番茄N-聚糖酶基因SlaPNGase1的功能分析

番茄(Solanum lycopersicum)作为新疆红色产业,对当地经济发展有重要意义。由于新疆气候特点,无霜期较短,导致番茄被集中采收。加工能力不足,番茄采摘后被搁置数天,伴随高温天气,番茄成熟过度,导致软化变质,造成严重的经济损失和资源浪费。本试验为研究N-聚糖酶基因SlaPNGase1在番茄果实成熟软化过程中的潜在生物学功能,以加工番茄‘里格87-5’为材料,克隆到番茄N-聚糖酶基因SlaPNGase1(Solyc06g051020)及其上游2 220 bp的启动子序列。通过生物信息学初步分析,发现SlaPNGase1含有信号肽序列,不含有跨膜结构域,该启动子中含有多个与果实成熟应答相关的顺式作用元件。通过实时定量PCR检测SlaPNGase1在番茄幼苗根、茎、叶,开花后5 d幼果(DPA5),成熟绿果(DPA33),成熟红果(DPA52)中的转录表达水平(day post-anthesis, DPA)。结果显示,SlaPNGase1在番茄成熟红果中的表达水平最高。构建启动子活性分析载体prPNG1::GUS,对T1代转基因番茄果实进行GUS染色,结果表明,SlaPNGase1启动子在破色果实(DPA39)中的活性强于在未成熟绿果(DPA26)中的活性。构建35S::SlaPNGase1过表达载体,遗传转化番茄后,采摘同时期(DPA52)的过表达番茄果实和野生型番茄果实,将其放置相同光照,温度,湿度环境下。10 d后,转35S::SlaPNGase1基因过表达番茄果实有50%变黑,腐烂,发霉。相反,野生型果实只有轻微表皮失水皱缩,推测基因SlaPNGase1对番茄果实成熟软化具有作用。

基于N-聚糖和完整糖肽的单克隆抗体药物糖基化修饰表征

近年来生物制药产业快速增长,其中单克隆抗体药物的市场规模增速显著,对其进行精确的结构表征和质量控制的需求日益突出。作为抗体药非常重要的翻译后修饰,糖基化对单抗药的疗效、稳定性、免疫原性都具有重要的影响。对糖基化修饰进行表征的主要方式之一是液相色谱串联质谱技术,但该方法目前主要集中在中高丰度的聚糖表征,对低丰度的糖基化修饰研究较少。本研究建立了基于RapiFluor-MS试剂标记的单克隆抗体药物的N-聚糖定性和定量分析技术,该方法样品处理时间短,灵敏度高,不仅能够表征3种单抗药阿达木单抗、贝伐珠单抗和曲妥珠单抗的主要糖型,而且对低丰度糖基化修饰能够准确的表征并定量分析。基于该方法,作者研究了上述3种单抗药主要糖型,并对不同批次的样品中N-聚糖的相对丰度进行了对比。同时在完整糖肽水平对N-聚糖的连接位点和糖型进行解析,进一步丰富了单抗药的N-聚糖结构信息。基于RapiFluor-MS试剂标记的单克隆抗体药物的N-聚糖定性和定量分析技术能够实现对单抗药糖基化修饰的深度表征和控制。