胃癌组织中鸡卵清蛋白上游启动子转录因子Ⅱ、神经纤毛蛋白2的表达变化及其意义

目的观察胃癌组织中鸡卵清蛋白上游启动子转录因子Ⅱ(COUP-TFⅡ)和神经纤毛蛋白2(NRP2)的表达变化,并分析COUP-TFⅡ、NRP2表达与胃癌临床病理参数的关系。方法收集手术切除的新鲜胃癌组织及其癌旁正常胃黏膜组织各60例,采用Western blotting法和免疫组化法检测胃癌组织及正常胃黏膜组织中的COUPTFⅡ、NRP2,分析COUP-TFⅡ、NRP2表达与胃癌临床病理参数的关系。结果胃癌组织中COUP-TFⅡ、NRP2阳性表达率分别为70.0%、78.3%,正常胃黏膜组织中COUP-TFⅡ、NRP2阳性表达率分别为30.0%、21.7%。胃癌组织、正常胃黏膜组织中COUP-TFⅡ相对表达量分别为0.84±0.22、0.68±0.34,NRP2相对表达量分别为0.86±0.17、0.58±0.22,胃癌组织中COUP-TFⅡ、NRP2相对表达量均高于正常胃黏膜组织(P均<0.05)。胃癌组织中COUP-TFⅡ、NRP2表达呈正相关关系(r=0.263,P<0.05)。浸润深度为T_3、T_4的胃癌组织中COUP-TFⅡ、NRP2阳性表达率高于浸润深度T_1、T_2的胃癌组织(P均<0.05);中低分化胃癌组织中COUP-TFⅡ、NRP2阳性表达率高于高分化胃癌组织(P均<0.05);有淋巴结转移的胃癌组织中COUP-TFⅡ、NRP2阳性表达率高于无淋巴结转移的胃癌组织(P均<0.05)。结论 COUP-TFⅡ、NRP2在胃癌组织中高表达,并与胃癌的浸润深度、分化程度及淋巴结转移有关,二者可能协同参与了胃癌的发生和发展。

鸡卵清蛋白基因启动子调控GFP基因在鸡原代输卵管上皮细胞和中国仓鼠卵巢细胞的表达

特异性扩增家鸡卵清蛋白基因上游调控序列 1340bp～ +16 5 5bp片段和第一内含子 +49bp～ +16 5 5bp片段 ,去除pG FP N2载体自身的CMV启动子 ,分别构建了P2 9koval GFP和P1 5koval GFP两种表达载体 ,经测序和酶切鉴定表达载体构建正确。采用脂质体转染法分别将这两种载体、pGFP N2 (阳性对照 )质粒及阴性对照转染鸡原代输卵管上皮细胞和中国仓鼠卵巢细胞。用荧光倒置显微镜观测绿色荧光蛋白的表达。结果表明 :两种表达质粒在鸡原代输卵管上皮细胞和中国仓鼠卵巢细胞中都可以表达荧光蛋白。结果既显示卵清蛋白第一内含子对基因的表达起到一定的调控作用 ,也显示卵清蛋白启动子对输卵管上皮细胞和卵巢细胞不存在特异性 ,并且不存在种属差异性。

鸡卵清蛋白上游启动子转录因子Ⅱ的功能及其在肿瘤中的作用

鸡卵清蛋白上游启动子转录因子（COUP-TF）Ⅱ是一种转录调节因子,在器官发育和血管生成的过程中起着重要的作用,近几年来发现它能调节多个信号通路来控制多种肿瘤细胞生长和血管生成及淋巴管的生成,且被证实与多种肿瘤的发生和转移有至关重要的作用^（[1]）。本文研究其在非腺癌膀胱癌中的表达,并重点对COUP-TFⅡ的表达、功能调节及其在相关肿瘤中的作用进行综述。

鸡卵清蛋白基因启动子克隆及其活性的检测

为了获得鸡输卵管特异表达的卵清蛋白基因启动子,研究在采用PCR方法从鸡心基因组DNA中扩增卵清蛋白基因启动子(5OV)的基础上,将其与p Ac GFP1-N1载体连接构建真核表达载体p Ac GFP1-5OV,并采用脂质体法将p Ac GFP1-5OV分别转染鸡输卵管上皮细胞和鸡成纤维细胞后,观察其在两种细胞中的表达活性。结果表明:利用克隆获得的5OV构建的真核表达载体p Ac GFP1-5OV在转染鸡输卵管上皮细胞后第24小时,在荧光倒置显微镜下可见绿色荧光,而转染鸡成纤维细胞后未观察到GFP表达。说明所克隆的5OV具有在输卵管上皮细胞特异表达的活性。

基于鸡卵清蛋白启动子的纳豆激酶慢病毒表达载体表达特性的研究

纳豆激酶(nattokinase,NK)是一种有效的抗血栓药物。基于已构建的纳豆激酶慢病毒表达载体,旨在比较其在鸡输卵管上皮细胞和鸡胚成纤维细胞中特异性表达的有效性。提取含卵清蛋白启动子(ovalbumin promoter,OV2)和雌激素反应元件(estrogen response element,ERE)的pLV-OV2-ERE-NK-2A-EGFP重组质粒。通过PCR和双酶切进行初步鉴定,经生物公司测序、包装和滴定得转染传代培养的鸡输卵管上皮细胞和鸡胚成纤维细胞,并采用荧光显微镜和qPCR法检测细胞表达产物。结果表明,载体pLV-OV2-ERE-NK-2A-EGFP构建成功;且荧光显微镜下,鸡输卵管上皮细胞的绿色荧光多于成纤维细胞;qPCR检测发现 NK 正常表达。提示成功构建纳豆激酶慢病毒表达载体且在鸡输卵管上皮细胞中正常表达。

鸡卵清蛋白基因转录起始点的确定及表达载体的构建

采用 5′RACE方法确定鸡卵清蛋白基因转录起始点的位置 ,通过序列分析得出转录起始点为G ,从而确定出核心启动子及上游调控区的位置。应用PCR技术分别扩增两段卵清蛋白基因上游调控序列的两个片段 ,长度分别为 1 5kb和 2 9kb。经PCR测序和克隆测序后 ,针对突变的碱基进行修复 ,并将修复的两片段分别连接在带有绿色荧光蛋白报告基因pGFP N2载体上 ,为使pGFP N2载体本身的CMV启动子不影响对鸡卵清蛋白启动子的研究 ,将其切去 ,构建了P1.5koval GFP和P2 .9koval GFP两种表达载体 ,经酶切鉴定这两种表达载体构建正确。

1.1kb、2.7kb、3.0kb鸡输卵管组织特异性启动子的克隆及细胞评价

鸡卵清蛋白基因启动子是指导外源基因高效特异性表达的理想调控区,利用卵清蛋白启动子驱动外源蛋白大量表达,需要包含组织特异性相关序列。本研究以海兰白鸡的基因组为模板,采用PCR扩增了1.1 kb、2.7 kb和3.0 kb的卵清蛋白启动子区,置换pcDNA6.2-GFP中CMV启动子序列,构建了真核表达载体pOV1.1 kb-GFP、pOV2.7 kb-GFP、pOV3.0 kb-GFP;转染原代输卵管上皮细胞和中国仓鼠卵巢细胞(CHO),PCR、RT-PCR证明重组载体能够整合到细胞基因组内,并进行转录;倒置荧光显微镜下观测到绿色荧光蛋白表达;启动子表达效率由高到低依次是CMV启动子、1.1 kb、2.7 kb、3.0 kb卵清蛋白启动子。研究结果为瞬时表达模型的建立和输卵管生物反应器的研究奠定基础。

COUP-TFⅡ在胃癌组织中表达及对胃癌SGC7901细胞中VEGFR3-NRP2轴转录活性的调控

目的:探讨COUP-TFⅡ在胃癌中对淋巴转移相关因子VEGFR3-NRP2轴的调控分子机制。方法:收集2015年3月至2015年8月在滨州医学院附属医院手术切除的60例胃癌组织和相应的癌旁组织及正常胃黏膜活检组织,用免疫组化和qPCR法检测COUP-TFⅡ、VEGFR3和NRP2的表达;培养胃癌细胞SGC7901和BGC823,构建过表达和siRNA-COUP-TFⅡ质粒后转染SGC7901细胞,用WB和qPCR检测转染后SGC7901细胞中COUP-TFⅡ、VEGFR3、NRP2的表达,用免疫共沉淀(CHIP)和双荧光素酶报告基因实验验证COUP-TFⅡ与VEGFR3-NRP2轴的靶向关系。结果:免疫组化检测显示,VEGFR3、NRP2、COUP-TFⅡ在胃癌组织中呈高表达(P<0.01);q PCR结果显示,与癌旁组织和正常组织相比,胃癌组织VEGFR3、NRP2和COUPTFⅡ的mRNA呈高表达(P<0.05或P<0.01);WB和qPCR法结果显示,与对照组相比,过表达COUP-TFⅡ组SGC7901细胞中COUP-TFⅡmRNA和蛋白水平表达均显著升高(均P<0.01);敲减组SGC7901细胞中COUP-TFⅡmRNA和蛋白水平均显著下降(P<0.05或P<0.01),且VEGFR3和NRP2 mRNA水平也均显著下降(均P<0.01);CHIP结果显示,SGC7901和BGC823细胞中COUP-TFⅡ抗体的免疫共沉淀物中含有VEGFR3和NRP2启动子DNA序列;双荧光素酶报告基因实验结果显示,COUP TFⅡ表达水平与VEGFR3和NRP2表达水平呈正相关。结论:COUP-TFⅡ在胃癌组织中高表达且对VEGFR3-NRP2轴存在正性调控作用,且在胃癌中高表达,COUP-TFⅡ可能为胃癌治疗的新靶点。

加味三棱丸抗子宫内膜异位症内膜细胞雌二醇生成机制的研究

目的:探讨加味三棱丸(SLW)抗子宫内膜异位症内膜雌激素生成的作用机制。方法:以SLW含药血清作用于体外培养的内异症在位内膜细胞,RT-PCR检测子宫肌瘤组、给予SLW含药血清前后内异症组类固醇类产生因子-1(steroidgenic factor-1,SF-1)、小鸡卵清蛋白上游启动转录因子(chicken ovalbumin upstream-transcription factor,COUP-TF),17-β-羟甾类脱氢酶1(17-beta-hydroxysteroid dehydrogenase 1,17-β-HSD 1)和17-β-羟甾类脱氢酶2(17-beta-hydroxysteroid dehydrogenase 2,17-β-HSD 2)mRNA的表达。Western blot检测上述各组SF-1和COUP-TF蛋白的表达。结果:子宫肌瘤对照组SF-1,17-β-HSD 1 mRNA及SF-1蛋白的表达明显低于内异症内膜组,而COUP-TF,17-β-HSD 2 mRNA及COUP-TF蛋白的表达明显高于内异症在位内膜组,差异有极显著性(P<0.01)。以内异症在位内膜为对照,给予对照组SLW 5.0,2.5 g.kg-1.d-1大鼠含药血清(体积分数为0.1)作用48 h后,COUP-TF mRNA和蛋白、17-β-HSD 2 mRNA的表达明显高于对照组,而SF-1 mRNA和蛋白、17-β-HSD 1 mRNA的表达明显低于对照组,差异有显著性或极显著性(P<0.05或P<0.01)。SLW 1.25 g.kg-1.d-1组COUP-TF mRNA和蛋白的表达水平明显高于对照组,SF-1蛋白和17-β-HSD 1 mRNA表达明显低于对照组(P<0.01),而SF-1,17-β-HSD 2 mRNA的表达却无明显改变。结论:加味三棱丸可降低子宫内膜异位症在位内膜细胞分泌雌二醇的水平,与其抑制SF-1和17-β-HSD 1,增强COUP-TF和17-β-HSD 2的表达密切相关。

静脉表型分子COUP-TFⅡ表达降低对血管内皮细胞衰老的影响

目的:观察静脉表型分子鸡卵清蛋白上游启动子转录因子Ⅱ(COUP-TFⅡ)表达对血管内皮细胞衰老的影响和分子机制。方法:通过RT-qPCR检测比较人冠状动脉内皮细胞(HCAEC)和人脐静脉内皮细胞(HUVEC)中COUP-TFⅡ的表达情况。使用10^(-5)mol/L血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)诱导HUVEC衰老,通过COUP-TFⅡ特异性小干扰RNA(siCOUP-TFⅡ)转染HUVEC使其COUP-TFⅡ的表达降低,利用β-半乳糖苷酶染色、Western blot、CCK-8、细胞计数等方法分别观察siCOUP-TFⅡ对AngⅡ诱导的血管内皮细胞衰老及增殖的影响,通过Western blot检测Akt信号分子的表达变化。结果:与HCAEC相比,HUVEC中COUP-TFⅡ呈显著高表达;用siCOUP-TFⅡ抑制HUVEC的COUP-TFⅡ表达时,能显著促进AngⅡ诱导的内皮细胞衰老并抑制内皮细胞增殖和p-Akt蛋白水平;加入Akt激动剂SC79(4 mg/L)能够部分逆转siCOUP-TFⅡ对AngⅡ诱导的HUVEC衰老和增殖的影响。结论:COUP-TFⅡ表达降低可促进血管内皮细胞衰老并抑制内皮细胞增殖,其机制可能与调节Akt信号有关。

黄芪甲苷抑制COUP-TFII表达对成骨细胞分化的影响及相关分子机制研究

目的:探究黄芪甲苷对小鼠成骨前体细胞系MC3T3-E1细胞分化的影响及相关分子机制。方法:取小鼠胚胎成骨细胞MC3T3-E1经复苏后进行培养,再以成骨细胞分化培养基诱导分化后,应用倒置显微镜、茜素红染色等方法鉴定成骨细胞分化;取对数生长期的MC3T3-E1细胞,构建shRNA COUP-TFII的质粒载体,以慢病毒载体成功转染至MC3T3-E1的细胞,作为阳性对照组;取正常对数生长期细胞根据培养基中所加黄芪甲苷的浓度分为:空白对照组(0μg/ml)、黄芪甲苷低剂量组(25μg/ml)、中剂量组(50μg/ml)、高剂量组(100μg/ml);采用ALP活性检测和钙结节染色法评估黄芪甲苷对成骨细胞分化能力的影响;以荧光实时定量PCR(qRT-PCR)及蛋白免疫印迹(Western blot)法测定黄芪甲苷对MC3T3-E1细胞中COUP-TFII基因及蛋白表达的影响。结果:MC3T3-E1细胞培养18天后,细胞重叠生长,经茜红素染色可见大小形态不一的钙结节沉积;阳性对照组及黄芪甲苷处理组MC3T3-E1细胞中ALP活性及钙化结节程度均显著高于空白对照组,黄芪甲苷处理组间对比差异有统计学意义(P<0.05),阳性对照组与黄芪甲苷高剂量组无显著性差异(P>0.05);阳性对照组及黄芪甲苷处理组COUP-TFII基因及蛋白表达水平均显著低于空白对照组(P<0.05),黄芪甲苷处理组间对比差异有统计学意义(P<0.05),阳性对照组与黄芪甲苷高剂量组无显著性差异(P>0.05)。结论:黄芪甲苷能够通过抑制COUP-TFII表达,促进成骨细胞的分化。

多药耐药肝癌细胞模型的建立

目的:构建人多药耐药基因(MDR1)的肝脏特异性真核表达载体,转染HepG2细胞,建立多药耐药肝癌模型。方法:将小鼠清蛋白启动子序列(pALB)克隆到已成功构建的MDR1基因真核表达载体pcDNA-MDR1中,替换其中的CMV启动子序列,构建MDR1肝脏特异性真核表达载体pcDNA-ALBMDR1,利用KeyGenTransⅢ阳离子转染试剂转染HepG2细胞,用G418筛选稳定表达MDR1基因的细胞,并用RT-PCR方法检测MDR1基因的表达,通过测定细胞对阿霉素的耐受性以及阿霉素与多药耐药逆转剂维拉帕米联合用药情况确定MDR1基因在肝脏细胞中的功能。结果:酶切鉴定和测序结果证明构建的重组表达载体pcDNA-ALBMDR1序列正确。RT-PCR分析以及荧光显微镜观察结果表明:该表达载体已在HepG2细胞中有效转录并稳定表达。MTT药敏实验结果显示:转染pcDNA-ALBMDR1质粒的HepG2细胞对阿霉素的耐药性有显著提高,同时维拉帕米能够显著提高转染细胞对阿霉素的敏感性。结论:成功构建了稳定表达MDR1并具有多药耐药特性的肝癌细胞模型,该模型的建立将有助于多药耐药逆转剂的筛选与研究。

碱性磷酸酯酶基因在鸡胚和人乳腺癌细胞中的表达

通过PCR方法从pSEAP2-control质粒获得人胎盘碱性磷酸酯酶(PLAP)基因,并克隆到鸡输卵管特异性表达载体(pAB-Sig-SV40)卵清蛋白基因调控区下游。pSEAP2-control和pAB-Sig-AP-SV40质粒转染鸡胚细胞和乳腺癌细胞(MCF-7),转染48h后以对硝基苯磷酸钠(pNPP)为底物检测PLAP的活性,结果pSEAP2-control在鸡胚细胞和MCF-7细胞中表达PLAP,pAB-Sig-AP-SV40在鸡胚细胞中不表达,而在MCF-7细胞中表达。说明鸡胚细胞可以表达有活性的人源糖蛋白,另外也说明在雌激素受体细胞中,鸡卵清蛋白基因启动子可启动外源基因表达。

家鸡卵清蛋白基因调控序列克隆与分析

本文扩增了包含卵清蛋白5’侧翼上游约3.4kb片段及其第一外显子、第一内含子与第二外显子的一部分,并分别删除5’端的一个DNA酶超敏感位点(DHSs)和第一内含子,得到四个不同长度的调控序列.经测序后,将四个片段分别连接在带有绿色荧光蛋白基因的pcDH-EGFP载体上,并同时为了消除载体上的CMV启动子的影响而将之切除,从而得到OV1.1k-EGFP,OV3.4k-EGFP,OV1.1k-intron-EGFP和OV3.4k-intron-EGFP四种慢病毒载体.经酶切鉴定这四种表达载体构建正确,并且尝试用OV1.1k-EGFP慢病毒载体转染培养家鸡原代输卵管细胞后,标记基因(EGFP)成功表达.这些结果为后续深入探究家鸡卵清蛋白基因调控序列功能奠定基础.

鸡OV启动子表达HA对禽流感病毒攻击提供完全保护

鸡卵清蛋白（ovalbumin,OV）基因5＇调控序列是构建鸡输卵管生物反应器的首选调控元件。以EGFP为报告基因,构建OV启动子真核表达载体,转染原代输卵管上皮细胞和CHO细胞,筛选得到1.1kb的高效OV启动子。构建1.1kb OV启动子表达H5N1亚型禽流感病毒HA蛋白真核表达载体pOV_（1.1k）-HA,转染CHO细胞。PCR、RT-PCR鉴定结果证明HA基因整合至CHO细胞基因组,并进行转录;SDS-PAGE、Western blot及HA试验结果证明HA蛋白在CHO细胞内的表达,并具有免疫反应性和血凝活性。以纯化的HA蛋白免疫4周龄SPF鸡,2周后加强免疫一次,加强免疫3周HI抗体水平为6.3log2;以10~6EID_（50）H5N1（A/Goose/Guangdong/1/96）亚型禽流感病毒鼻腔接种SPF鸡,免疫组100%存活,无排毒现象,对照组100%死亡。结果表明,筛选的1.1kb OV启动子可有效驱动HA蛋白表达,表达的HA蛋白免疫SPF鸡对禽流感病毒攻击提供完全保护;为鸡输卵管生物反应器表达保护性抗原和珍贵药物蛋白奠定了基础。

缺氧诱导因子诱导转录因子COUP-TFⅡ转录激活

目的探讨缺氧对孤核受体鸡卵清蛋白上游启动子转录因子(COUP-TF)Ⅱ的影响及分子机制。方法利用ConTra v2(http://bioit2.irc.ugent.be/contra/v3/)分析COUP-TFⅡ启动子和调控区;创建野生型(WT)COUP-TFⅡ-Luc报告载体,使用荧光素酶实验检测缺氧对COUP-TFⅡ启动子的影响;qRT-聚合酶链反应(PCR)和Western印迹检测缺氧诱导因子(HIF)-1α或HIF-2α对COUP-TFⅡ的影响;使用染色质免疫沉淀分析(ChIP)检测HIF-1α或HIF-2α与COUP-TFⅡHRE的相互作用;构建小鼠后肢缺血模型,使用免疫组化检测缺氧对COUP-TFⅡ影响。结果COUP-TFⅡ与HIF-1α/HIF-2α存在一致的缺氧反应元件(HRE);荧光素酶实验显示HRE是缺氧诱导COUP-TFⅡ表达的关键;缺氧可以诱导COUP-TFⅡ表达增加;HIF-1α和HIF-2α可诱导COUP-TFⅡ启动子的激活并与HRE发生相互作用;在体内实验中缺氧可诱导COUP-TFⅡ表达增加。结论HIF-1α、HIF-2α可诱导COUP-TFⅡ启动子的转录激活,促进新生血管分化。

转基因鸡生物反应器载体的构建及其表达特性分析

以增强型绿色荧光蛋白和萤火虫荧光素酶为报告基因,构建了鸡卵清蛋白启动子表达载体和慢病毒载体,以巨细胞病毒(Cytomegalovirus,CMV)启动子表达载体为对照,转染或感染鸡原代输卵管上皮细胞、鸡胚成纤维细胞、鼠3T3-L1前脂肪细胞和牛乳腺上皮细胞,通过荧光和酶活性检测,旨在筛选出用于实现转基因鸡生物反应器的高效特异性表达载体。结果发现,鸡卵清蛋白启动子表达载体转染以上4种细胞后2种标记基因均有表达,没有表现出明显的细胞特异性,且荧光素酶检测结果表明其在各细胞组中表达活性都低于CMV启动子表达载体100倍以上;慢病毒载体感染以上4种细胞后2种标记基因均有表达,在鸡输卵管上皮细胞组感染单个细胞的病毒颗粒(Multiplicity of infection,MOI)为20时绿色荧光蛋白表达量就可以达到CMV启动子表达载体的水平。上述结果表明,基于卵清蛋白基因调控序列构建的表达载体无法实现外源基因的高效、特异性表达,而慢病毒载体在表达活性和广泛性上可以用于进行鸡输卵管生物反应器的研究。