温州病毒核衣壳蛋白的生物信息学分析及其表达鉴定

温州病毒(WENV)是新发现、具有潜在致病性的沙粒病毒,监测其流行状况,有利于维护公共卫生安全。对病毒核衣壳蛋白(N)进行了生物信息学分析,并在体外诱导表达及鉴定。结果显示,N蛋白是一种亲水性稳定蛋白,高级结构以无规则卷曲为主,存在磷酸化、糖基化位点及抗原表位;诱导的N蛋白约64 kDa,主要以包涵体的形式存在,纯化后的浓度可达0.62 mg/mL,成功构建了重组原核表达质粒p ET-30a(+)-Np,为WENV检测方法的建立奠定基础。

江西地区啮齿动物中温州病毒的检测及病毒基因特征分析

目的了解温州病毒在江西地区啮齿动物中感染的情况及病毒基因特征。方法收集2021年江西省高安市、安义县两地啮齿动物鼠肺组织样本,提取样本核酸,采用温州病毒特异性引物进行巢式PCR扩增,PCR产物进行序列测定。采用Ion GeneStudio S5二代测序平台(NGS)对1株核酸阳性样本进行病毒基因组测序,采用CLC软件对基因序列进行分析。结果共收集高安市、安义县啮齿动物肺组织标本164份,通过巢式PCR检出温州病毒3份,均来自高安地区的黄毛鼠。3株病毒部分L基因序列同源性93.66%~98.50%,氨基酸序列同源性95.21%~100%。选取1株病毒(JXGAW45/2021)进行二代测序,获得全基因组序列,其中S、L基因分别含3429、7145个核苷酸。基因组比对分析发现JXGAW45/2021与其他温州病毒核苷酸序列同源性为82.58%~85.75%,氨基酸同源性为88.76%~96.83%,在S、L基因系统进化树中均独立分支,为温州病毒新的变异株。结论首次在江西地区啮齿动物中发现温州病毒。

福建省龙岩市啮齿动物携带戊型肝炎病毒和温州病毒调查及基因特征

目的调查福建省龙岩市啮齿动物戊型肝炎病毒(hepatitis E virus,HEV)和温州病毒(Wenzhou virus,WENV)感染情况及基因特征,为戊型肝炎病毒和温州病毒防控提供参考。方法在漳平市和武平县采集啮齿动物肠道组织样本,用巢式PCR扩增戊型肝炎病毒RdRp(RNA-dependent RNA polymerase)基因和温州病毒S(Small segment)基因。阳性PCR产物送交测序。采用生物信息学软件进行遗传特征分析。结果本调查共捕获141只啮齿动物。戊型肝炎病毒阳性率为7.8%,感染动物为黄胸鼠、黄毛鼠和针毛鼠,感染率分别为22.2%(2/9)、10.0%(8/80)和2.9%(1/35)。序列分析显示,龙岩市啮齿动物HEV与深圳啮齿动物及鼩鼱HEV关系较近,而与香港地区患者HEV分离株存在约14%的差异。所有啮齿动物均未检测出WENV。结论该研究是福建省首次在啮齿动物中发现HEV感染,对防控有重要意义;虽尚未在啮齿动物中发现WENV感染,但仍需进一步加强监测,以预防WENV感染流行。

浙江省啮齿动物中温州病毒的基因组学分析

目的为了解国内发现的新型沙粒病毒（温州病毒）在温州地区啮齿类动物中的流行情况。方法采用巢式RT-PCR方法分别对采集自温州（48份）及龙泉（156份）的啮齿动物样本筛查沙粒病毒。结果在温州地区采集的5份啮齿动物样本中再次检测到温州病毒，阳性率为10．41％；但在龙泉地区采集的156份样本中均未发现温州病毒。分析病毒的全基因组序列发现其中4株病毒与已知的温州病毒有很高的同源性；而编号为Wencheng-Rn-288病毒株的S和L节段与已知病毒同源性分别为87．5％和91．6％，在进化树上为一独立分支，为温州病毒的新亚型。结论温州病毒在温州地区啮齿动物中有较高的流行率，且呈多样性。鉴于在柬埔寨已发现温州病毒能引起人呼吸道疾病，因此我国应加强温州病毒的监测。

温州蜜柑萎缩病毒研究进展

温州蜜柑萎缩病毒(Satsuma dwarf virus,SDV)引起的温州蜜柑萎缩病是一种柑橘病毒病害,该病曾给日本的温州蜜柑产业造成了极大损失,20世纪80年代随引种传入我国。SDV可侵染几乎所有柑橘属及其近缘属植物,侵染温州蜜柑后可使其丧失经济价值。对SDV的分类地位,生物学特征,分子生物学特性进行了总结,重点阐述了运用生物学、血清学和分子生物学方法检测SDV的研究进展,并介绍了SDV的防治方法,最后对其急待解决的问题和研究的空白方面进行了分析,旨在为该病的防治提供信息。

温州蜜柑萎缩病毒大外壳蛋白基因克隆分析

利用RT-PCR技术从感染温州蜜柑萎缩病毒的叶片中扩增出SDV大外壳蛋白(Large coat protein,CPL),将CPL克隆到pGEM-T载体后进行测序分析。DNA序列分析表明,SDV FJ的CPL基因cDNA序列全长为1329bp,编码443个氨基酸。与同属其他病毒序列对比分析结果显示,所得序列与日本报道的SDV S-58株系核苷酸和氨基酸同源性最高,分别为98.1%和98.6%。核苷酸序列与S-58相比25处发生了替换突变,其中T和C之间的替换频率最高,占绝对优势。

温州蜜柑萎缩病毒小外壳蛋白基因克隆与原核表达及其抗体制备

用RT-PCR方法,从采自重庆奉节的‘宫本’柑橘的2个样品中扩增出温州蜜柑萎缩病毒(Satsuma dwarf virus,SDV)SDV RNA2的3′末端,长度为975bp,与报道的SDV S-58 3′末端序列同源性分别为98.7%和98.4%。根据获得的序列设计引物,以含有SDV FJ 3′末端序列的质粒为模板,PCR扩增获得大小为654bp的SDV-FJ小外壳蛋白(Small coat protein,CPS)基因产物。构建了CPS与GST融合表达载体PGEX-CPS,在37℃、1.0 mmol·L-1IPTG条件下诱导表达,SDS-PAGE电泳分析表明成功表达出分子量约为42kD的GST-CP融合蛋白。以表达的融合蛋白为抗原免疫家兔,制备的抗血清的效价为1/12 800。用获得的抗体进行组织印迹分析表明,SDV在柑橘叶柄基部韧皮部维管束区域含量最高。

两种沙粒病毒核衣壳蛋白的交叉反应研究

目的了解沙粒病毒的温州病毒(WENV)与淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)之间的抗原交叉反应情况。方法分别利用原核细胞表达系统及昆虫细胞表达系统,对WENV、LCMV的核衣壳(nucleocapsid,N)蛋白进行表达、纯化;然后用纯化的原核细胞系统表达的蛋白免疫小鼠,制备抗血清。用纯化的昆虫细胞系统表达的蛋白作为检测抗原,与抗血清之间进行western-blot鉴定,分析WENV与LCMVN蛋白之间的交叉反应。结果WENV与LCMV的N蛋白之间存在双向交叉反应。结论LCMV与WENV的N蛋白之间存在抗原交叉反应,为进一步进行WENV的血清学研究提供重要的实验依据。