代谢工程大肠杆菌高效利用甘油合成丁二酸

为了构建高产丁二酸的重组大肠杆菌,以删除了乙酸激酶和磷酸乙酰转移酶基因(ackA-pta)、乳酸脱氢酶基因(ldhA)和丙酮酸甲酸裂解酶基因(pflB)的大肠杆菌CICIM B0013-025为出发菌株,将其磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(ppc)基因的启动子替换为温度诱导的λ噬菌体启动子P_L-P_R,获得温度调控型的丁二酸合成菌株B0013-026。继而通过发酵条件优化,建立了两阶段发酵法:菌株的生长温度和诱导温度分别为37和42℃,以甘油为碳源并添加入5 g/L蛋白胨,发酵产酸阶段在微供氧(100 r/min)条件下进行。在5 L发酵罐中采用最优条件进行发酵,丁二酸的产量、生产强度和甘油转化率分别为62.5 g/L、1.04 g/(L·h)和64.2%,而且发酵液中仅有少量的α-酮戊二酸(3.0 g/L)和乙酸(1.8 g/L)等副产物积累,实现了以甘油为唯一碳源高效合成丁二酸,为其工业化生产提供了重要参考。

葡萄糖脱氢酶温控表达菌株的构建及其发酵工艺

膜结合型的吡咯喹啉醌依赖性葡萄糖脱氢酶(m PQQGDH,EC 1.1.5.2)是一种重要的氧化还原酶,因其在血糖诊断及葡萄糖传感器中的重要应用而受到广泛的关注.但是其低表达水平限制了这种酶的大规模工业化生产及应用.本文利用λ噬菌体的温敏型启动子PL-PR替换葡萄糖脱氢酶基因的启动子,构建了重组菌大肠杆菌(E.coli)B0013-120/p GCd::Km-PL-PR,并使重组菌的酶活比原始菌株提高了21.2%,.再通过发酵条件的优化,确定了m PQQGDH的最适诱导表达条件为:以甘油为碳源、诱导温度42,℃、诱导时间4,h、诱导前菌体密度A600=1.6.最后对该酶的酶学性质进行了分析,其最适反应温度和p H分别为25,℃和6.0,所得m PQQGDH的热稳定性在45,℃条件下可维持稳定的活性.这为葡萄糖脱氢酶更广泛的应用及工业化生产奠定了基础.