抗生素溶杆菌中PAS-LuxR家族转录因子正向调控吩嗪类抗菌物质myxin的生物合成

溶杆菌Lysobacter是一类具有生防潜力的革兰氏阴性细菌。氮氧化吩嗪myxin是从抗生素溶杆菌Lysobacter antibioticus OH13中分离鉴定到的一种对病原细菌、真菌、卵菌等均具有较强拮抗活性的抗菌物质。我们已对myxin的生物合成机制进行了解析,但其生物合成的调控因子还鲜有报道。本研究在myxin生物合成基因簇上游鉴定到PAS-LuxR家族调控因子编码基因LaPhzR,LaPhzR敲除突变体丧失了产生myxin等吩嗪物质的能力,也丧失了对水稻条斑病菌RS105的拮抗能力,且myxin合成基因与解毒基因LaPhzX均不能表达。这些结果表明LaPhzR正向调控myxin的生物合成,且对myxin的生物合成是必需的。当在野生型菌株中过表达LaPhzR,myxin产量可提高1.6倍,这对myxin的开发应用具有重要意义。

抗生素溶杆菌R16鉴定及对蓝莓根癌病的防治效果研究

为筛选防治蓝莓根癌病的高效生防菌,本研究从蓝莓植株根际土壤中分离出一株对根癌土壤杆菌Agrobacterium tumefaciens有显著拮抗作用的生防细菌R16。通过细菌形态学和分子生物学鉴定,该菌为抗生素溶杆菌Lysobacter antibioticus。平板试验结果表明,菌株R16对根癌土壤杆菌具有显著的拮抗效果,其抑菌圈直径达20.00 mm;温室针刺接种和灌根试验中,该菌对根癌土壤杆菌的防效分别为77.50%和82.46%;田间试验表明,该菌对蓝莓根癌病的防效达55.00%以上,可以显著降低植株的病情指数。本文首次报道了对蓝莓根癌病具有显著防效的抗生素溶杆菌R16,该菌株能有效抑制根癌土壤杆菌的生长及其引起的起瘤反应,可为蓝莓根癌病的绿色生物防控提供新资源。

产酶溶杆菌L-43的筛选及其抑菌物质的初步鉴定

采用透明圈法和琼脂扩散法筛选具有抑菌活性的菌株,通过形态观察、理化分析及16S rDNA序列比对鉴定菌株,采用胞外酶活测定、蛋白酶水解、硫酸铵沉淀与膜分析、稳定性研究鉴定菌株所产抑菌物质。结果表明,从农田土壤中获得一株抑菌活性较好且没有溶血性的产酶溶杆菌(Lysobacter enzymogenes)L-43。该菌所产抑菌物质抑菌谱较广,对G+细菌具有良好的抑制作用,抑菌圈直径大于10 mm。对抑菌物质进行分析,其不具有溶菌酶活性、不含过氧化氢;对蛋白酶E、蛋白酶K、胃蛋白酶、胰蛋白酶敏感,抑菌活性回收率为73.43%~79.00%;经过膜分析,透析袋截留分子量为3500 u和10000 u时,抑菌活性回收率分别为93.43%和59.82%,初步判定抑菌物质主要是分子量在3500~10000 u之间的多肽类物质;抑菌物质具有良好的热、酸碱、金属离子、化学试剂和储存稳定性,121℃处理30 min活性回收率为85.66%,pH值2~10时活性回收率高于80%,进一步确定抑菌物质为多肽。综上,L.enzymogenes L-43所产抑菌物质为抑菌谱广且稳定性好的多肽。该研究为抗菌菌株及其代谢物的开发奠定了基础。

溶杆菌中活性天然产物的研究进展

微生物次级代谢产物是天然药物的重要来源,广泛应用于医药和农业生产。放线菌和真菌是产生抗生素的主要微生物,但经过长期大量的筛选,从中发现新抗生素越来越困难。随着基因测序技术的进步,越来越多的微生物基因组被测序,许多以前被忽视的微生物发现也具有产生新抗生素的潜力。溶杆菌是新型生防细菌,对植物病原真菌、细菌、卵菌和线虫等具有拮抗作用,从溶杆菌中已经发现大量结构新颖和活性显著的次级代谢产物,在生防制剂和前体药物方面具有应用前景。本文对溶杆菌资源分布、次级代谢产物种类和应用进行综述,希望为进一步从环境中筛选分离溶杆菌和发现更多具有新颖活性的天然产物提供参考。

抗生素溶杆菌对魔芋软腐病和根际微生物多样性的影响

研究施入抗生素溶杆菌菌剂对魔芋软腐病的控制作用,同时采用Biolog方法分析该生防细菌对魔芋根际微生物多样性的影响。田间试验结果显示:施入生防细菌后,抗生素溶杆菌能有效控制魔芋软腐病,还有增产作用,防效可达79.16%,增产14.30%,显著高于水合霉素和对照;还可不同程度地提高魔芋根际微生物Shan-non多样性、均匀度指数和每孔颜色平均变化率(AWCD);并且魔芋根际微生物对碳源的利用情况也发生了改变。与对照相比,施入生防菌剂的处理,对聚合物、胺类、酚类化合物的碳源利用率得以提高,而对糖类、羧酸类、氨基酸类的碳源利用率降低。综合分析认为,施入生防细菌菌剂对魔芋根际微生物群落多样性无明显的负面影响。

产酶溶杆菌OH11菌株几丁质酶基因的克隆与表达

利用PCR方法从产酶溶杆菌OH11菌株中克隆到编码几丁质酶的chiA基因。同源性比较发现,其推测产物与产酶溶杆菌C3菌株和N4-7菌株的ChiA有97%以上的序列一致性。基因经NdeⅠ和XhoⅠ双酶切后连接到含T7启动子的高表达载体pET21a(+)上构建重组质粒pChiA,并转化宿主菌BL21(AI)产生BLChiA表达菌株。经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导后发现,BLChiA菌株产生相对分子质量约为75×103的蛋白质。生物活性试验表明,该蛋白能水解几丁质,在几丁质培养基上产生一透明的水解圈,并对立枯丝核菌菌丝的生长有抑制作用。因此该蛋白具有一定的生物防治作用。

产酶溶杆菌rpfG基因的克隆与功能分析

为探索基因rpfG在产酶溶杆菌中的功能,以产酶溶杆菌OH11为研究对象,在基因组测序的基础上,通过同源比对,在OH11基因组中鉴定出rpfG的同源基因,并命名为rpfGLys。利用同源重组技术,对rpfG基因进行了定向敲除,获得了rpfG的缺失突变株。与野生型相比,rpfG基因的突变降低了产酶溶杆菌重要抗菌物质———热稳定抗菌因子HSAF的产量和对腐霉的拮抗活性。荧光定量PCR显示,在rpfG突变株中负责生物合成HSAF的关键基因Lysegl002651的表达显著下调,与HSAF活性检测结果相吻合。然而,rpfG的突变不改变产酶溶杆菌4种胞外抗菌水解酶的活性。另外,rpfG突变导致产酶溶杆菌菌落表面干燥,但滑行能力提高。

溶杆菌属细菌鉴定及生防机制概况

溶杆菌属的大部分细菌具有重要的生防前景,因而受到了高度关注。为了明确目前溶杆菌属细菌的研究现状,分析了已报道的26种溶杆菌属细菌的分布环境及典型的生化特征,基于16SrDNA序列相似性和脂肪酸组成构建了26种溶杆菌属细菌的系统进化树,并辅以DNA-DNA杂交结果进行佐证,阐述了溶杆菌属细菌对病原菌、线虫病害的生物防治物质及其作用机理,并对其生物安全和应用前景进行了展望。

产酶溶杆菌OH11菌株摇瓶发酵条件研究

采用单因素试验法研究了温度和转速等因子对产酶溶杆菌OH11液体发酵的影响。结果表明温度以30℃为宜,转速以210r/min为宜。通过正交试验在摇瓶中以LB为基础培养基对发酵培养基进行了优化。优化后的培养基中活菌数在48h时可达到4.5×109cfu/ml,明显高于原基础培养基的结果;通过正交试验对其他发酵条件的优化结果表明,装液量40ml/250ml、发酵时间72h、接种量108cfu/ml和初始pH值7.5为最适条件。

内生产酶溶杆菌R-2-1发酵工艺优化

以一株具有广谱抗菌活性的黄花蒿内生产酶溶杆菌(Lysobacter enzymogenes)R-2-1为研究对象,在LB液态培养基基础上,通过正交试验确定了其最佳发酵培养基组成为:玉米粉20 g·L-1,花生粕20 g·L-1,豆粕20 g·L-1,酵母提取物2 g·L-1,胰蛋白胨4 g·L-1,(NH4)2SO46 g·L-1,K2HPO46 g·L-1,Mg SO4·7H2O 4.8 g·L-1,Mn SO4·H2O 0.02 g·L-1,Fe SO4·7H2O 0.01 g·L-1,Ca Cl2·2H2O 0.12 g·L-1,Na Cl 2.4 g·L-1,核黄素3.0 g·L-1,硫胺素1.2 g·L-1,维生素B60.01 g·L-1,生物素0.1 g·L-1,优化后培养活菌数24 h达到6.94×108cfu·m L-1。以菌株R-2-1总发酵代谢物产量为指标,在单因素实验的基础上,采用响应面法优化其发酵工艺条件,确定最佳发酵条件为:发酵时间87.2 h,初始p H 7.55,装液量204 m L,接种量7.90 m L,发酵物产量达(0.518±0.050)g·200 m L-1;通过摇床转速和发酵温度因素考查,确定在摇床转速210 r·min-1、发酵温度30℃条件下,该菌代谢物产量可进一步提高到(0.523±0.023)g·200 m L-1。本试验结果可为该菌杀菌剂扩大生产提供参考。

绿色木霉菌和抗生素溶杆菌对苗期及大田烟草影响的研究

采用绿色木霉菌和抗生素溶杆菌菌剂对苗期和大田期烟草进行喷施处理,研究它们对烟草农艺性状及黑胫病、野火病发病情况的影响.结果表明:苗期喷施质量浓度为2.50 g/L的绿色木霉菌菌剂,对提升烟草素质效果好;大田期喷施质量浓度为2.50 g/L的抗生素溶杆菌菌剂,对提高大田烟草农艺性状的各指标效果好;抗生素溶杆菌菌剂对大田烟草野火病防治效果较好,而绿色木霉菌菌剂对大田烟草黑胫病的防治效果较好,它们的最佳喷施质量浓度都是2.50 g/L.

产酶溶杆菌OH11菌株β-1,3-葡聚糖酶基因的克隆与表达

利用PCR方法从OH11菌株中克隆到β-1,3-葡聚糖酶基因,通过同源性比较发现其推测产物与产酶溶杆菌C3菌株和N4-7菌株的β-1,3-葡聚糖酶有90%以上的同源性。该基因经NdeⅠ、XhoⅡ或HindⅢ酶切后连接到含T7启动子的高表达载体pET21a(+)和载体pET30a(+)上构建重组质粒,并分别转化宿主菌BL21(AI)和BL21(DE3)产生表达菌株。表达菌株BLGluA和BLGluC经IPTG诱导后分别产生相对分子量约为29 000(GluA蛋白)和44 000(GluC蛋白)的蛋白。酶活性和抑菌活性测定结果表明,GluA蛋白和GluC蛋白能将海带多糖水解,在海带多糖培养基上产生透明的水解圈,并对立枯丝核菌菌丝的生长有抑制作用,具有一定的生物防治作用。

抗生素溶杆菌13-1对魔芋土壤微生物群落的影响

采用传统培养分离法和Biolog方法研究了施用抗生素溶杆菌13-1对魔芋土壤微生物数量和群落代谢功能多样性的影响。分离法试验结果表明:生防细菌的施入对土壤中可培养细菌、真菌的种群数量有短期影响,随着施入时间及魔芋生育期的延长,土壤中的细菌、真菌数量逐渐恢复到对照水平;生防细菌对土壤中放线菌的种群数量影响较小。Biolog试验结果表明,生防细菌使土壤细菌群落对底物碳源利用的丰富度提高;平均颜色变化率AWCD值受魔芋生长周期的影响,具体表现为魔芋换头期生防细菌处理能提高土壤微生物群落代谢活性,而在魔芋膨大期施用生防细菌处理能降低土壤微生物群落代谢活性;主成分分析显示,在魔芋换头期和膨大期施用生防菌处理的魔芋土壤微生物群落代谢功能与对照组相比差异性达到了显著水平(P<0.05)。

产酶溶杆菌OH11菌株α-水解蛋白酶基因的克隆与表达

α-水解蛋白酶是产酶溶杆菌OH11菌株分泌的一种胞外丝氨酸蛋白酶。利用PCR方法从OH11菌株中克隆到该基因。同源性比较其推测产物与产酶溶杆菌ATCC29478菌株和ATCC29487菌株的α-水解蛋白酶有90%以上的序列一致性。基因经NdeⅠ和XhoⅠ双酶切后连接到含T7启动子的高表达载体pET30a(+)上构建重组质粒pαLP,并转化宿主菌BL21(DE3)获得BLαLP表达菌株。经IPTG诱导后发现BLαLP菌株产生一相对分子量约为44kD的蛋白。研究表明,该蛋白能将蛋白质水解,在脱脂奶粉培养基上形成水解圈,并对立枯丝核菌菌丝的生长有抑制作用。

溶杆菌属及其在植物病害防治中的研究进展

溶杆菌属具有滑动性和溶菌活性等典型特征。自1978年提出建属以来,迄今为止该属共报道了20个种。本文综述了该属的生物学、生态学特性和在植物病害生物防治中的应用潜力,讨论了它的定殖作用、抗生素、生物表面活性物质产生和诱导寄主抗病性等方面的防病机制,最后介绍了该属细菌的分子生物学、生物安全和应用前景等方面的研究进展。

利用响应面法优化溶杆菌UCo1产溶菌酶的发酵培养基

采用响应面法对溶杆菌UCo1产溶菌酶的培养基进行了优化。首先对溶杆菌UCo1产溶菌酶的发酵培养基进行了单因素试验,确定了影响产酶的3个显著因素,即碳源麦芽糖,氮源大豆蛋白胨和表面活性剂Tween-20。采用Box-Behnken响应面法对溶菌酶的发酵培养基组成进行了优化,确定了最佳条件。结果表明,麦芽糖,大豆蛋白胨和Tween-20 3因素的最佳浓度分别为1.725%,3.25%,0.048%时,溶菌酶酶活达到6973.5U/mL,与模型所得到的最大预测值6990.99U/mL基本吻合,且较优化前的酶活力(6230.4U/mL)提高了11.93%。

产酶溶杆菌OH11菌株胞外酶调控相关基因ctp的克隆及功能的初步分析

利用mariner转座子对产酶溶杆菌Lysobacterenzymogenes OH11进行转座诱变,构建菌株OH11的突变体文库。筛选到1株4种胞外酶(蛋白酶、纤维素酶、几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶)产生均减少的突变株D-11。通过亚克隆,鉴定转座子的插入位点,涉及1个羧基末端蛋白酶(carboxy-terminal protease)编码基因ctp。通过同源重组的方法对该基因进行敲除,对缺失突变体Δctp表型分析发现:(1)Δctp与野生型OH11在营养丰富型(2YT)与营养缺陷型(MMX)培养基中生长速率基本一致;(2)Δctp降低了蛋白酶、纤维素酶和β-1,3-葡聚糖酶的产生,但不影响几丁质酶的产生;(3)Δctp生物膜的产生量明显减少。研究还表明,突变体基本不改变其对油菜菌核病菌Sclerotinia sclerotiorum、水稻纹枯病菌Rhizoctonia solani和辣椒疫霉病菌Phytophthora capsici的拮抗能力。互补菌株均恢复了野生型的相关功能。

产酶溶杆菌L-43合成抗菌肽的发酵工艺优化

为提高产酶溶杆菌(Lysobacter enzymogenes)L-43发酵抗菌肽的产量,以抗菌肽效价为指标,采用单因素试验与正交试验对产酶溶杆菌L-43发酵合成抗菌肽的培养基与发酵条件进行优化,获得了发酵培养基配比为麦芽糖10.0 g/L,胰蛋白胨10.0 g/L,MgSO_(4) 1.5 g/L,优化后效价达到3770.52 AU/mL,与优化前相比,效价提高了6.26倍;在优化得到的发酵培养基基础上,探究发酵条件,培养基初始pH 7.0,装液量50 mL/250 mL,接种量2.0%(体积分数),发酵温度32℃,摇床转速180 r/min,发酵时间22 h,优化后效价达到9422.33 AU/mL,比优化前提高了15.6倍。对产酶溶杆菌抗菌肽合成量进行多方面优化,进一步提高了抗菌肽发酵产量,同时降低了发酵成本,为后期产酶溶杆菌抑菌剂的规模化生产及应用提供了参考。

辣椒溶杆菌NF87-2防治瓜类蔬菜蔓枯病的研究

由黑腐球壳菌Didymella bryoniae引起的瓜类蔬菜蔓枯病是一种重要真菌土传病害,造成瓜类蔬菜生产上重大的经济损失。本研究以蔓枯病菌DB-20为靶标菌,采用平板对峙培养法,测定了拮抗细菌及其代谢产物对蔓枯病菌菌丝生长和孢子萌发的的室内抑制作用,拮抗细菌和蔓枯病菌同时接种后,测定西瓜种子的发芽率和出苗率,采用盆栽试验研究拮抗细菌对黄瓜蔓枯病的防治效果。结果表明,辣椒溶杆菌Lysobacter capsici NF87-2对蔓枯病菌菌丝生长的室内抑制率为81.6%,菌株NF87-2及其次生代谢物对蔓枯病菌孢子萌发的抑制率分别为59.4%和67.2%。蔓枯病菌DB-20处理的京欣一号西瓜种子发芽率和出苗率分别为48%和38%,菌株NF87-2+DB-20同时接种处理组的西瓜种子发芽率和出苗率分别为83%和82%。菌株NF87-2发酵液及其代谢产物对黄瓜蔓枯病的盆栽防治效果分别为81.6%和66.5%。辣椒溶杆菌NF87-2是一株具有较好生防应用潜力的拮抗菌株,有望开发成防治瓜类蔬菜蔓枯病的生物杀菌剂。

变棕溶杆菌OH23次生代谢产物抗菌活性的分析及其发酵培养基优化

本研究通过对变棕溶杆菌Lysobacter brunescens OH23菌株发酵产物的拮抗谱进行检测,发现其发酵产物对黄单胞属植物病原细菌具有特异拮抗活性,并且对水稻黄单胞菌不同菌株的拮抗活性存在差异。本研究进一步对OH23次生抗菌物质稳定性进行了分析,发现OH23产生的次生抗菌物质对高温、紫外光照、蛋白酶、非强碱性环境均表现稳定,但在强碱性环境(pH11.0)下拮抗活性丧失。最后,采用单因素试验和正交试验设计对OH23发酵培养基组分进行了优化,最终确定OH23高产次生抗菌物质的培养基配方为高聚蛋白胨5g/L、酵母粉5g/L、可溶性淀粉6g/L、FeSO4·7H2O15mg/L、ZnSO4·7H2O5mg/L。