温肾通督方促进小鼠脊髓损伤的修复

背景:前期研究证实,温肾通督方可通过抑制脾脏B细胞焦亡、促进微血管内皮细胞吞噬髓鞘碎片、影响小胶质细胞迁移和浸润、促进受损神经元恢复、降低脊髓损伤后神经元凋亡等促进脊髓损伤恢复,但其机制尚不明确。目的:探讨温肾通督方对脊髓损伤小鼠髓系细胞触发受体2(triggering receptor expressed on myeloid cells 2,TREM2)及PI3K/Akt信号通路的影响。方法:取36只C57BL/6小鼠,采用随机数字表法分为假手术组、模型组、温肾通督方组,每组12只。模型组与温肾通督方组采用改良Allen’s法制备小鼠T10脊髓损伤模型,造模后第1天,温肾通督方组灌胃给予温肾通督方,假手术组、模型组灌胃给予生理盐水,每天1次,连续给药28 d。给药期间,通过BMS评分和斜板实验评价各组小鼠运动功能;造模后第7,28天,采用苏木精-伊红染色观察各组小鼠脊髓组织病理变化,免疫荧光染色双标法检测脊髓组织离子化钙结合适配分子1(ionized calcium binding adaptor molecule 1,IBA1)、TREM2蛋白表达,Western blot检测脊髓组织TREM2、PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt、Bcl2、Bax、Caspase3蛋白表达。结果与结论:①BMS评分和斜板实验结果表明,脊髓损伤造模后小鼠后肢运动功能下降,而经过温肾通督方治疗后,脊髓损伤小鼠后肢运动功能明显提升。②苏木精-伊红染色结果显示,与模型组比较,温肾通督方小鼠脊髓组织病理结构明显改善,表现为背侧白质和神经元萎缩程度、细胞质空泡化降低及炎性细胞浸润减少等。③免疫荧光染色结果显示,造模后第7天,模型组IBA1、TREM2蛋白表达均低于假手术组(P<0.05),温肾通督方组IBA1、TREM2蛋白表达均高于模型组(P<0.05);造模后第28天,模型组TREM2蛋白表达低于假手术组(P<0.05),温肾通督方组小鼠脊髓组织中的TREM2蛋白表达高于模型组(P<0.05)。④Western blot检测结果表明,造模后第7天,与假手术组相比,模型组TREM2、Akt蛋白表达及Bcl2/Bax比值降低(P<0.05),p-Akt、Bax蛋白表达及p-Akt/Akt比值升高(P<0.05);与模型组相比,温肾通督方组TREM2、PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt、Bcl2蛋白表达及p-PI3K/PI3K、p-Akt/Ak、Bcl2/Bax比值升高(P<0.05),Bax、Caspase3蛋白表达降低(P<0.05)。造模后第28天,与假手术组相比,模型组TREM2、PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt、Bcl2蛋白表达及Bcl2/Bax比值降低(P<0.05),Bax蛋白表达升高(P<0.05);与模型组相比,温肾通督方组TREM2、PI3K、Akt、p-Akt、Bcl2蛋白表达及Bcl2/Bax比值升高(P<0.05),Bax蛋白表达降低(P<0.05)。⑤结果表明,温肾通督方可能通过上调小胶质细胞TREM2激活PI3K/Akt信号通路,抑制神经元凋亡发挥神经保护作用,进而促进脊髓损伤的修复。

中医温肾通督方治疗腰椎管狭窄的效果及对免疫水平的影响

目的探讨中医温肾通督方治疗腰椎管狭窄的临床疗效及对患者免疫状态的影响。方法收集2014-01-2016-01我院接受保守治疗的腰椎管狭窄患者74例,按照随机数字表法分为观察组与对照组各37例。对照组应用腰痹通胶囊治疗,观察组应用中医温肾通督方治疗,比较两组临床疗效及治疗前后视觉疼痛量表(VAS)评分、日本整形外科学会(JOA)腰痛疾病评分、免疫功能指标。结果治疗后两组的VAS评分均较治疗前明显降低,JOA评分均较治疗前显著提高,T淋巴细胞亚群(CD4+、CD4+/CD8+)均显著升高,CD8+均显著降低(P<0.05),IL-6及TNF-α水平均显著降低,上述指标的治疗前后差异均有统计学意义(P<0.05),且观察组上述指标的改善效果均显著优于对照组(P<0.05);观察组总有效率为91.89%,显著高于对照组的70.27%(P<0.05)。结论中医温肾通督方治疗腰椎管狭窄疗效显著,能够缓解临床症状、改善腰部功能状态并增强机体免疫,有一定的临床应用价值。

温肾通督方对脊髓损伤模型小鼠脾脏B细胞影响的蛋白组学研究

目的探讨温肾通督方对脊髓损伤的影响及可能机制。方法36只C57BL/6雌性小鼠随机分为假手术组、模型组、温肾通督方组,每组12只。模型组、温肾通督方组小鼠采用改良Allen's法建立小鼠脊髓损伤模型,假手术组仅进行脊髓暴露。温肾通督方组从术后第1天按50 g/(kg·d)给予温肾通督方溶液灌胃,假手术组及模型组给予生理盐水20 ml/(kg·d)灌胃,各组均连续灌胃14天。在术前及术后第1、7、14天,利用斜板试验及后肢运动功能(BMS)评分对小鼠运动功能进行评估;术后第3天通过肌电图及运动诱发电位检测小鼠神经电生理,测量各组小鼠脾脏长度,利用磁珠分选脾脏中的B细胞,通过蛋白组学技术分析蛋白差异表达情况,采用Western blot法检测脾脏B细胞中线粒体外膜转运孔蛋白20(Tom20)及下游剪切化半胱氨酸蛋白酶3(Cleaved Caspase-3)蛋白表达;术后第14天采用核磁共振观察小鼠脊髓恢复情况。结果与假手术组同时间比较,模型组在术后1、7、14天BMS主评分、副评分及斜板试验角度均降低,术后3天小鼠肌电图和运动诱发电位峰峰值降低、脾脏长度减少,脾脏B细胞中Tom20和Cleaved Caspase-3表达量升高(P<0.05)。与模型组同时间比较,温肾通督方组小鼠术后14天时BMS副评分及术后7、14天时斜板试验角度升高,术后3天小鼠肌电图和运动诱发电位峰峰值升高、脾脏长度增加,Tom20和Cleaved Caspase-3表达量降低(P<0.05)。蛋白组学结果显示,温肾通督方组与模型组相比共有100个差异蛋白,其中37个上调,63个下调。GO富集显示差异蛋白主要在氧结合、外源性凋亡负反馈、锌离子相应、氧输送等方面发挥作用。KEGG富集显示差异蛋白主要集中在代谢途径、亨廷顿病、氧化磷酸化等通路。亚细胞定位显示差异蛋白与线粒体相关。术后14天磁共振成像显示,假手术组小鼠脊髓结构完整,节段清晰,脊髓信号无异常;模型组小鼠脊髓损伤区域低信号区域增加,脊髓明显变细;温肾通督方组损伤节段有明显凹陷,但较模型组结构要完整。结论温肾通督方可能通过调节免疫功能促进脊髓损伤修复,其机制可能与抑制脾脏B细胞焦亡等相关。

温肾通督方对脊髓损伤后微血管内皮细胞吞噬髓鞘碎片的影响

目的:探究温肾通督方对脊髓损伤后微血管内皮细胞(MECs)吞噬髓鞘碎片的影响及其作用机制。方法:采用改良A11en’s法制备脊髓损伤小鼠模型,1、3、7d后通过HE染色和尼氏染色观察损伤脊髓的病理改变。利用ELISA法检测损伤脊髓和血清中MCP-1、IL-6、IL-1β、TNF-α的表达水平,通过3D激光共聚焦观察损伤脊髓中MECs吞噬髓鞘碎片情况,采用多重免疫荧光染色检测脊髓损伤后MECs中HDAC6、LC3B、NLRP3表达。结果:与模型组比较,温肾通督方明显减少脊髓损伤后炎症细胞的浸润和神经元的固缩坏死;显著降低脊髓和血清中MCP-1、IL-6、IL-1β、TNF-α的水平(P<0.01,P<0.05);促进MECs吞噬髓鞘碎片,并能下调HDAC6、NLRP3表达,上调LC3B表达(P<0.01)。结论:温肾通督方可能通过抑制HDAC6促进MECs吞噬髓鞘碎片,并能同时阻断NLRP3通路的信号转导,共同改善炎性微环境,促进脊髓损伤修复。

通督温肾方联合塞来昔布治疗强直性脊柱炎43例

强直性脊柱炎属于自身免疫性慢性病变,起病隐匿而缓慢[1]。近年来,由于多种因素的影响,导致大量患者存在腰背部及臀部疼痛不适症状,若不及时有效地治疗,可最终导致病情反复发作,脊柱关节畸形[2]。中医药治疗强直性脊柱炎历史悠久,联合西医治疗可为优化治疗提供一定方向[3]。基于此,本观察探讨通督温肾方联合塞来昔布对强直性脊柱炎患者临床疗效及相关机制。现报道如下。

基于HDAC6介导的自噬-溶酶体途径探究温肾通督方对微血管内皮细胞吞噬髓鞘碎片的影响

目的 基于组蛋白脱乙酰基酶(HDAC)6介导的自噬-溶酶体途径,探究温肾通督方影响微血管内皮细胞(MECs)吞噬髓鞘碎片的作用机制。方法 通过CCK-8法检测温肾通督方冻干粉干预后MECs的增殖状态,筛选其最佳干预浓度;构建体外类血管结构,并建立髓鞘碎片与类血管结构共培养模型;将实验分为空白组(MECs)、模型组(MECs与髓鞘碎片共培养)、Tubastatin-A组(MECs与髓鞘碎片共培养+HDAC6抑制剂Tubastatin-A)以及温肾通督方组(MECs与髓鞘碎片共培养+温肾通督方冻干粉),通过免疫荧光染色法检测MECs吞噬髓鞘碎片的情况,并利用激光共聚焦进行拍照分析;通过Western Blot法检测MECs微管稳定系统(HDAC6、Kinesin5、Dynein)及自噬-溶酶体途径(LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、p62、Beclin1)相关蛋白的表达。结果 免疫荧光结果表明,与模型组比较,Tubastatin-A组和温肾通督方组都可显著促进MECs吞噬髓鞘碎片(P<0.05)。Western Blot结果表明,与空白组比较,模型组HDAC6的蛋白表达显著增高(P<0.05);与模型组比较,Tubastatin-A组和温肾通督方组HDAC6的蛋白表达显著降低,而Kinesin5、Dynein、Beclin1、p-ULK1/ULK1的蛋白表达显著增高(P<0.05);与Tubastatin-A组比较,温肾通督方组HDAC6、Kinesin5、Dynein、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin1、p-ULK1/ULK1的表达差异无统计学意义(P>0.05)。结论 MECs吞噬髓鞘碎片会导致HDAC6的表达上调,但并不会影响MECs微管稳定系统及自噬-溶酶体途径;Tubastatin-A及温肾通督方均可通过抑制HDAC6的表达增强MECs微管系统的稳定,进而激活自噬-溶酶体途径,促进MECs吞噬髓鞘碎片。

王钢主任医师治疗强直性脊柱炎的临床经验

强直性脊柱炎(AS)是一种慢性免疫介导的关节炎,以慢性腰痛、放射学骶髂关节炎、脊柱骨质破坏过多和异常骨形成为特征,多数患者表现为HLA-B27阳性,增加了患病风险。近年来,随着人们生活环境和方式的改变,AS发病率呈上升趋势,男女比例为2~20∶1,而中药在临床治疗AS方面具有不可替代的作用。王钢主任医师总结前人经验,在此基础上结合自己多年临床经验,认为肾虚督寒是AS的重要病机之一,并以此提炼出一系列临床上行之有效的方剂。通督温肾方作为其中之一,在中医药治疗AS方面具有较好的临床疗效,值得推广与应用。