清解扶正颗粒促进凋亡和自噬逆转结直肠癌细胞多药耐药研究

目的:探讨清解扶正颗粒(QFG)对人结直肠癌HCT-8/5-FU耐药细胞的逆转作用机制。方法:培养人结直肠癌HCT-8细胞及HCT-8/5-FU耐药细胞,计算不同化疗药物的耐药指数(RI)和QFG的逆转倍数(RF);设立空白对照组(0 mg/mL)和不同浓度(0.25、0.5、1.0 mg/mL)QFG干预组;各组干预48 h后,通过罗丹明-123(Rho123)染色和多柔比星(DOX)染色检测细胞外排泵功能,通过克隆形成试验检测细胞存活能力,应用磷脂酰丝氨酸(Annexin V-FITC)/碘化丙啶(PI)双染检测细胞凋亡,应用Cyto-ID染色检测细胞自噬,应用蛋白质印迹法检测P-糖蛋白(gP)、B细胞淋巴瘤-2(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、选择性自噬接头蛋白(p62/SQSTM1)、微管相关蛋白1轻链(LC)3Ⅱ的蛋白表达。结果:HCT-8/5-FU细胞对5-氟尿嘧啶(5-FU)、多柔比星(DOX)和顺铂(DDP)均耐药,QFG可有效逆转化疗耐药,与空白对照组比较,不同浓度QFG显著增加Rho123、DOX和Cyto-ID的平均荧光强度(均P<0.05);抑制细胞的克隆形成率(P<0.05),提高细胞凋亡率(P<0.05);和空白对照组比较,QFG抑制P-gP、p62的蛋白表达(P<0.05),降低Bcl-2/Bax比值(P<0.05),促进LC3-Ⅱ的蛋白表达(P<0.05)。结论:QFG促进细胞凋亡和自噬,抑制耐药细胞对化疗药物的外排泵功能,从而逆转多药耐药。

清解扶正颗粒的制备工艺研究

目的优化清解扶正颗粒提取、成型工艺。方法采用正交实验法,以野黄芩苷含量及干浸膏得率综合评分为评价指标,考察提取时间、提取次数、料液比3个因素对提取工艺的影响,筛选清解扶正颗粒的最佳提取工艺;以清解扶正方提取物稠膏相对密度、辅料种类及用量比例为考察因素,以成型率、堆密度、休止角、含水量、溶化性、吸湿率为考察指标,优选清解扶正颗粒剂的成型工艺。结果处方的最佳提取工艺为提取时间1.5 h、提取次数2次、料液比1∶12;将相对密度为1.28 g/mL清解扶正方提取物稠膏与可溶性淀粉按1∶1.42混合制粒,成型率为98.6%,堆密度为0.43 g/mL,休止角为19.8°,含水量为7.43%,颗粒完全溶于热水,吸湿率为0.99%。结论最佳工艺条件下所制得的清解扶正颗粒,粒度适中,外观均匀,溶化性好,综合评价指标高,稳定可靠;建立的高效液相测定野黄芩苷含量的方法快速、准确、重复性好,可用于今后清解扶正颗粒含量的测定。

清解扶正颗粒对大肠癌细胞增殖和凋亡的影响

目的:探讨清解扶正颗粒(Qingjiefuzheng Granules,QFG)对大肠癌细胞增殖和凋亡的影响。方法:体外培养人大肠癌细胞HCT-116和HCT-8,用不同浓度的QFG干预,采用MTT法检测细胞活力,计算QFG对癌细胞增殖的抑制率;倒置显微镜观察细胞形态,流式细胞术检测细胞周期(PI染色分析)和细胞凋亡(Annexin V/PI染色分析)。结果:MTT实验结果显示QFG对大肠癌细胞增殖的抑制率随时间及浓度的增加而增大;细胞周期分析结果显示QFG使大肠癌细胞增殖周期停滞在G0/G1;Annexin V/PI染色实验显示QFG能促进大肠癌细胞凋亡。结论:QFG具有抑制大肠癌细胞增殖和诱导大肠癌细胞凋亡的作用。

清解扶正颗粒对大肠癌SW620细胞增殖、凋亡和迁移的影响

目的:探讨清解扶正颗粒(QFG)对大肠癌SW620细胞增殖、凋亡和迁移的影响及作用机制。方法:体外培养人大肠癌SW620细胞,用不同浓度的QFG(0、0.5、1、2 mg/mL)作用于细胞,采用MTT法检测24、48 h后QFG对细胞增殖的抑制能力;在倒置显微镜下观察24 h后细胞形态变化;采用流式细胞术检测24 h后细胞周期;通过Hoechst 33258染色实验检测24 h后细胞凋亡情况;采用划痕实验检测0、6、12、24 h后细胞的迁移能力;通过Western blot方法检测24 h后细胞Ki-67、MMP-2及Cleaved-Caspase-3蛋白的表达。结果:①0、0.5、1、2 mg/mL浓度范围内,QFG对大肠癌SW620细胞增殖抑制率随时间及浓度的增加而增大,明显高于同一时间点对照组的细胞,差异具有统计学意义(P<0.05)。②0.5、1、2 mg/mL QFG作用SW620细胞24 h后,细胞形态发生明显的改变,随着给药浓度的增高,细胞密度逐渐减少,悬浮细胞增多,部分细胞皱缩变圆。③流式细胞术检测细胞周期发现,0.5、1、2 mg/mL QFG组细胞G1期降低,S期增高,而G2期并没有明显的变化,各时期百分比与对照组比较差异有统计学意义(P<0.01),但并不呈剂量依赖关系。④Hoechst 33258染色结果显示,随着QFG作用浓度增加,SW620细胞凋亡的形态学表现越明显。⑤划痕实验发现,0.5、1、2 mg/mL QFG能降低SW620细胞的迁移能力,划痕愈合率随着作用时间和QFG浓度增加而逐渐降低,呈现明显的时间和剂量依赖作用;与对照组比较,12 h和24 h划痕愈合率差异有统计学意义(P<0.01)。⑥与对照组比较,0.5、1、2 mg/mL QFG能显著降低Ki-67和MMP-2的蛋白表达,增加Cleaved-Caspase-3的蛋白表达,且呈现明显的剂量依赖性,差异有统计学意义(P<0.01)。结论:QFG具有抑制大肠癌SW620细胞增殖、诱导凋亡及抑制迁移的作用,其作用机制可能与下调Ki-67和MMP-2蛋白表达及上调Cleaved-Caspase-3蛋白表达有关。

清解扶正颗粒体外抑制血管新生的作用机制研究

目的:探讨清解扶正颗粒(Qingjiefuzheng Granules,QFG)对体外人脐静脉内皮细胞(Human Umbilical Vein Endothelial Cells,HUVEC)新生的影响及可能的作用机制。方法:以HUVEC为研究对象,给予不同浓度QFG后观察细胞形态变化,MTT检测细胞活力,划痕实验检测细胞迁移能力,管腔形成实验检测细胞成血管能力,蛋白免疫印迹检测促血管新生因子、血管内皮生长因子A、血管内皮生长因子受体2、基质金属蛋白酶2及基质金属蛋白酶9的蛋白表达。结果:QFG对HUVEC形态与细胞生长没有明显影响,但可显著抑制HUVEC的活力、迁移及体外成血管能力;QFG显著抑制血管内皮生长因子A、基质金属蛋白酶2、基质金属蛋白酶9等蛋白表达。结论:QFG在体外具有抑制血管新生的作用,其作用机制与其抑制血管内皮生长因子A、基质金属蛋白酶2及基质金属蛋白酶的表达有关。

清解扶正颗粒通过PI3K/AKT通路抑制宫颈癌Caski细胞移植瘤的生长

目的探讨清解扶正颗粒(QFG)对宫颈癌Caski细胞株裸鼠皮下移植瘤生长的抑制作用及其机制。方法在12只雄性BALB/c裸鼠右前肢腋窝处接种Caski细胞,构建宫颈癌皮下移植瘤模型,待裸鼠右侧腋窝下出现绿豆大小移植瘤,即为模型建立成功。瘤体长至70~100 mm3后,将12只BALB/c裸鼠随机分为对照组和QFG组,每组6只。QFG组按5 mL/(kg·d)灌胃200 mg/mL QFG溶液,对照组灌胃同体积生理盐水,2组均1周连续给药6 d,每天1次,共给药6周。从给药开始,隔天监测2组裸鼠肿瘤体积和体质量;末次给药24 h后处死裸鼠,剥离瘤组织,称取瘤重并计算抑瘤率;TUNEL法检测瘤体组织的细胞凋亡,Western blot检测2组Bax、Bcl-2、PI3K、AKT和p-AKT蛋白表达情况并计算Bax/Bcl-2、p-AKT/AKT。结果与对照组比较,QFG组裸鼠在第27~41天瘤体体积明显降低(P均<0.05),而裸鼠体质量无明显差别(P均>0.05);与对照组比较,QFG组瘤重明显降低,抑瘤率明显增高(P均<0.05);与对照组比较,QFG组细胞凋亡率明显增高(P<0.05);与对照组比较,QFG组Bax蛋白表达水平增加,Bcl-2蛋白表达水平降低,Bax/Bcl-2明显增高(P均<0.05);与对照组比较,QFG组PI3K、p-AKT蛋白表达水平明显降低(P均<0.05),AKT蛋白表达水平无明显差别(P>0.05),但p-AKT/AKT降低(P<0.05)。结论QFG对人宫颈癌Caski细胞移植瘤生长具有明显抑制作用,其作用机制可能通过抑制PI3K/AKT通路与诱导细胞凋亡有关。

清解扶正颗粒抑制VEGF-A诱导肿瘤血管新生的作用机制

目的探讨清解扶正颗粒(Qingjie Fuzheng Granules, QFG)对血管生成因子A(vascular endothelial growth factor, VEGF-A)诱导的肿瘤血管生成的抑制作用及其作用机制。方法体外培养肠癌细胞HCT-8、肝癌细胞Huh7和胃癌细胞MGC80-3,经不同剂量(0、0.25、0.5、1、1.5、2 mg/mL)QFG干预处理后,用MTT法检测细胞活力,Western blot实验检测VEGF-A蛋白表达;体外培养脐静脉血管内皮细胞(HUVECs),HUVECs分为对照组、诱导组(VEGF-A 10 ng/mL)、VEGF-A 10 ng/mL+QFG 0.5 mg/mL组、VEGF-A 10ng/mL+QFG 1 mg/m L组和VEGF-A 10 ng/mL+QFG 2 mg/mL组,通过MTT、DAPI染色、划痕实验、Transwell实验,管腔形成及Western blot实验分别检测细胞活力、凋亡、迁移、血管生成和VEGFR-2蛋白表达。结果 QFG可以抑制肠癌细胞HCT-8、肝癌细胞Huh7和胃癌细胞MGC80-3的细胞活力以及蛋白VEGF-A的表达,且具有统计学差异;QFG能够抑制VEGF-A诱导HUVECs的增殖,促进细胞凋亡,抑制其损伤修复、迁移及管腔生成能力,也可以下调蛋白VEGFR-2的表达水平,具有统计学差异。结论 QFG可靶向VEGF-A抑制肿瘤血管生成。

清解扶正颗粒对体外淋巴管生成的抑制作用

目的:探讨清解扶正颗粒对体外淋巴管内皮细胞新生淋巴管能力的影响。方法:将体外培养淋巴管内皮细胞分为对照组、实验组(清解扶正颗粒浓度:0.5、1.0、2.0 mg/ml),采用MTT、DAPI染色,划痕损伤修复实验,迁移实验和管腔形成实验分别检测清解扶正颗粒对细胞活力、细胞凋亡、细胞迁移及淋巴管生成能力的影响。结果:清解扶正颗粒可抑制淋巴管内皮细胞增殖,促进细胞凋亡,抑制划痕损伤修复、细胞迁移及淋巴管腔的生成。结论:清解扶正颗粒对体外淋巴管内皮细胞新生淋巴管能力有显著的抑制作用。