湘云鲫2号肠道干细胞标志物LGR6分子特征及其多克隆抗体制备

【目的】克隆湘云鲫2号肠道干细胞标志物LGR6(3nLGR6)并制备多克隆抗体,为从肠道干细胞角度揭示湘云鲫2号的抗病机制提供技术支持。【方法】通过PCR扩增3nLGR6基因开放阅读框(ORF)序列,采用InterProScan、TMHMM Server 2.0、ExPASy Proteomics Server、SignalP 5.0、PSORTⅡPrediction、SoftBerry-Psite、SWISS-MODEL及MEGA 11.0等在线软件进行生物信息学分析;利用原核表达系统表达融合蛋白,以纯化的融合蛋白免疫BALB/c雌性小鼠制备多克隆抗体,基于免疫组织化学分析3nLGR6在湘云鲫2号肠组织中的分布情况。【结果】3nLGR6基因ORF序列全长2874 bp,共编码957个氨基酸残基;3nLGR6蛋白理论分子量约105.4 kD,理论等电点(p I)为5.44,在其N端有1个亮氨酸重复序列结构域,C端存在1个7次跨膜结构的GPCR结构域,且在18Gly与19Ser间存在信号肽切割位点(Sec信号肽)。3nLGR6与其他硬骨鱼类的LGR6氨基酸序列高度同源,其中与二倍体斑马鱼的相似性为92.28%。与鱼类LGR6作用密切的基因有LGR4、RNF43、RSPO2、CTNNB1、APC和CTNNA1,主要涉及Wnt信号通路和Adherens junction信号通路。以纯化得到的融合蛋白3nLGR6免疫BALB/c雌性小鼠,能成功制备出小鼠抗3nLGR6多克隆抗体,且免疫组化试验结果显示该抗体可特异性识别湘云鲫2号肠道组织中的3nLGR6。【结论】3nLGR6与其他物种的LGR6氨基酸序列高度同源,其结构和功能相对较保守。制备获得的小鼠抗3nLGR6多克隆抗体能特异性识别湘云鲫2号肠道内源性3nLGR6,为后续深入研究LGR6在硬骨鱼组织中的表达情况及揭示LGR6在肠道黏膜稳态中的作用机制提供了技术支撑。

湘云鲫2号肌肉营养成分和氨基酸组成分析

利用鱼类远缘杂交和雌核发育相结合的方法获得了改良四倍体鲫鲤(G×AT)并培育出改良二倍体红鲫(IRCC),两者交配制备出一种改良三倍体鲫鱼—湘云鲫2号(ITCC).运用生化分析方法对湘云鲫2号及其父母本的含肉率以及肌肉营养成分和氨基酸质量分数进行了定量分析.结果表明:湘云鲫2号含肉率高达50.37%,肌肉中蛋白质质量分数为19.65%,水分质量分数为77.09%,脂肪质量分数为2.14%,灰分质量分数为1.23%;肌肉干样中氨基酸总质量分数为77.79%,人体必需氨基酸质量占氨基酸总质量的25.26%,4种呈味氨基酸质量占氨基酸总质量的32.49%.通过对比湘云鲫2号与其父母本肌肉中氨基酸成分,发现4种呈味氨基酸含量远远高于其父母本中相应的4种氨基酸含量,同时也远远高于其他许多淡水鱼类.综合分析表明湘云鲫2号是一种高蛋白、低水分、氨基酸含量丰富、营养价值高的优质淡水鱼类.相关营养指数为湘云鲫2号良种种质标准提供了依据.

三倍体湘云鲫2号线粒体DNA含量与其不育的相关性研究

三倍体湘云鲫2号是通过倍间杂交产生的一种多倍体鱼(红鲫(♀)×异源四倍体鲫鲤(♂)),因其不育性状,具有重要的生产和科研价值。有研究表明线粒体在动物育性的分子调控机制中扮演了重要角色,但在鱼类中尚没有相关的研究报道。利用本实验室特有遗传背景清晰的实验鱼品系(三倍体湘云鲫2号、二倍体红鲫、异源四倍体鲫鲤和同源三倍体鲫),通过荧光定量PCR技术对比分析了它们性腺中线粒体DNA的拷贝数,发现三倍体湘云鲫2号雄性个体精巢中mt DNA含量较正常水平高,雌性个体卵巢中mt DNA含量较正常水平低。实验首次从线粒体DNA含量影响生殖细胞发育的角度探索线粒体与三倍体湘云鲫2号不育的关系,为三倍体湘云鲫2号不育分子机制的研究提供了一些新的基础数据。