标记辅助选择与加速马铃薯品质育种具有重要意义。

与小麦抗白粉病基因Pm48紧密连锁分子标记的开发

Pm48为本实验室鉴定的一个抗白粉病新基因。为精细定位该基因,利用混池ddRAD测序鉴定了81个与该基因关联的序列,开发了STS标记Xmp931,转化了CAPS标记Xmp928、Xmp930和Xmp936;同时,利用粗山羊草基因组序列开发了71个基因组SSR标记,定位了其中的Xmp1089和Xmp1112。在115个宁糯麦1号′Tabasco衍生的F2:3家系中,Xmp928与目的基因共分离,Xmp1112位于近着丝粒方向处距抗病基因3.1 c M。在671个纯合感病家系中,标记Xmp928仍与目的基因共分离。利用3个中国春5DS缺失系,最终将Pm48定位在小麦5DS上0.63–0.67的臂区段中。

小麦贵协3号成株期抗条锈病基因的遗传定位

贵协3号对当前的条锈病流行小种表现为近免疫或高抗。为更好地利用贵协3号,拓宽小麦抗性育种资源,以Avocet S(来自澳大利亚的高感条锈病小麦品种)为母本、贵协3号为父本构建的F_(2:7)代重组自交系(RIL)群体为材料,运用集群分离分析法(BSA)并结合转录组测序(BSR-Seq)和小麦55K SNP芯片技术对抗条锈病QTL进行遗传定位。结果表明,共检测到有7个抗条锈病QTL,分别位于小麦1B(1)、2A(2)、2D(1)、5A(2)和6B(1)染色体上。其中位于2AS染色体上的Qyr.gaas.2A在三个环境中均被检测到,置信区间为AX-108824773~AX-111675237(0~2.5 cM),对应的物理区间为15.87~31.89 Mb(16.02 Mb),可解释17.07%~34.59%的表型变异。为了进一步提高该QTL的定位精度,在2AS染色体目标区段内设计了103对SSR标记引物,并选择2AS染色体上已报道的22个SSR标记,在双亲、抗感池和RIL群体中进行筛选和验证。最终筛选出6个多态性标记(Xcfd36、Xwmc382、hls-2A-04、hls-2A-17、hls-2A-18和hls-2A-103)可将Qyr.gaas.2A缩小到3.04 Mb的物理区间(15.87~18.91 Mb)内。在该目标区间共预测到13个候选基因,将在下一步的研究中进行分析验证。

黄瓜/酸黄瓜渐渗系‘IL77’抗蔓枯病主效QTL定位及候选基因鉴定

以黄瓜/酸黄瓜渐渗系‘IL77’为抗病亲本,栽培种‘8419’为感病亲本,通过亲本及F2:6群体筛选,构建了包含137对SSR标记和6对InDel标记的遗传图谱,结合2017年春、秋两季F2:6群体表型统计结果对抗蔓枯病主效QTL进行定位;同时构建极端混池并进行QTL-seq,最终将抗病基因定位到1号染色体24.6～27.1 Mb范围内;通过与参考基因组9930比对发现该区段存在13个基因在外显子区域发生非同义突变,其中Csa1G654870参与RNAi抗性反应,可能与抗蔓枯病过程相关。通过qRT-PCR验证发现,接种前后Csa1G654870在抗病亲本‘IL77’中表达量明显高于感病亲本‘8419’,由此进一步推断Csa1G654870是抗蔓枯病基因。