鸡卵清蛋白基因5′调控序列表达载体的构建及其在鸡原代输卵管上皮细胞及鸡成纤维细胞的表达

将氯霉素乙酰转移酶 ( CAT)基因与鸡卵清蛋白基因上游调控序列融合 ,构建了 p CAT-3-OVP(鸡卵清蛋白基因 5′调控序列 )表达载体。将构建的载体与脂质体混合后制备转染液 ,转染鸡原代输卵管上皮细胞和鸡成纤维细胞进行瞬时表达。结果表明 ,在鸡原代输卵管上皮细胞 ,转染后 4 8h表达量最高 ,为 0 .67μg/L;而在鸡成纤维细胞 ,不论有无类固醇激素存在 ,均不表达。结果提示 ,在输卵管细胞中存在细胞特异性转录因子。

鸡卵清蛋白基因第一内含子和3′-调控区对外源基因表达的调控作用

探明鸡卵清蛋白基因(ov)第一内含子和3′-调控区对目的基因表达水平的影响,为鸡输卵管表达载体的构建提供科学依据。用牛生长激素基因(BGH)poly A序列替换鸡输卵管表达载体中ov 3′-调控区,用限制酶消化法逐步删减第一内含子序列,获得5个表达人组织激肽释放(hK1)cDNA的鸡输卵管表达载体,分别命名为pOV2K、pOV3K、pOV4K、pOV5K和pOV6K。经翅静脉给产蛋鸡注射聚乙烯亚胺包裹的相同拷贝数重组载体,通过蛋清中酶活性定量检测评价不同载体的表达水平。结果表明:受控于3.0kb ov 5′-和3′-调控区的pOV2K表达的重组酶活性明显高于用BGH poly A替换3′-调控区的pOV3K;无内含子的pOV6K表达水平显著低于含不同长度第一内含子的pOV3K、pOV4K和pOV5K,重组酶表达水平随第一内含子的缩短呈逐渐下降趋势。该试验结果表明ov第一内含子和3′-调控区对目的基因在鸡输卵管细胞中的表达具有正调节作用,应当包括在鸡输卵管表达载体中。

水牛α-乳清蛋白基因的克隆及序列分析

根据报道的奶牛α-乳清蛋白基因核苷酸序列设计和合成4对引物,采用PCR扩增的方法克隆并测定了水牛α-乳清蛋白全基因的核苷酸序列。结果表明,克隆的水牛α-乳清蛋白基因全长3 038 bp,包括5′侧翼区,3′侧翼区,3个内含子和4个外显子(该序列已被成功提交到GenBank,序列接收号为EU422984)。核苷酸序列比对结果表明,水牛α-乳清蛋白基因与报道的奶牛该基因的核苷酸序列同源性为97.53%。水牛α-乳清蛋白成熟肽的氨基酸序列与奶牛相比有两个氨基酸的差异。与奶牛相比,水牛α-乳清蛋白基因5′调控区发生了多处插入突变和碱基替换突变,这些插入和替换突变可能与水牛乳汁中α-乳清蛋白的高水平表达有关。

肠内营养对阻塞性黄疸大鼠肝损伤及清蛋白基因转录的影响

目的 :观察不同配方肠内营养对阻塞性黄胆 (OJ)大鼠肝损伤及清蛋白基因转录的影响。 方法 :将 4 0只雄性SD大鼠随机分为两大组 :即假手术 (SHAM)组和胆总管结扎 (CBDL)组。后者进一步分为CBDL经口饮食对照组 (对照组 )、CBDL +能全素组和CBDL +能全力组 ,每组 1 0只。接受持续 5天的等氮、等热量的营养支持。总热量为 6 30kJ / (kg·d) ,氮量为 1 .2g / (kg·d)。 结果 :CBDL大鼠出现明显的肝功能损伤 ,能全素和能全力组大鼠肝功能损伤程度与对照组相似。能全素和能全力组大鼠体重下降程度均明显改善 ,血清总蛋白和清蛋白水平无显著性变化。SHAM组大鼠肝清蛋白信使核糖核酸 (ALBmRNA)和D位点结合蛋白信使核糖核酸 (DBPmRNA)表达明显高于CBDL各组。CBDL各组中 ,能全素和能全力组大鼠肝ALBmRNA略高于对照组 ,但无显著性差异。能全素和能全力组大鼠在体重、肝功能损伤、血清蛋白水平和清蛋白基因转录方面均无显著性差异。 结论 :短期肠内营养没有加重OJ大鼠肝功能损伤。能全素和能全力较经口饮食能更好地维持大鼠体重 。

水牛α-乳清蛋白基因部分序列的测定与分析

根据奶牛α-乳清蛋白基因序列设计引物,用PCR方法扩增并克隆了包含水牛(Bubalusbubalis)α-乳清蛋白基因的5′侧翼序列(709bp)和第1外显子(160)、第1内含子(337bp)和部分第2外显子(73bp)的序列。将该序列与牛的相应序列进行比较表明,尽管具有非常高的同源性(97.6%),但仍然存在一些碱基差异,这些碱基差异导致了一些转录调控因子识别序列的产生或消失以及转录调控因子识别位点之间的距离的变化,这可能是导致这两个物种中该基因表达存在明显表达差异的原因之一。

鸡卵清蛋白基因启动子调控GFP基因在鸡原代输卵管上皮细胞和中国仓鼠卵巢细胞的表达

特异性扩增家鸡卵清蛋白基因上游调控序列 1340bp～ +16 5 5bp片段和第一内含子 +49bp～ +16 5 5bp片段 ,去除pG FP N2载体自身的CMV启动子 ,分别构建了P2 9koval GFP和P1 5koval GFP两种表达载体 ,经测序和酶切鉴定表达载体构建正确。采用脂质体转染法分别将这两种载体、pGFP N2 (阳性对照 )质粒及阴性对照转染鸡原代输卵管上皮细胞和中国仓鼠卵巢细胞。用荧光倒置显微镜观测绿色荧光蛋白的表达。结果表明 :两种表达质粒在鸡原代输卵管上皮细胞和中国仓鼠卵巢细胞中都可以表达荧光蛋白。结果既显示卵清蛋白第一内含子对基因的表达起到一定的调控作用 ,也显示卵清蛋白启动子对输卵管上皮细胞和卵巢细胞不存在特异性 ,并且不存在种属差异性。

鸡卵清蛋白基因5′端调控区的克隆及其序列分析

应用PCR技术从鸡输卵管组织基因组中扩增出了 1.0 0kb的鸡卵清蛋白基因 5′端调控区序列。序列分析表明 ,该区域含有TATA框及激素识别位点 ,具备输卵管定位表达的调控能力。为外源基因在鸡输卵管中的定位表达奠定了基础。

鸡卵清蛋白基因转录起始点的确定及表达载体的构建

采用 5′RACE方法确定鸡卵清蛋白基因转录起始点的位置 ,通过序列分析得出转录起始点为G ,从而确定出核心启动子及上游调控区的位置。应用PCR技术分别扩增两段卵清蛋白基因上游调控序列的两个片段 ,长度分别为 1 5kb和 2 9kb。经PCR测序和克隆测序后 ,针对突变的碱基进行修复 ,并将修复的两片段分别连接在带有绿色荧光蛋白报告基因pGFP N2载体上 ,为使pGFP N2载体本身的CMV启动子不影响对鸡卵清蛋白启动子的研究 ,将其切去 ,构建了P1.5koval GFP和P2 .9koval GFP两种表达载体 ,经酶切鉴定这两种表达载体构建正确。

鸡卵清蛋白基因调控序列的克隆与载体构建

卵清蛋白(ovalbumin)基因在鸡基因组中只有一对等位基因,却能每天合成分泌多达2 g的蛋白,占据卵白蛋白质的50%以上,是外源基因载体表达调控构件的首选。该研究从输卵管特异性启动子方面着手,通过对卵清蛋白基因启动子的筛选优化,找出启动子增强因子的位置以及组织特异性区域。将卵清蛋白基因上游-922^-2 073和-2 801^-3 100区域平均分成12个长度约为150 bp的序列,分别插入到-921^+38序列的上游,成功构建12个系列表达载体,为进一步筛选短缩版优化启动子提供材料;卵清蛋白基因第一内含子区域截断成300 bp左右的迷你内含子序列,成功构建8个迷你内含子系列载体,为筛选优化的迷你内含子提供必要的材料;成功分离鸡输卵管上皮细胞并优化电转染条件,通过荧光素酶活性检测初步筛选出具有最强活性重组质粒pGL4-UP-1412和内含子重组质粒pGL4-mini-intron-3,同时推断出若干包含增强子序列区域。

内毒素对大鼠肝细胞清蛋白基因表达的影响

目的 :观察内毒素刺激后体外培养大鼠肝细胞清蛋白基因的表达 ,进一步了解感染时低清蛋白血症的分子机制。 方法 :将 1 μg/ml内毒素作用于大鼠肝细胞后 0、2、8、1 2、2 4h ,分别用逆转录聚合酶链反应 (RT PCR)、流式细胞仪和酶链免疫检测法 (EIA) ,检测肝细胞清蛋白mRNA、细胞质内清蛋白前体和分泌到细胞外的清蛋白变化。 结果 :肝细胞清蛋白mRNA、细胞质内清蛋白前体和分泌到细胞外的清蛋白的变化是一致的 ,即内毒素作用后 2和 8h下降不明显 ,1 2h开始下降 ,2 4h后明显下降。清蛋白mRNA降低约 30 % ,清蛋白前体和清蛋白均下降5 0 %。 结论 :内毒素可以在体外抑制大鼠肝细胞清蛋白基因的表达 。

基于Cre重组酶体系的鸡卵清蛋白基因打靶载体的构建

利用胚胎干细胞基因打靶技术制备转基因鸡是研制鸡输卵管反应器的最佳技术路线。为建立基于Cre/loxp系统的鸡卵清蛋白基因(Ovalbumingene,OV)位点的双交换打靶载体系统,本研究克隆了鸡的OV基因7.8kb片段,并与克隆的内部核糖体进入位点(IRES)、人工合成的含有Cre重组酶识别位点变异体交换盒m2/loxp71EGFPloxp66,一起构建了含有Hsvtk负筛选标记的针对鸡卵清蛋白基因位点的敲入型共表达基因打靶载体pSSCm2/71EGFP66IRESOV7.8;以猪β干扰素基因(βInterferon,IFNβ)为目的基因构建了穿梭载体pMDm2/66MCSIFNMCSLoxp71,经过限制酶酶切及部分测序鉴定,所构建载体结构正确。进一步将它们共转化组成性表达Cre的细菌BM25.8。

鹅卵清蛋白基因5’端调控区的克隆和序列分析

通过PCR技术从产蛋鹅输卵管基因组中扩增出 1 2kb的鹅清蛋白基因 5’端调控区 ,将其亚克隆入phD18-T载体的多克隆位点 (标记为pOV) ,经酶切和测序鉴定 :扩增产物只有 3个碱基发生了突变 ,其TATA框、组织特异性因子和卵清蛋白上游启动子均未发生变异 ,表明鹅清蛋白基因 5’端调控区可作为启动外源基因表达的调控序列 。

猪α乳清蛋白基因双元载体的构建和转化拟兰芥植物

将人工合成的植物化的猪α乳清蛋白基因编码区克隆到载体中,构建了带有35S启动子———猪α乳清蛋白基因———终止子表达单元的双元载体,采用农杆菌法对拟兰芥进行植物转化。利用该双元载体上的除草剂抗性基因(Bar基因)为选择性标记进行筛选,获得了一些抗除草剂的转化植株。对转化植株后代植进行猪α乳清蛋白基因的PCR检测,证实外源猪α乳清蛋白基因已整合到植物基因组DNA中。

水牛α-清蛋白基因3′端调控区的PCR克隆及序列分析

对水牛α-乳清蛋白基因的3′端调控区进行了PCR扩增及重组质粒的酶切鉴定,比较了水牛和牦牛该基因的核苷酸序列同源性。序列分析结果表明:水牛α-乳清蛋白基因3′端序列与牦牛该基因在641 bp的序列中存在34 bp的差异,同源性为94.69%。

鸡卵清蛋白基因启动子克隆及其活性的检测

为了获得鸡输卵管特异表达的卵清蛋白基因启动子,研究在采用PCR方法从鸡心基因组DNA中扩增卵清蛋白基因启动子(5OV)的基础上,将其与p Ac GFP1-N1载体连接构建真核表达载体p Ac GFP1-5OV,并采用脂质体法将p Ac GFP1-5OV分别转染鸡输卵管上皮细胞和鸡成纤维细胞后,观察其在两种细胞中的表达活性。结果表明:利用克隆获得的5OV构建的真核表达载体p Ac GFP1-5OV在转染鸡输卵管上皮细胞后第24小时,在荧光倒置显微镜下可见绿色荧光,而转染鸡成纤维细胞后未观察到GFP表达。说明所克隆的5OV具有在输卵管上皮细胞特异表达的活性。

鸡卵清蛋白基因5’ 端调控区序列表达载体的构建

本研究从鸡输卵管组织中扩增并克隆了约1400bp的鸡卵清蛋白基因5’端调控序列。经测序结果和序列分析表明其具有调控外源基因在输卵管内表达的能力,并构建了鸡卵清蛋白基因5’端调控序列调控外源基因表达载体PVAX1-OVP。

转人α-乳清蛋白基因奶牛性控冻精人工授精效果试验

研究了输精部位、不同精液来源及育成和成母牛等因素对转入α-乳清蛋白基因性控冻精人工授精妊娠率的影响．并对转入α-乳清蛋白基因性控冻精和常规冻精的人工授精效果进行了比较，以便为制定转人仅一乳清蛋白基因性控冻精的合理授精方案提供科学依据。促进转入α-乳清蛋白基因奶牛新品种产业化。

芝麻主要过敏原清蛋白基因的克隆表达、纯化及免疫学鉴定

芝麻是亚洲地区重要的油料作物，主要含有两种储存蛋白，为11S的球蛋白和2S的清蛋白，这两种蛋白占芝麻中总蛋白的80％～90％，清蛋白是其中主要的致敏蛋白之一。从SWISS—PROT和TrEMBL以及NCBI的GenBank等数据库下载到一些芝麻中清蛋白的核酸序列，利用生物信息学方法对这些芝麻清蛋白序列进行同源性比对，确定其保守区域。

人α-乳清蛋白转基因克隆牛外源基因拷贝数的分析

为了探讨转基因克隆动物外源基因拷贝数及拷贝数在传代过程中的变化,本研究应用实时荧光定量PCR检测人α-乳清蛋白(human alpha-lactalbumin,HLA)转基因克隆牛及其子代共5头牛中外源基因的拷贝数,其中K060923为亲代,172、081、189、隆娃为子代。HLA基因在亲代转基因克隆牛K060923中的拷贝数为1.145,在子代转基因克隆牛172、081、189和隆娃中分别为0.998、1.107、0.891和0.842。结果表明,5头牛中外源基因拷贝数都在1左右,说明人α-乳清蛋白基本以单拷贝形式整合到宿主基因组中,且稳定遗传。

豌豆清蛋白1(PA1)基因的克隆及对苜蓿的转化

本研究用PCR方法从豌豆(食荚大菜豌)克隆出富含硫氨基酸、同时具有抗虫作用的双功能的蛋白质基因-豌豆清蛋白1(PA1)基因,并构建了植物表达载体pCAMBIAl301-PA1。采用农杆菌介导法转化了紫花苜蓿,并对其转化体系进行了优化,得到了多个转基因胚性愈伤组织及其再生植株。PCR和Southern杂交检测表明,PA1基因和潮霉素抗性基因已被整合到了宿主细胞。SDS-PAGE分析表明该基因在再生植株中有一定表达。游离氨基酸分析表明,PA1基因的表达转基因苜蓿中蛋氨酸和半胱氨酸的含量从0.1%提高到0.4%。