骨髓基质干细胞的体外培养及其细胞片层制备

目的探讨犬骨髓基质干细胞(BMSCs)的体外培养及成骨向诱导后细胞片层的制备方法。方法密度梯度离心法分离培养犬BMSCs,向成骨细胞方向诱导分化后,倒置相差显微镜和扫描电镜下进行形态学观察;将诱导后的BMSCs接种至温度反应性培养皿中,37℃、5%CO2饱和湿度培养,然后降温至20℃制备BMSCs的细胞片层。结果原代培养的BMSCs呈长梭形,漩涡状生长;向成骨细胞诱导后的BMSCs呈卵圆形或多角形,当温度降至20℃时,BMSCs从温度反应性培养皿上完全脱落。扫描电镜下观察可见到富含细胞外基质的完整BMSCs细胞片层。结论应用密度梯度离心法可有效获取BMSCs,并向成骨细胞诱导分化;应用温度反应性培养皿能获取完整的BMSCs细胞片层可包裹支架,并用于功能性成骨。

犬骨髓间充质干细胞片层的体外培养与制备

背景:传统的组织工程方法在收获和转移细胞方面存在诸多不足,且难以形成致密的组织,明显限制了组织工程学的发展。目的:探讨犬骨髓间充质干细胞片层的体外培养与制备方法。方法:实验犬麻醉后抽取骨髓,采用密度梯度离心法体外分离骨髓间充质干细胞。取传至第4代细胞,按1×109L-1密度接种于直径3.5cm的温度反应性培养皿中,置于37℃、体积分数为5%的CO2饱和湿度培养箱内培养,待细胞增殖融合时再将培养皿的温度降至20℃培养20min,倒置显微镜下观察细胞形态学变化及细胞片层形成情况。结果与结论:犬骨髓间充质干细胞原代培养24h呈椭圆形或多角形,72h多数细胞伸展贴壁,7d时形成细胞集落,12d时细胞呈长梭形,完全融合,细胞界限不清。温度反应性培养皿中的骨髓间充质干细胞在降温至20℃时,细胞形态发生变化,呈短梭形,且逐步从培养皿底分离,形成含细胞外基质的完整的细胞片层。证实密度梯度离心法可成功分离培养犬骨髓间充质干细胞,通过改变应用温度反应性培养皿的温度,能获取完整的细胞片层。

应用细胞片层技术构建组织工程骨

背景:传统的骨组织工程学在收获和转移细胞方面仍存在诸多不足,细胞片层技术是收获种子细胞和对种子细胞进行转移的一项新技术。目的:应用细胞片层技术与传统骨组织工程相结合的方法构建组织工程骨。方法:密度梯度离心法分离培养犬骨髓间充质干细胞,诱导其向成骨细胞分化。将诱导后的骨髓间充质干细胞接种至温度反应性培养皿中,先37℃饱和湿度培养,然后降温至20℃制备细胞片层;将犬脱钙骨基质/富血小板血浆/骨髓间充质干细胞细胞片层/骨髓间充质干细胞复合体植入犬左侧背阔肌下,术后4,8,12周,观察成骨情况。结果与结论:当温度降至20℃时,骨髓间充质干细胞从温度反应性培养皿上完全脱落,形成细胞片层,将其覆盖于犬脱钙骨基质/富血小板血浆/骨髓间充质干细胞后植入犬背阔肌下,其成骨效果明显好于不加细胞片层对照侧。说明应用细胞片层技术与传统的骨组织工程方法相结合可构建出较理想的组织工程骨。

细胞片层技术的研究进展

组织工程的发展表现出了巨大的潜力,然而传统的组织工程方法限制了组织工程学的发展。新的细胞片层技术应用温度反应性培养皿收获细胞,避免了传统方法的不足之处。该方法不使用蛋白水解,仅简单地改变温度反应性培养皿的温度,便可收获完整的细胞片层。应用细胞片层进行组织重建的方式主要有将片层直接植入受区位点、通过同型或异型细胞片层的叠加构建三维结构的组织以及细胞片层结合支架的方法构建三维结构的组织。细胞片层技术与传统的组织工程学方法结合将会促进组织工程学的发展。

犬骨髓基质细胞片层在构建组织工程骨中的作用

目的:探讨犬骨髓基质细胞(bone marrow stromal cells,BMSCs)细胞片层在构建组织工程骨中的价值。方法:制备犬同种异体脱钙骨基质(dermineralized bone matrix,DBM)。将人重组骨形态发生蛋白-2(rhBMP-2)复合到DBM上。抽取犬髂骨骨髓,采用密度梯度离心法分离犬骨髓基质细胞(BMSCs)。将经成骨诱导的第3代细胞接种于温度反应性培养皿中,制备BMSCs细胞片层。用得到的BMSCs细胞片层包裹DBM/rhBMP-2/BMSCs复合体,植入犬背阔肌血运丰富的肌筋膜下为实验侧,以无BMSCs细胞片层包裹的DBM/rhBMP-2/BMSCs复合体为对照侧。术后4、8、12周取材,行组织学观察,评价体内异位成骨的情况。采用SPSS13.0软件包对数据进行两样本均数差别的t检验。结果:实验侧成骨面积大于对照侧,2组差异有显著性(P<0.05)。术后12周,实验侧生成大量板层骨,有哈弗系统形成,骨髓腔内有红骨髓。对照侧有板层骨形成,无哈弗系统形成,骨髓腔内无红骨髓。结论:BMSCs细胞片层可促进具有致密板层骨和哈弗系统的组织工程骨的形成。

应用骨髓基质细胞片层构建组织工程骨的实验研究

目的探讨犬骨髓基质细胞(bone marrow stromal cells,BMSCs)片层在构建组织工程骨中的价值。方法抽取犬髂骨骨髓,采用密度梯度离心法分离犬骨髓基质细胞(BMSCs)。制备犬同种异体脱钙骨基质(dermineralized bone matrix,DBM)。将人重组骨形态发生蛋白-2(recombination human bone morphogenetic protein-2,rhBMP-2)复合到DBM上。将经成骨诱导的第3代细胞接种于温度反应性培养皿中,制备BMSCs细胞片层。用得到的BMSCs细胞片层包裹DBM/rhBMP-2/BMSCs复合体,植入犬左侧背阔肌肌筋膜下为实验组,以无BMSCs细胞片层包裹的DBM/rhBMP-2/BMSCs复合体植入犬右侧背阔肌肌筋膜下为对照组。术后8、12、16周取材行组织学观察,评价体内异位成骨的情况。结果成骨面积实验组(对照组,两组差异有显著性(P<0.05)。术后16周,实验组有大量板层骨形成,有哈弗氏系统形成,骨髓腔内有红骨髓。对照组有板层骨形成,无哈弗氏系统形成,骨髓腔内无红骨髓。结论 BMSCs细胞片层可促进具有致密板层骨和哈弗氏系统的组织工程骨的形成。

骨髓基质干细胞片层复合聚乳酸羟基乙酸支架构建组织工程骨

目的制备骨髓基质干细胞片层，探讨其对组织工程骨成骨的作用。方法培养骨髓基质干细胞（BMSCs）并向成骨方向诱导，利用温度反应性培养皿制备骨髓基质干细胞片层，光学及电子显微镜下观察其形态。将经过预处理的三维多孔聚乳酸羟基乙酸（PLGA）支架注射BMSCs悬液并复合干细胞片层后植入犬左侧下颌骨缺损，为实验侧；将未复合细胞片层的支架植入右侧．为对照侧。16周后，对新生骨行影像学及组织学观察分析。结果片层中细胞排列紧密，生长活跃。实验侧吸光度值高于对照侧（P〈0．05），并可见较多哈弗系统及板层骨样结构。结论经温度反应性培养皿制备的干细胞片层结合PLGA支架可形成具有板层状结构的组织工程骨。