定量检测猪繁殖与呼吸综合征病毒游离受体夹心ELISA方法的建立与应用

为了建立猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)游离受体定量检测方法,本试验用表达猪唾液酸黏附素(Sn)游离受体的重组腺病毒rAd-Sn4D-Fc感染PK-15细胞,以细胞培养上清纯化的Sn4D-Fc游离受体作为标准抗原,鼠抗猪Sn免疫血清为一抗,生物素标记兔抗猪Sn多克隆抗体为二抗,建立定量检测Sn4D-Fc游离受体的双抗体夹心ELISA方法;用rAd-Sn4D-Fc注射仔猪,定期采集血清进行游离受体检测。结果显示,纯化Sn4D-Fc标准抗原的纯度为94.3%,能被Sn免疫血清识别;一抗的最佳工作浓度为5μg/mL蛋白,二抗的最佳稀释度为1∶4 000,夹心ELISA检测标准抗原的灵敏度为0.4ng/mL,对照抗原无交叉反应;夹心ELISA能从重组腺病毒注射猪血清中检测到Sn4D-Fc游离受体,最高表达量为6.54ng/mL,持续时间为15d。研究结果表明,建立的双抗体夹心ELISA可用于PRRSV游离受体的体内外定量检测。

胰岛β细胞游离脂肪酸受体1表达对胰岛素分泌的影响

目的研究高脂、罗格列酮和非诺贝特对体外培养的β细胞瘤细胞系NIT-1细胞游离脂肪酸受体1(FFAR1)mRNA表达和胰岛素分泌功能的影响。方法将NIT-1细胞随机分为正常组(NC组)、高脂组(PA组)、高脂加罗格列酮组(RG组)、高脂加非诺贝特组(FF组)体外培养48 h,用放免法检测细胞基础胰岛素分泌(BIS)及葡萄糖刺激的胰岛素分泌(GSIS)水平,酶法检测胞内甘油三酯(TG)含量,RT-PCR技术检测细胞内FFAR1 mR-NA水平。结果与NC组比较,PA组GSIS降低,细胞内TG含量增多,FFAR1 mRNA表达明显上调。与PA组比较,RG、FF组GSIS增强,细胞内TG含量减少;RG组FFAR1 mRNA表达与之接近,FF组则明显减少,接近NC组水平。结论高脂对β细胞的毒性作用部分是通过上调FFAR1 mRNA表达所致;非诺贝特可通过抑制这种作用保护β细胞功能;罗格列酮对β细胞功能的保护作用与之无关。

皮划艇运动员血清瘦素与游离瘦素受体的水平初探

为了解皮划艇运动员血清瘦素与游离瘦素受体的水平。国家队皮划艇运动员24名,按性别分成高水平与普通水平共4组,用酶联免疫吸附法测试血清瘦素与游离瘦素受体(SOB-R)水平。不同性别瘦素与SOB-R有显著差异(P<0．01),同性别的不同训练水平的运动员SOB-R有非常显著差异(P<0．01)。SOB-R受训练水平的影响,男性高水平运动员血清SOB-R高于普通运动员组,而女性高水平运动员血清SOB-R低于普通运动员。

牛游离脂肪酸受体1基因研究

ffar-1在胰腺组织和神经系统中均有着重要作用,但其作用机制,尤其是在神经系统中的机制仍不清楚。以牛ffar-1基因为研究对象,通过生物信息学预测并分析该基因的核心启动子区域,利用5'RACR技术扩增牛ffar-1基因mRNA 5'UTR区域,同时构建牛ffar-1基因真核表达载体并在真核细胞中进行表达。生物信息学分析表明,牛ffar-1基因核心启动子属于TATA-less,Int-DPE类型;5'RACE结果将牛ffar-1基因mRNA序列向上游推进了726 bp;成功构建了牛ffar-1真核表达载体pIRES-EGFP-bffar-1,并在真核细胞中进行了表达。从启动子序列、mRNA 5'UTR及真核细胞表达3个方面对牛ffar-1基因进行了初步研究,为该基因功能及调控的相关研究提供理论和试验依据。

游离脂肪酸对胰岛β细胞胆囊收缩素受体mRNA表达的影响

将体外培养良好的NIT-1细胞分为对照组、油酸组、软脂酸组、油酸+软脂酸组,37℃、5%CO2条件下培养72h,放免法测定培养液上清中胰岛素含量,RT-PCR法检测细胞胆囊收缩素受体CCK-AR、CCK-BR mRNA的表达。结果:经FFAs处理的NIT-1细胞培养液胰岛素含量明显降低,油酸组更显著;油酸、软脂酸、油酸+软脂酸处理后细胞的CCK-AR mRNA表达明显低于对照组。结论:游离脂肪酸可显著减少小鼠胰岛β细胞CCKAR mRNA的表达以及降低胰岛素的分泌量。

游离脂肪酸受体的组织分布及GPR40配基对胰岛β细胞胰岛素分泌功能的影响

目的检测游离脂肪酸受体(FFARs)在大鼠不同组织中的表达,并探讨GPR40配基对原代培养大鼠胰岛β细胞和INS-1细胞株胰岛素分泌功能的影响。方法通过RT-PCR法检测GPR40、GPR41、GPR43、GPR84、GPR119及GPR120在大鼠不同组织和胰岛β细胞中的表达;以不同浓度的GPR40激动剂GW9508或亚油酸(LA)作用于原代胰岛β细胞2 h后,收集培养上清,用大鼠胰岛素ELISA试剂盒检测胰岛素水平;并检测它们对大鼠胰岛β细胞株INS-1胰岛分泌功能的影响。结果 GPR40在脑、心、脾、结肠组织中表达较高,GPR41除肝外在所测组织中均显著表达,GPR43在脾脏中表达,GPR84和GPR119在脑中表达较高,GPR120在结肠中表达最高;在大鼠原代胰岛细胞中GPR40表达最高;高糖(25 mmol/L)培养条件下,GW9508或LA能促进原代培养胰岛β细胞和INS-1细胞胰岛素的分泌,加入1μmol/L的GW1100后胰岛素分泌量下降(P<0.05,P<0.01,n=3)。结论 FFARs的组织分布具有一定的规律,GPR40是调节胰岛素分泌的重要信号分子,其激动剂GW9508有可能成为治疗糖尿病的新型药物。

中长链游离脂肪酸及其受体FFAR1和FFAR4对健康作用的研究进展

中长链游离脂肪酸不仅是机体重要的能量来源,也是机体免疫中重要的信号分子。近年来研究表明,中长链游离脂肪酸通过与游离脂肪酸受体(free fatty acid receptors,FFAR)1和FFAR4互作,调节胰岛素分泌和炎症反应来进一步调节机体免疫代谢。本综述讨论了有关中长链游离脂肪酸饮食以及在体内的代谢,重点介绍了中长链游离脂肪酸及其受体介导的信号途径对味觉信号传导、代谢调节和免疫应答中的关键生理功能影响及合成激动剂的研究进展。

游离脂肪酸受体4在腹腔与肺泡巨噬细胞的差异性表达及其与细胞因子表达的相关性分析

目的观察小鼠腹腔和肺巨噬细胞游离脂肪酸受体4(FFAR4)的表达情况并分析与细胞因子水平的相关性。方法采用流式细胞术分选成年BALB/c小鼠腹腔和肺泡巨噬细胞,应用实时定量PCR检测细胞的FFAR4和白细胞介素1(IL-1)、IL-6、IL-10、肿瘤坏死因子α(TNF-α)的mRNA水平,并采用一元线性回归法对FFAR4与细胞因子的相关性进行分析。结果肺泡巨噬细胞的FFAR4 mRNA水平显著高于腹腔巨噬细胞。IL-1和TNF-α的mRNA水平在肺泡巨噬细胞也显著高于腹腔巨噬细胞,IL-10和IL-6的mRNA水平在肺泡巨噬细胞显著低于腹腔巨噬细胞。腹腔FFAR4 mRNA水平与IL-10、IL-6、TNF-α的mRNA水平正相关,与IL-1 mRNA水平负相关。肺巨噬细胞的FFAR4 mRNA水平与IL-1、IL-6、TNF-α的mRNA水平正相关,与IL-10 mRNA水平负相关。结论 BALB/c小鼠腹腔和肺巨噬细胞的FFAR4 mRNA水平不同,且与细胞因子的水平具有一定的相关性。

游离脂肪酸受体4调控能量代谢的途径与分子机制

游离脂肪酸(FFA)是调节机体能量代谢的重要物质,可通过胞内代谢所产生的中间产物或在胞外激活细胞膜上G蛋白偶联受体调节代谢。FFA受体4(FFAR4)是FFA激活的一种膜受体,表达于下丘脑、胃肠道、脂肪、肝脏和舌等多种与物质代谢相关的组织,可影响激素和细胞因子等分泌,通过多个途径调节机体代谢过程,包括影响下丘脑摄食中枢活动,调节胃肠内分泌,改变脂肪细胞状态,参与肝脏代谢,影响味觉和食物喜好等。FFAR4激动剂可通过以上作用增加机体能量消耗,有望用于肥胖和2型糖尿病的治疗。

游离脂肪酸受体4在脂肪细胞中的作用及表达调控研究进展

游离脂肪酸受体4(FFAR4)可感受中长链游离脂肪酸的变化,调节机体能量代谢,增强机体胰岛素敏感性,是治疗2型糖尿病的药物靶点分子。FFAR4表达于脂肪组织,通过参与脂肪细胞分化和脂质蓄积以及改变脂肪细胞能量代谢在机体代谢调控中发挥重要作用。FFAR4的表达水平是影响脂肪细胞作用的关键因素。脂肪细胞脂质蓄积程度、转录因子过氧化物酶体增殖物激活受体、白细胞介素-1和肿瘤坏死因子-α等细胞因子均可调节脂肪细胞FFAR4的表达水平。但脂肪细胞FFAR4表达调控的具体分子机制目前尚不明确,因此深入研究FFAR4在脂肪细胞中的作用对于探寻治疗2型糖尿病和肥胖的新候选分子具有重要意义。

游离脂肪酸受体4对胃肠激素分泌的调节作用及其生理意义研究进展

游离脂肪酸受体4(FFA4)是定位于细胞膜的G蛋白偶联受体,表达于胃肠道黏膜中的内分泌细胞,可感知胃肠道和机体组织中游离脂肪酸水平变化,调节胃肠激素分泌。FFA4激活可刺激胰高血糖素样肽-1、葡萄糖依赖性胰高素样多肽、胆囊收缩素、神经紧张素等多种激素分泌,同时抑制胃饥饿素分泌。FFA4通过调节胃肠激素的分泌而影响食物摄入、消化、吸收及能量代谢等生理过程。

游离脂肪酸受体4(FFAR4/GPR120)调控巨噬细胞功能的研究进展

游离脂肪酸受体4(FFAR4/GPR120)表达于巨噬细胞,调控白细胞介素1(IL-1)、IL-6和肿瘤坏死因子α(TNF-α)等细胞因子的表达与分泌,介导ω-3多不饱和脂肪酸的抑炎效应。FFAR4可通过Gq/11蛋白激活磷脂酶C和胞质磷脂酶A2介导的信号分子途径,或者通过β抑制蛋白2(β-arrestin 2)调控炎症相关分子,改变核因子κB(NF-κB)等转录因子活性。巨噬细胞在机体分布广泛,FFAR4调节巨噬细胞状态,进而影响脂肪组织、肌肉组织、肝脏等组织器官的功能,参与肥胖、胰岛素抵抗、骨质疏松、脂肪肝等疾病发生。目前对FFAR4激活在巨噬细胞的效应和对疾病的治疗作用还处于认识的初期,许多问题仍待更深入研究。

一氧化氮/环磷酸鸟苷依赖性蛋白激酶对血管平滑肌细胞三磷酸肌醇受体Ⅰ型表达及细胞内游离钙的调节

目的证明一氧化氮/环磷酸鸟苷依赖性蛋白激酶对血管平滑肌细胞三磷酸肌醇受体Ⅰ型的表达以及细胞内游离钙水平的调节。方法比色法测定血管平滑肌细胞增殖,激光共聚焦显微镜测定细胞内游离钙离子浓度,逆转录聚合酶链反应以及免疫印迹法测定三磷酸肌醇受体Ⅰ型的表达水平。结果一氧化氮供体S-亚硝基-N-乙酰青霉胺和环磷酸鸟苷依赖性蛋白激酶选择性环磷酸鸟苷类似物Sp8-pCPT-cGMP抑制血管平滑肌细胞增殖,但环磷酸鸟苷依赖性蛋白激酶拮抗剂Rp-8-pCPT-cGMP促进血管平滑肌细胞增殖。且S-亚硝基-N-乙酰青霉胺和Sp-8-pCPT-cGMPS可以进一步抑制经维拉帕米预处理后的血管平滑肌细胞增殖。维拉帕米抑制苯肾上腺素刺激的细胞内游离钙离子浓度升高,这一抑制作用能够被S-亚硝基-N-乙酰青霉胺和Sp-8-pCPT-cGMP进一步加强,但可被Rp-8-pCPT-cGMP减轻。三磷酸肌醇受体Ⅰ型mRNA转录与蛋白质表达被S-亚硝基-N-乙酰青霉胺和Sp-8-pCPT-cGMP降低,但被Rp-8-pCPT-cGMP增加。结论一氧化氮/环磷酸鸟苷依赖性蛋白激酶在转录水平和翻译水平抑制血管平滑肌细胞三磷酸肌醇受体Ⅰ型的表达,进而参与对细胞内游离钙离子浓度的调节。

微滴数字PCR技术动态监测非小细胞肺癌患者血浆游离DNA EGFR基因突变研究

目的:探讨微滴数字PCR技术(ddPCR)动态监测非小细胞肺癌(NSCLC)患者血浆游离DNA表皮生长因子受体(EGFR)基因突变的临床价值。方法:选取2017年3月-2019年3月就诊于笔者所在医院的120例NSCLC患者,均行突变扩增系统(ARMS)、ddPCR检测血浆EGFR标本。以肿瘤组织ARMS检查结果为金标准,分析血浆ARMS、ddPCR检测EGFR基因突变的敏感性和特异性。结果:120例患者经ARMS检测到肿瘤组织标本中EGFR基因突变阴性59例(49.17%);EGFR基因突变阳性61例(50.83%),其中Exon20 T790M突变2例,含Exon19del突变32例,含Exon21L858R突变26例,合并Exon20T790M突变1例;血浆ARMS、ddPCR检测EGFR基因和含Exon19del、Exon21L858R基因突变的特异性均为100%,检测EGFR基因和含Exon19del、Exon21L858R基因突变敏感性分别为57.38%(35/61)、80.33%(49/61),62.50%(20/32)、84.38%(27/32),46.15%(12/26)、76.92%(20/26),差异有统计学意义(P<0.05)。结论:dd PCR动态监测NSCLC患者血浆EGFR基因突变的敏感性与特异性较高,并能够定性EGFR基因突变类型,能为临床治疗提供指导。

n-3多不饱和脂肪酸加重FFAR4基因缺失小鼠结肠炎进程

炎症性肠病(inflammatory bowel disease, IBD)是一种慢性肠道疾病,额外营养支持有助于缓解IBD患者病情。研究表明膳食中n-3多不饱和脂肪酸具有良好的抗炎作用,而人群研究表明部分IBD患者额外补充n-3多不饱和脂肪酸无益于其疾病缓解。大规模测序发现n-3多不饱和脂肪酸受体基因FFAR4存在突变,n-3多不饱和脂肪酸在IBD治疗中的不确定结果是否与FFAR4基因的缺失有关,目前尚不清晰。通过对野生型(WT)小鼠和FFAR4基因缺失(FFAR4KO)小鼠进行结肠炎造模,并同时对两组小鼠额外补充n-3多不饱和脂肪酸,实验结果表明,在同时补充n-3多不饱和脂肪酸的情况下,相较于WT小鼠,FFAR4KO小鼠的结肠炎更加严重,表现为更多的体质量丢失、更高的疾病活动指数(disease activity index,DAI)、更高的结肠髓过氧化物酶(MPO)活性以及更高的结肠炎症因子转录水平。该研究为IBD患者得到精确营养干预提供了理论依据。

GPR120在慢性气道炎症疾病中作用的研究进展

慢性气道炎症疾病(包括慢性阻塞性肺疾病和哮喘等)的发病率不断增加,但当前对此类疾病的治疗和控制手段有限,需要寻找潜在的治疗靶点。目前研究发现G蛋白偶联受体120(G protein-coupled receptor 120,GPR120),又称游离脂肪酸受体4(free fatty acid receptor,FFA4)或ω-3脂肪酸受体1,具有抑制炎症、降低气道阻力、舒张支气管、调节天然免疫的功能,这与气道炎性疾病的发生发展密切相关。本文重点对GPR120的结构、分布等生物学特性、传导通路等方面进行综述。一些证据表明,它们在炎症调控中具有重要意义,并探讨基于GPR120在慢性气道炎性疾病中发挥作用的进展过程。

游离脂肪酸受体在肺部疾病中的研究进展

游离脂肪酸受体(FFAR)是一类具有多功能性的G蛋白偶联受体,参与细胞内信号传导,调节细胞凋亡、炎症反应、免疫反应和能量代谢等生物学过程。近年来,国内外多项研究发现,FFAR在肺部疾病中发挥着重要作用,有望成为防治呼吸系统疾病的潜在研究靶点。本文对FFAR在哮喘、肺部感染、急性肺损伤、慢性阻塞性肺疾病、特发性肺纤维化等疾病发展中的作用及机制作一综述,以期为呼吸系统疾病的防控、干预提供新的方向。

益生菌灌服/健康大鼠肠道微生物群移植对大鼠妊娠期糖尿病的治疗作用及其机制

目的观察益生菌灌服/健康大鼠肠道微生物群移植对大鼠妊娠期糖尿病(GDM)的治疗作用,探讨其作用机制。方法取70只SD雌性大鼠和35只SD雄性大鼠,2:1合笼交配交配成功后随机抽取10只雌鼠为对照组(记为第0天),其余60只雌鼠腹腔注射链脲佐菌素建立GDM大鼠模型,造模成功(大鼠随机血糖≥16.7 mmol/L)后将40只大鼠分为一、二、三、四组,每组各10只。第5天一组大鼠予359.708 mg/kg益生菌补充剂灌胃,二组大鼠予1 mL/100g的健康大鼠粪菌混悬液灌胃,三组大鼠给予359.708 mg/kg益生菌补充剂、1mL/100 g健康大鼠粪菌混悬液灌胃,四组与对照组大鼠予10 mL/kg的PBS缓冲液灌胃,各组大鼠每日灌胃1次,连续14天。第19天取各组大鼠,采用口服葡萄糖耐量试验测算血糖;第20天取各组大鼠,麻醉后留取结肠内容物及结肠组织,采用GC-2010气相色谱仪测算大鼠结肠内容物短链脂肪酸(乙酸、丙酸、丁酸及异丁酸)含量,分别采用RT-qPCR法Western Blotting法检测各组结肠组特异性G蛋白偶联游离脂肪酸受体(GPR43)、胰高血糖素样肽-1(GLP-1)的mRNA及蛋白。结果与对照组相比,第20天四组大鼠糖耐量低,结肠内容物乙酸、丁酸、异丁酸含量低,结肠组织GPR43 mRNA、GLP-1mRNA及蛋白相对表达量均低(P均<0.05)。与四组相比,一、二、三组大鼠糖耐量高,第20天时结肠组织GPR43 mRNA、GLP-1mRNA及蛋白相对表达量均高(P均<0.05)。结论益生菌灌服/健康大鼠肠道微生物群移植可改善大鼠GDM,益生菌灌服/健康大鼠肠道微生物群移植可能通过增加结肠内容物中SCFAs含量,提高结肠组织GPR43、GLP-1mRNA及蛋白表达,改善大鼠的GDM。

多不饱和脂肪酸对Δ15 Des转基因小鼠睾丸结构和功能的影响及机制

目的探讨多不饱和脂肪酸(PUFAs)对Δ15脂肪酸去饱和酶(Δ15 Des)转基因小鼠睾丸结构和功能的影响及机制。方法取C57BL/6野生型(WT)雄性小鼠和Δ15 Des转基因雄性小鼠分别作为对照组(n=5,WT组)和实验组(n=5,TG组),均饲喂含6%花生四烯酸(ARA)饲料8周,麻醉处死,分离睾丸组织及附睾组织,采用气相色谱(GC)检测睾丸组织中脂肪酸的组成及含量,采用精子质量分析仪(CASA)检测附睾组织中精子形态及运动活力[精子总活力、直线运动精子活力、精子平均路径速度(VAP)、精子曲线速度(VCL)及精子直线速度(VSL)],采用苏木精-伊红(HE)染色观察睾丸组织的形态学特征,采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测2组小鼠睾丸组织中游离脂肪酸受体1(FFAR1)、FFAR2、FFAR3、FFAR4及过氧化物酶体增殖物激活受体α(PPARα)、PPARβ、PPARγ信使RNA(mRNA)的表达,采用蛋白质印迹法检测2组小鼠睾丸组织中FFAR4和PPARγ蛋白的水平。结果与WT组相比,TG组小鼠睾丸组织中ARA与二十二碳四烯酸(DTA)含量降低(P<0.05或P<0.01),亚油酸(LA)、二十碳五烯酸(EPA)、二十二碳六烯酸(DHA)含量升高(P<0.05或P<0.01);2组小鼠的精子形态及数量无明显差异,TG组小鼠精子的直线运动精子活力、VSL较WT组升高(P<0.05),精子总活力、VAP、VCL无差异(P>0.05);与WT组相比,TG组小鼠睾丸组织曲细精管内空泡较少,成熟精子增多;与WT组相比,TG组小鼠睾丸组织中FFAR4、PPARαmRNA表达上调(P<0.01或P<0.05),PPARβmRNA表达下调(P<0.05),FFAR4蛋白水平增加(P<0.05)。结论n-3 PUFAs可改善Δ15 Des转基因小鼠睾丸组织的结构和功能,其机制可能与结合FFAR4、激活下游信号分子有关。

HbHCS患者的氧化应激状态及其对Hepcidin的调节

目的:探讨血红蛋白H-Constant Spring病(hemoglobin constant spring discase,HbHCS)患者的氧化应激状态及其对铁调素(hepcidin)的影响。方法:共35例HbHCS患者纳入研究,其中切脾者15例,未切脾者20例。另有20例健康人群为对照。检测患者和健康人群血浆超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、还原型谷胱甘肽(GSH)、氧化型谷胱甘肽(GSSG)水平,检测患者血浆造血调控因子红细胞生成素(EPO)、血清游离转铁蛋白受体(sFTR)、生长分化因子15(GDF15)水平和铁代谢调节因子hepcidin水平,并行单因素相关分析和多因素回归分析。结果:与健康人群相比,HbHCS患者的SOD和GSH水平下降而MDA和GSSG水平上升。切脾和未切脾患者的SOD、MDA、GSG、GSSG水平无显著性差异。相关分析表明,HbH CS患者的SOD水平与EPO、sFTR、GDF15水平呈负相关,MDA水平则与上述指标呈正相关。EPO和sFTR水平与Hepcidin呈负相关。结论:HbH CS患者存在过度的氧化应激,并通过上调EPO和sFTR而抑制hepcidin,参与患者的铁超载。