不同提取方法对温肺化纤汤提取物的抗氧化活性评价

目的:比较不同提取方法制备的温肺化纤汤提取物的体外抗氧化活性。方法:分别采用水提取法和不同条件乙醇回流提取法制备温肺化纤汤的提取物,采用DPPH法、ABTS法和还原力测定法,以维生素C为阳性对照,测定不同温肺化纤汤提取物的抗氧化作用强度。结果:阳性对照(维生素C)清除DPPH、ABTS+IC50值分别为7.42、22.75μg·mL-1,还原力EC50值为65.81μg·mL-1,温肺化纤汤的60%乙醇提取物具有最强的体外抗氧化活性,其清除DPPH、ABTS+IC50值分别为247.11、440.41μg·mL-1,还原力EC50值为972.60μg·mL-1。结论:温肺化纤汤具有一定的抗氧化活性,这为温肺化纤汤的临床应用提供科学依据,并为其新药研发奠定基础。

温肺化纤汤调控Nrf2通路抑制博来霉素致肺纤维化作用

目的:探讨温肺化纤汤对博来霉素诱导肺纤维化大鼠抗氧化作用及途径。方法:取SD大鼠50只,随机分为正常组,模型组,温肺化纤汤高、温肺化纤汤中、温肺化纤汤低剂量组,每组10只。建立肺纤维化大鼠模型,给药组大鼠同时灌服温肺化纤汤进行干预,28d处死大鼠,HE染色法观察肺组织病理结构变化,用酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒检测肺组织中的SOD、GSH-Px和CAT含量。RT-PCR和Western blot检测Nrf2的表达。结果:(1)肺组织病理染色结果显示明显加重肺纤维化程度,(2)抗氧化物SOD、CAT和GSH在模型组表达下降,给予温肺化纤汤明显促进SOD、CAT和GSH表达;(3)与对照组比较,肺纤维化中、高剂量温肺化纤汤处理组胞核Nrf2表达水平增加(P<0.05)。与模型组相比,高剂量处理组温肺化纤汤胞核Nrf2表达水平增加,差异有统计学意义(P<0.01)。与低剂量温肺化纤汤处理组比较,中、高剂量温肺化纤汤处理组上述指标明显改善(P<0.05)。然而,中、高剂量温肺化纤汤处理组比较无统计学意义(P>0.05)。结论:温肺化纤汤在延缓肺纤维化的形成及发展中起到重要的作用,可能与温肺化纤汤调控Nrf2通路对博来霉素致肺纤维化起到干预作用。

温肺化纤汤干预肺纤维化大鼠肺组织中Nrf2含量研究

目的:探讨温肺化纤汤对博来霉素诱导肺纤维化大鼠抗氧化作用及途径。方法:取SD大鼠15只,随机分为正常组、模型组、低剂量处理组、中剂量处理组、高剂量处理组,每组3只。建立肺纤维化大鼠模型,给药组大鼠同时灌服温肺化纤汤进行干预,4周后取血和肺组织样本,Western Blotting法检测肺组织Nrf2含量的变化。结果:与对照组比较,肺纤维化组、中、高剂量温肺化纤汤处理组胞核Nrf2表达水平增加(P<0.05)。与模型组相比,高剂量处理组温肺化纤汤胞核Nrf2表达水平增加,差异有统计学意义(P<0.01)。与低剂量温肺化纤汤处理组比较,中、高剂量温肺化纤汤处理组上述指标明显改善(P<0.05)。中、高剂量温肺化纤汤处理组间比较无统计学意义(P>0.05)。结论:温肺化纤汤在延缓肺纤维化的形成及发展中起到重要的作用,可能与温肺化纤汤干预机体氧化-抗氧化机制对肺纤维化的作用有关。

温肺化纤汤治疗肺间质纤维化6例分析

肺间质纤维化，属中医“肺痿”范畴。本病病机多认为肺燥津伤或肺气虚冷，津气亏损，失于濡养以致肺叶枯萎，治疗多从滋阴润肺，清热生津，或温肺益气入手。我们根据肺间质纤维化的发病、病理及临床特点，结合临床实践体会，认为本病以阳虚、痰凝、血瘀为病理基础，并遵洪广祥教授“治肺不远温”之学术观点，以温阳、化痰、行瘀为法，予自拟方温肺化纤汤为主方进行辨治，每获卓效。现举数案，以飨同道。

温肺化纤汤对系统性硬化症相关间质性肺病模型小鼠肺组织纤维化及内质网应激的影响

目的探讨温肺化纤汤治疗系统性硬化症相关间质性肺病(SSc-ILD)肺纤维化的作用机制。方法将60只C3H/He雌鼠随机分为对照组、模型组、吡非尼酮组及温肺化纤汤低、中、高剂量组。除对照组外,其余各组小鼠予博来霉素溶液0.04 mg/d背部皮下连续注射28天建立SSc-ILD小鼠模型。造模成功后,吡非尼酮组予吡非尼酮胶囊300 mg/(kg·d)灌胃,温肺化纤汤低、中、高剂量组分别给予温肺化纤汤7.81、15.62、31.24 g/(kg·d)灌胃,对照组及模型组予生理盐水0.1 ml/10 g灌胃,共21天。干预结束后采用HE染色和Masson染色观察小鼠皮肤及肺组织的病理变化;检测小鼠皮肤及肺组织的羟脯氨酸含量;Western blot法测定小鼠肺组织中的内质网应激相关蛋白葡萄糖调节蛋白78(BIP)和C/EBP同源蛋白(CHOP)及核因子κB(NF-κB)通路中p65的蛋白表达水平;ELISA测定小鼠血清中的γ干扰素(IFN-γ)、白细胞介素6(IL-6)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)的表达水平。结果HE染色、Masson染色结果显示,与对照组比较,模型组小鼠皮肤组织表皮棘层肥厚,胶原纤维明显增粗、膨大,数量增多,炎性细胞明显增多;肺组织出现明显的炎性细胞反应,大量胶原纤维增生,并伴有炎性细胞浸润。与模型组比较,吡非尼酮组和温肺化纤汤各剂量组皮肤组织和肺组织胶原纤维增生明显减少,炎性细胞浸润减少,且吡非尼酮组和温肺化纤汤中、高剂量组效果基本相当。与对照组比较,模型组小鼠皮肤组织和肺组织羟脯氨酸含量,血清IFN-γ、IL-6、TNF-α含量,肺组织BIP和CHOP蛋白表达水平均升高(P<0.05)。与模型组比较,吡非尼酮组和温肺化纤汤低、中剂量组皮肤组织羟脯氨酸含量降低,温肺化纤汤中剂量组肺组织羟脯氨酸含量下降,吡非尼酮组和温肺化纤汤高剂量组小鼠血清IFN-γ、IL-6、TNF-α含量及肺组织BIP、CHOP和p65蛋白表达水平降低(P<0.05)。温肺化纤汤中剂量组肺组织羟脯氨酸含量明显低于温肺化纤汤低、高剂量组,温肺化纤汤低、中剂量组小鼠血清IFN-γ、IL-6、TNF-α含量高于温肺化纤汤高剂量组,温肺化纤汤高剂量组BIP蛋白表达水平明显低于温肺化纤汤低、中剂量组(P<0.05)。结论温肺化纤汤可改善SSc-ILD模型小鼠皮肤组织及肺组织纤维化,其作用机制可能是通过抗炎、抑制NF-κB通路,进而抑制内质网应激,最终阻抑纤维化进程。

基于NAMPT/SIRT1的温肺化纤汤含药血清延缓肺间充质干细胞炎性衰老的作用机制

目的:通过温肺化纤汤含药血清干预D-半乳糖(D-gal)诱导的肺间充质干细胞(LMSCs),探索温肺化纤汤通过烟酰胺磷酸核糖转移酶/沉默信息调节因子1(NAMPT/SIRT1)信号通路延缓LMSCs衰老的作用机制。方法:制备温肺化纤汤含药血清。采用梯度密度离心法分离LMSCs,体外培养并鉴定LMSCs。通过D-gal刺激细胞24 h建立体外衰老模型。温肺化纤汤含药血清不同体积分数(5%、10%、20%、40%、80%)干预LMSCs细胞24 h后造模并采用噻唑蓝(MTT)比色法检测细胞增殖水平。将细胞随机分为空白血清组、模型组、温肺化纤汤含药血清高、中、低剂量组。采用衰老相关β-半乳糖苷酶(SA-β-gal)染色检测各组LMSCs衰老情况;比色法检测NAD+含量;酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测细胞培养上清液中衰老相关因子(p16、p53)、白细胞介素-6(IL-6)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平;蛋白免疫印迹法(Western blot)检测衰老相关蛋白及NAMPT/SIRT1信号通路相关蛋白的相对表达量。结果:与空白血清组比较,D-gal刺激24 h后,LMSCs细胞增殖受到显著抑制(P<0.01);与模型组比较,予以相应的温肺化纤汤含药血清干预后均可促进LMSCs细胞的增殖(P<0.05,P<0.01)。与空白血清组比较,D-gal刺激后的模型组LMSCs细胞SA-β-gal染色增强,NAD+含量增多(P<0.01),细胞培养上清中衰老因子p16、p53及SASP促炎因子IL-6、TNF-α的表达量均显著提高(P<0.01),衰老相关蛋白p16、p21、p53表达上升(P<0.01),NAMPT、SIRT1、过氧化物酶体增殖活化受体γ辅助活化因子1α(PGC-1α)、叉头框蛋白O1(FoxO1)蛋白表达下降(P<0.01)。与模型组比较,温肺化纤汤含药血清各剂量组LMSCs细胞SA-β-gal染色明显减轻,NAD+含量减少(P<0.01);细胞培养上清中衰老因子(p16、p53)和炎性因子(IL-6、TNF-α)均显著下降(P<0.01);衰老相关蛋白(p16、p21、p53)表达明显减少(P<0.05,P<0.01);NAMPT、SIRT1、PGC-1α、FoxO1的蛋白表达明显上调(P<0.05,P<0.01)。结论:温肺化纤汤可减轻D-gal诱导的LMSCs细胞衰老和炎症反应损伤,其机制可能与调控NAMPT/SIRT1信号通路有关。

刘良徛“全程温法治疗肺纤维化”思想在系统性硬化症相关间质性肺病中的应用

刘良徛在继承国医大师洪广祥“治肺不远温”思想基础上,创新提出“全程温法治疗肺纤维化”的学术观点,认为“阳虚寒凝、痰滞血瘀”为肺纤维化的核心病机。系统性硬化症相关间质性肺病属于慢性肺纤维化的范畴,其中医病机与上述相一致。治疗上予以温阳散寒、涤痰行瘀,温肺化纤汤为其有效方剂。现总结刘良徛诊治系统性硬化症相关间质性肺病的学术思想及临床经验,以期为该病的中医治疗提供参考。

刘良徛教授运用温肺化纤汤治疗肺间质纤维化经验

肺间质纤维化是一类疑难病症,缺乏安全有效的治疗方法,病死率高,预后差。刘良徛教授在继承历代医家学术思想的基础上,结合数十年临床实践,认为肺间质纤维化是一个本虚标实之证,阳虚是本病的内因,阳虚证候可出现在肺间质纤维化病情发生发展过程中,痰和瘀是本病的继发因素,阳虚、痰浊、血瘀构成了肺间质纤维化的3个主要环节。基于全程温肺理论,刘教授创制具有温阳散寒、化痰行瘀之功的"温肺化纤汤"以治疗肺间质纤维化获得较好疗效,并举验案佐证。

温肺化纤汤含药血清对小鼠肺间充质干细胞增殖和迁移能力的影响

目的:探讨温肺化纤汤含药血清对小鼠肺间充质干细胞(PMSCs)增殖和迁移能力的影响,为温肺化纤汤临床应用治疗肺间质纤维化提供实验依据。方法:贴壁法分离培养小鼠PMSCs,流式细胞术鉴定PMSCs细胞表型并对其分化能力进行鉴定;CCK-8法检测温肺化纤汤含药血清对PMSCs增殖能力的影响;细胞划痕实验测定温肺化纤汤含药血清对小鼠PMSCs迁移能力的影响。结果:分离培养PMSCs具备间充质干细胞的细胞表型特征并具有成骨成脂分化功能。温肺化纤汤含药血清干预后,与空白对照组比较,可显著促进PMSCs的增殖和迁移能力(P<0.01,P<0.05)。结论:温肺化纤汤含药血清对小鼠PMSCs的增殖和迁移有明显的促进作用。

不同提取方法对温肺化纤汤几大类成分含量的影响

目的:比较不同提取方法制备的温肺化纤汤提取物中总黄酮、总多酚、总皂苷和总多糖的含量,确定温肺化纤汤的最佳提取方法。方法:分别采用水提取法和不同条件乙醇回流提取法制备温肺化纤汤的提取物,以紫外分光光度法测定温肺化纤汤中总皂苷、总多酚、总黄酮和总多糖的含量。结果:60%乙醇提取方法为最佳提取方法,不但得率高,而且总皂苷、总多酚、总黄酮和总多糖等大类成分的提取率也是最高的。结论:温肺化纤汤以60%乙醇提取方法为宜。

温肺化纤汤乙醇提取物体外抗氧化活性研究

目的研究温肺化纤汤乙醇提取物体外抗氧化活性。方法采用清除DPPH自由基、清除ABTS+自由基、还原力测定三个抗氧化实验方法,评价温肺化纤汤水、30%、60%、90%乙醇提取物体外抗氧化活性。结果 60%乙醇提取物具有最强的体外抗氧化活性,其清除DPPH、ABTS+自由基IC50值分别为247.11、440.41μg·ml-1,还原力EC50值为972.6μg·ml-1。结论温肺化纤汤具有一定的体外抗氧化活性,其中以60%乙醇提取物最强,此结论可为该方最佳提取方法提供科学依据。

紫外分光光度法测定温肺化纤汤中各大类成分的含量

目的利用紫外分光光度法测定温肺化纤汤中总黄酮、总多酚、总皂苷和总多糖的含量。方法采用硝酸铝显色法测定温肺化纤汤中总黄酮的含量;采用Folin-ciocalteu法测定温肺化纤汤中总多酚的含量;采用香草醛-冰醋酸-高氯酸显色法测定温肺化纤汤中总皂苷的含量;采用硫酸苯酚比色法测定温肺化纤汤中总多糖的含量。结果芦丁在25∽200μg·ml-1范围内线性关系良好（r=0.999 0）,测得温肺化纤汤中总黄酮含量为（7.37±0.76）mg·ml-1;没食子酸在10∽100μg·ml-1范围内线性关系良好（r=0.999 5）,测得温肺化纤汤中总多酚含量为（11.83±0.12）mg·ml-1;薯蓣皂苷元在25∽200μg·ml-1范围内线性关系良好（r=0.999 7）,测得温肺化纤汤中总皂苷含量为（20.75±2.43）mg·ml-1;葡萄糖在10∽100μg·ml-1范围内线性关系良好（r=0.999 0）,测得温肺化纤汤中总多糖含量为（154.81±3.00）mg·ml-1。结论紫外分光光度法简捷、准确、灵敏度高,可以很好地测定温肺化纤汤中黄酮类、多酚类、皂苷类和多糖类化合物的含量,其结果为温肺化纤汤的新药研发提供了科学依据。

温肺化纤汤的计算机药理学研究

目的:应用计算机化学信息学方法研究温肺化纤汤的小分子化学成分的物理化学性质,并预测其可能的活性靶点。方法:收集温肺化纤汤已经确定的788个小分子化学成分,采用Discovery Studio(2.5)软件计算小分子化学成分的物理化学性质,并进行深入分析。运用分子对接和复杂网络分析技术研究治疗调脾护心方所含化学成分和靶标之间的相互作用。结果:温肺化纤汤的化学成分具有良好的多样性,提示其可能具有多向药理活性,并筛选得到温肺化纤汤中9种关键化学成分和6种关键靶标。结论:本研究结果可为温肺化纤汤的后续的细胞和动物实验提供线索,促进温肺化纤汤的新药研发。

温肺化纤汤对过氧化氢诱导的肺间充质干细胞氧化应激损伤模型有氧糖酵解功能的影响

目的探讨温肺化纤汤治疗特发性肺纤维化(IPF)其可能机制。方法梯度密度离心法分离提取C57BL/6小鼠肺间充质干细胞(LMSCs)。体外培养LMSCs,采用不同浓度(100、200、300、400、500、600、700、800μmol/L)的过氧化氢(H_(2)O_(2))诱导细胞损伤,MTT法检测LMSCs细胞存活率,选择细胞存活率约为50%的H_(2)O_(2)损伤浓度进行后续试验。细胞分为正常对照组、温肺化纤汤组,温肺化纤汤组设浓度为1600、800、400、200、100、50、25μg/ml,MTT法检测温肺化纤汤的毒性。细胞分为正常对照组、模型组、温肺化纤汤组,温肺化纤汤设浓度为1600、800、400、200、100、50、25μg/ml,根据剂量最小化和疗效最大化的原则,结合细胞存活率确定药物的最佳浓度用于后续试验。实验分为正常对照组、模型组、阳性对照组及温肺化纤汤低、中、高剂量组。除正常对照组外,模型组和温肺化纤汤各剂量组分别在温肺化纤汤预处理24 h后均给予H_(2)O_(2)造模6 h。造模结束后检测细胞上清中葡萄糖摄取量及乳酸水平,RT-PCR检测有氧糖酵解相关酶己糖激酶2(HK2)、丙酮酸激酶2(PKM2)mRNA水平。结果600μmol/L H_(2)O_(2)作用于LMSCs 6 h,细胞的存活率为(52.17±0.82)%,并作为后续氧化应激损伤模型的浓度。与正常对照组比较,不同浓度的温肺化纤汤(25~1600μg/ml)对LMSCs均无毒性作用(P>0.05)。与模型组比较,不同浓度(25~1600μg/ml)温肺化纤汤预处理的LMSCs存活率均显著增加(P<0.01);按4倍设定等比浓度梯度,采取终浓度为25、100、400μg/ml温肺化纤汤作为低、中、高剂量组的干预浓度。与正常对照组相比,模型组LMSCs氧化应激损伤后导致葡萄糖摄取量和乳酸含量降低(P<0.01),有氧糖酵解相关酶HK2和PKM2 mRNA水平均下降(P<0.05)。与模型组对比较比,温肺化纤汤各剂量组均可增强葡萄糖摄取量和乳酸的水平(P<0.05),且温肺化纤汤中、高剂量(100、400μg/ml)则增强了HK2、PKM2 mRNA表达(P<0.01)。与阳性对照组比较,温肺化纤汤高剂量组葡萄糖摄取量、乳酸含量均升高(P<0.05)。与温肺化纤汤低剂量组比较,温肺化纤汤中、高剂量组的HK2、PKM2 mRNA水平均明显增高(P<0.05)。结论温肺化纤汤可能通过增强LMSCs的有氧糖酵解改善H_(2)O_(2)诱导的细胞氧化应激损伤,从而治疗IPF。

温肺化纤汤的组方原则与临床应用

肺间质纤维化病机根本在于阳虚,后期兼有气虚,疾病特点属本虚标实,阳虚为本,痰浊瘀血为标,其中以"瘀"贯穿疾病始终。核心病机为阳虚寒凝,痰瘀阻络,提出温阳散寒、祛痰行瘀的治疗原则,并在此基础上创制出专方温肺化纤汤,该方由阳和汤加桃仁、红花、川芎、地龙、土鳖虫组成,在扶阳的同时重视活血化瘀,临床应用中强调全程宜"温"。文章即从温肺化纤汤的组方原则及其临床应用方面作一探讨。

温肺化纤汤对H2O2诱导小鼠肺间充质干细胞氧化应激损伤的保护作用机制

目的:探讨温肺化纤汤对H2O2诱导小鼠肺间充质干细胞(PMSCs)氧化应激损伤的保护作用和分子机制。方法:通过H2O2作用小鼠PMSCs建立氧化应激损伤模型;MTT检测细胞存活率;化学显色法检测LDH、MDA及SOD含量;流式细胞术检测ROS和细胞凋亡率;Western Blot检测凋亡相关蛋白及Nrf2通路相关蛋白。结果:温肺化纤汤可以显著降低ROS、LDH、MDA含量(P<0.01),提高SOD含量(P<0.01);Western Blot结果显示,温肺化纤汤可以显著降低Bax及Cleaved Caspase-3蛋白的表达,提高Bcl-2蛋白的表达,激活Akt蛋白磷酸化(P<0.01),促进Nrf2质蛋白和核蛋白表达(P<0.01),提高下游蛋白HO-1的表达(P<0.01),从而降低细胞凋亡率(P<0.01)。结论:温肺化纤汤对H2O2诱导的小鼠PMSCs氧化应激损伤具有保护作用,其作用机制是通过激活Akt/Nrf-2/HO-1信号通路实现的。

全程温法治疗肺间质纤维化的临床体会

肺间质纤维化为疑难致死性疾病,目前缺乏有效治疗手段。中医治疗肺间质纤维化有良好前景。本文作者经多年临床实践发现肺间质纤维化证候的基本特征是虚实夹杂,阳虚寒凝为本,痰滞血瘀为标,从而提出全程温法治疗本病,临床疗效甚好。本文即从理论及临床方面探讨以全程温法治疗肺间质纤维化的可行性及依据。

全程温法治疗肺间质纤维化的再思考

肺间质纤维化是呼吸系统疑难病,笔者通过多年的临床实践,认为该病病机为阳虚寒凝、痰滞血瘀,提出全程温法治疗肺间质纤维化,并在阳和汤的基础上创立温肺化纤汤,临床疗效显著。文章基于先前团队探索,现从古籍先例、传承创新、临床应用等多方面对全程温法加以解释阐述,为全程温法治疗肺纤维化的可行性进行更加深入的探讨及思考。

从肺间充质干细胞线粒体角度浅析全程温法治疗肺间质纤维化

传承于国医大师洪广祥“治肺不远温”学术思想,本团队创新性提出“全程温法治疗肺间质纤维化”,拟方“温肺化纤汤”,取得了较好的疗效。团队近期研究发现,温肺化纤汤能稳定氧化应激环境下肺间充质干细胞的线粒体形态,这一微观现象与中医学温法激动人体阳气之宏观理论相合,亦为“全程温法”提供了新的理论依据。

国医大师洪广祥“气阳学说”在肺间质纤维化诊治中的微观体现

国医大师洪广祥教授创新构建“气阳学说”体系,本课题组基于此提出“全程温法治疗肺间质纤维化”,文章结合近年来基础研究发现,将“全程温法”“温肺化纤汤”“肺间充质干细胞”“线粒体”“外泌体”“肺间质纤维化”串联成完整的理论回路,旨在运用现代科学技术,去阐释“气阳学说”宏观体系指导下的肺间质纤维化诊治微观体现。