温肺化纤颗粒通过调节铁死亡改善肺纤维化的机制研究

目的:探讨温肺化纤颗粒是否通过调节铁死亡改善肺纤维化的发生。方法:将50只昆明小鼠随机分为对照组、模型组、温肺化纤颗粒低剂量(WFHXL)组、温肺化纤颗粒中剂量(WFHXM)组和温肺化纤颗粒高剂量(WFHXH)组。除对照组外,余各组予以气管内滴注博来霉素(5 mg/kg)进行肺纤维化造模。造模后,温肺化纤颗粒低、中、高剂量组小鼠分别给予2.925、5.85、11.7 g/kg温肺化纤颗粒混悬液灌胃,对照组和模型组予以0.1 mL/10 g的生理盐水灌胃,连续28 d。末次灌胃24 h后,采用HE和Masson染色观察小鼠肺脏病理损伤;Real-time PCR检测小鼠肺脏Nrf2、HO-1、NQO1、GPX4 mRNA表达;ELISA检测肺脏组织中GSH、Fe、MDA含量;免疫组化检测肺脏组织中Nrf2、HO-1、NQO1蛋白含量。结果:与对照组比较,模型组小鼠肺泡间隔增厚、肺泡结构明显损坏,可见明显的蓝色胶原纤维沉积,肺脏组织MDA和Fe含量明显升高(P<0.01),GSH含量明显降低(P<0.01);Nrf2、HO-1、NQO1、GPX4 mRNA表达明显降低(P<0.01);Nrf2、HO-1、NQO1蛋白表达水平明显减少。与模型组比,温肺化纤颗粒各剂量组小鼠肺泡间隔增厚减轻、肺泡结构损坏减轻,肺脏中蓝色胶原纤维沉积减少,温肺化纤颗粒低、中、高剂量组小鼠肺脏组织中MDA和Fe含量明显降低(P<0.01),GSH含量明显升高(P<0.01),Nrf2、HO-1、NQO1、GPX4 mRNA表达水平明显升高(P<0.01),Nrf2、HO-1、NQO1蛋白表达水平明显升高。结论:温肺化纤颗粒具有改善肺纤维化作用,其作用机制可能通过调节铁死亡,进而达到减轻肺脏组织损伤的效果。

温肺化纤颗粒通过调控TGF-β1/Smad信号通路改善肺纤维化

目的:探究温肺化纤颗粒抗博来霉素诱导小鼠肺纤维化的作用及其机制。方法:将C57BL/6J雄性小鼠随机分为Control组、Model组、WFHX-low-dose(12.5 g·kg^(–1))组、WFHX-high-dose(50 g·kg^(–1))组以及吡非尼酮(Pirfenidone,180 mg·kg^(–1))组,采用气管插管法灌注博来霉素(0.75 mg·kg^(–1))建立肺纤维化模型。自造模第2天起灌胃给药干预,持续给药28 d。HE和Masson染色法检测肺组织肺泡炎及纤维化程度;RT-qPCR法检测肺组织白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、胶原蛋白Ⅰ(collagenⅠ)以及上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)相关标志物的mRNA表达;Western blot法检测肺组织IL-6、TNF-α、CollagenⅠ、EMT相关标志物以及转化生长因子β1(transforming growth factorβ1,TGF-β1)/Smad信号通路相关蛋白表达;免疫组织化学染色法(IHC)检测p-Smad3、Smad7表达。结果:与Control组比较,Model组的组织纤维化评分显著升高,IL-6、TNF-α、collagenⅠ以及间质标志物纤维连接蛋白(fibronectin,Fn)、波形蛋白(vimentin)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的mRNA及蛋白表达水平显著上调(P<0.01),上皮标志物钙黏蛋白E(E-cadherin)显著下调(P<0.05)。同时,TGF-β1与p-Smad2、p-Smad3蛋白表达增加,Smad7表达减少;与Model组比较,给药干预后显著降低了肺组织纤维化程度,并且WFHX给药组均在不同程度上改善上述因子的表达,显著抑制炎症因子IL-6、TNF-α释放,减轻肺组织炎症反应,减少collagenⅠ的分泌,改善EMT,减少TGF-β1生成并抑制Smad2、Smad3磷酸化,上调Smad7的表达。结论:温肺化纤颗粒可通过减轻炎症反应,抑制EMT,抑制TGF-β1/Smad信号通路发挥抗纤维化作用。

温肺化纤颗粒抗小鼠特发性肺纤维化的代谢组学分析

目的:探讨硫酸博莱霉素(BLM)诱导肺纤维化形成不同阶段和给药小鼠血清中差异代谢物的变化,以及温肺化纤颗粒抗特发性肺纤维化的作用机制。方法:小鼠随机分为空白组、14 d空白组、模型组、14 d模型组及温肺化纤颗粒低、高剂量组。模型组、14 d模型组和温肺化纤颗粒低、高剂量组气管注入BLM(0.04 U/只)造模,空白组和14 d空白组气管注入等量无菌生理盐水;温肺化纤颗粒低、高剂量组气管注入BLM次日起每天分别灌胃给予不同剂量温肺化纤颗粒,空白组、14 d空白组、模型组和14 d模型组每天灌胃给予等量无菌水;14 d空白组和14 d模型组小鼠气管注入BLM后14 d取外周血制备血清,其余各组小鼠连续给药28 d后取外周血制备血清并取材。采集小鼠支气管肺泡灌洗液(BALF)进行白细胞分类计数;小鼠肺组织进行病理学检测及羟脯氨酸(HYP)含量测定;采用超高效液相色谱-质谱法(UHPLC-MS)分析各组小鼠血清样本小分子代谢产物,通过主成分分析(PCA)、正交偏最小二乘法-判别分析(OPLS-DA)等筛选差异代谢物并进行代谢通路分析。结果:与空白组比较,模型组小鼠肺组织出现大量连续纤维化病灶,肺泡炎评分、纤维化程度评分及HYP含量显著上升(P<0.01),BALF中白细胞总数、巨噬细胞总数和淋巴细胞总数明显上升(P<0.05)。14 d模型组较14 d空白组共筛选出33个差异代谢物,以脂质代谢物为主,主要涉及氧化损伤和炎症过程;模型组较空白组共筛选出34个差异代谢物,以氨基酸代谢物为主,主要涉及核酸损伤和炎症过程。与模型组比较,温肺化纤颗粒高剂量组小鼠肺组织的HYP含量、纤维化评分及肺泡炎评分明显下降(P<0.05,P<0.01),BALF中淋巴细胞总数明显下降(P<0.05);与模型组比较,温肺化纤颗粒高、低剂量组分别筛选出40、27个差异代谢物;温肺化纤颗粒低、高剂量组各自与模型组的共有差异代谢物共计9个,主要涉及炎症相关脂质、精氨酸和色氨酸代谢途径,在温肺化纤颗粒低、高剂量组中的变化趋势较模型组均明显回调。结论:温肺化纤颗粒可减轻BLM所致的小鼠肺纤维化,减少胶原沉积和炎症反应,其抗纤维化作用可能与影响炎症因子、一氧化氮及氧化应激相关代谢通路有关。

基于内质网应激信号通路探讨温肺化纤颗粒对肺纤维化模型小鼠肺损伤的影响

目的探讨温肺化纤颗粒治疗肺纤维化的可能作用机制。方法将50只昆明小鼠随机分为空白对照组、模型组及温肺化纤颗粒低、中、高剂量组,每组10只。除空白对照组外,其余各组小鼠通过气管内滴注博来霉素构建肺纤维化模型。造模后,温肺化纤颗粒低、中、高剂量组小鼠分别给予温肺化纤颗粒混悬液2.925、5.85和11.7 g/(kg·d)灌胃,空白对照组和模型组给予生理盐水0.1 ml/10 g灌胃,连续28天。末次灌胃24h后采用HE和Masson染色观察小鼠肺组织病理损伤;Real-time PCR检测小鼠肺组织克老素(Klotho)、转化生长因子β1 (TGF-β1)、α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、葡萄糖调节蛋白78 (GRP78)、C/EBP同源蛋白(CHOP) mRNA表达;Western blot法检测小鼠肺组织Klotho、GRP78、CHOP、B淋巴细胞瘤2相关X (Bax)、B淋巴细胞瘤2 (Bcl-2)蛋白表达;免疫组化法观察肺组织TGF-β1、α-SMA蛋白表达。结果与空白对照组比较,模型组小鼠肺脏病理切片显示肺泡间隔增厚、病变区肺泡结构受到破坏,可见明显的蓝色胶原纤维沉积。肺组织中TGF-β1、α-SMA、GRP78、CHOP mRNA表达明显升高,Klotho mRNA表达明显降低(P<0.01),TGF-β1、α-SMA、GRP78、CHOP、Bax蛋白表达明显增加,Klotho、Bcl-2蛋白表达明显减少(P<0.01)。与模型组比较,温肺化纤颗粒各剂量组小鼠肺脏损伤减轻、肺泡间隔稍增厚、病变肺泡结构破坏减轻,小鼠肺脏中蓝色胶原纤维沉积减少,肺组织中TGF-β1、α-SMA、GRP78、CHOP mRNA表达明显降低,Klotho mRNA表达明显升高(P<0.01),温肺化纤颗粒中、高剂量组GRP78、CHOP、Bax蛋白表达明显降低,温肺化纤颗粒各剂量组Klotho、Bcl-2蛋白表达明显升高(P<0.01);与温肺化纤颗粒低、高剂量组比较,温肺化纤颗粒中剂量组蓝色胶原纤维沉积最少,α-SMA、GRP78、CHOP mRNA降低,Klotho mRNA表达升高,Bax、GRP78、CHOP蛋白表达降低,Bcl-2蛋白表达升高(P<0.05或P<0.01)。结论温肺化纤颗粒具有抑制肺纤维化的作用,其机制可能是通过抑制内质网应激介导的凋亡发生,从而减少上皮间质转化。