牛源肺炎克雷伯菌前噬菌体内溶素的表达与抗菌活性研究

【目的】预测并分析牛源肺炎克雷伯菌携带的前噬菌体以及其携带内溶素基因的情况,探究肺炎克雷伯菌前噬菌体内溶素的体外抗菌活性,为肺炎克雷伯菌感染提供新的治疗手段。【方法】以134株牛源肺炎克雷伯菌为研究对象,通过PhiSpy软件预测牛源肺炎克雷伯菌前噬菌体,并对前噬菌体进行功能注释鉴定得到内溶素。通过构建内溶素原核表达载体,对重组蛋白进行诱导表达与纯化,并验证其在体外对肺炎克雷伯菌NMG10、GS4和ATCC 13883的裂解活性。【结果】134株牛源肺炎克雷伯菌基因组的前噬菌体序列携带率为98.5%,共预测到414个前噬菌体序列,其中肺炎克雷伯菌噬菌体共112个,其余均为其他细菌的噬菌体或者噬菌体元件。每株牛源肺炎克雷伯菌所携带的全部前噬菌体占其基因组比例约为1.4%。112个肺炎克雷伯菌噬菌体的前噬菌中共有44个前噬菌体基因组中存在编码内溶素的基因,将其命名为LyKb。内溶素LyKb对肺炎克雷伯菌NMG10、GS4和ATCC 13883均具有裂解和抑菌活性,其中对肺炎克雷伯菌NMG10的裂解及抑菌活性最强,其次是肺炎克雷伯菌GS4、ATCC 13883。【结论】134株牛源肺炎克雷伯菌普遍携带前噬菌体,且部分前噬菌体基因组中含有编码内溶素的基因。肺炎克雷伯菌前噬菌体内溶素对多种肺炎克雷伯菌具有抗菌活性。

细胞溶素HlyE变体对禽致病性大肠杆菌致病力的影响

为了探究细胞溶素HlyE突变体(HlyE-V)对禽致病性大肠杆菌(APEC)致病力的影响,采用Red同源重组法构建了APEC菌株CBE59的HlyE-V基因缺失株CBE59ΔHlyE-V和回补株CBE59CΔHlyE-V,测定缺失株生长曲线、溶血活性、胞内存活曲线,并用细胞毒性试验和动物试验来评估HlyE-V对APEC致病力的影响。结果表明∶缺失HlyE-V基因对APEC的生长速率影响较小,野生株、缺失株和回补株均无溶血活性,证明HlyE-V不是孔道形成毒素,不能溶解哺乳动物的红细胞;HlyE-V缺失株致细胞毒性和对雏鸡的致病力显著降低,缺失株的半数致死量(LD50)值为4.9×10^(6)CFU/只,而野生株和回补株的LD50分别为8.2×10^(5)CFU/只、4.2×10^(5)CFU/只;在HD11巨噬细胞内的存活能力显著下降,在野生株CBE59感染的HD11中有一半的细胞中含有6~8个细菌,且有56.7%的细胞中观察到超过6个细菌;而在观察缺失株CBE59ΔHlyE-V时,菌量超过6个的仅为10.7%,相较野生株下降了46%。研究表明,HlyE-V对APEC的致病力起着关键作用。

肉豆蔻酸抑制猪链球菌细胞溶素活性及分子机制研究

为研究肉豆蔻酸对猪链球菌细胞溶素生物活性抑制作用及相互作用机制,本文开展了成孔活性试验、寡聚化试验、分子对接、分子动力学模拟、抗菌活性试验和乳酸脱氢酶活性试验。结果表明,肉豆蔻酸浓度为16μg/mL时显著降低了细胞溶素寡聚体的形成量,进而抑制了细胞溶素的成孔活性,血红素释放量是对照组的8.88%,抑制率达到91.12%。分子对接和分子动力学模拟结果表明肉豆蔻酸结合到细胞溶素的第一、二和三级结构域的交界处,且82Asn、83Asn、84Ser、87Ile、88Ala、90Ile、193Phe、194Gly、275Phe、372Ile、373Leu、374Ser贡献了较大结合能,在细胞溶素和肉豆蔻酸的结合过程中发挥了关键作用。无抗猪链球菌活性的肉豆蔻酸(最低抑菌浓度128μg/mL)浓度为16μg/mL时细胞溶素处理组和猪链球菌处理组乳酸脱氢酶释放量是对照组的67.84%和45.72%,表明肉豆蔻酸可显著缓解细胞溶素和猪链球菌介导的细胞毒性作用。以上研究结果表明:肉豆蔻酸通过与细胞溶素结合,影响了其寡聚体的形成,抑制了其成孔活性,在无抗菌活性的前提下显著缓解了细胞溶素和猪链球菌引发的细胞毒性作用,未来有望开发为抗猪链球菌感染药物。

噬菌体溶素的研究与应用进展

耐多药病原菌的大量出现严重削弱了传统抗生素的治疗效果,带来了高病发率、死亡率以及高昂的经济成本,逐渐成为威胁全球居民健康的问题。溶素是噬菌体编码的肽聚糖水解酶的总称,具有靶向破坏细菌细胞壁的能力,是噬菌体主要的杀菌功能蛋白。研究发现工程溶素对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌和鲍曼不动杆菌等多种病原菌具有杀灭作用,且能与抗生素发挥协同杀菌作用。近年来,溶素因其杀菌活性、靶向特异性、不易产生耐药性、良好的工程改造潜力等特点和在细菌控制领域的广泛应用前景而受到研究者们越来越多的关注。本文就溶素的结构分类、杀菌特性、工程改造潜力以及应用研究的最新进展进行综述,展望其在细菌控制领域的应用前景。

深海噬菌体BVE2内溶素的重组表达及其活性研究

本研究从一株来源于西南印度洋沉积物的噬菌体BVE2基因组中得到了一条全长702 bp,编码噬菌体内溶素的基因Lysin132,编码的蛋白共含有234个氨基酸残基,预计分子量为25.74 kDa;氨基酸序列同源比对结果表明BVE2 Lysin132具有多个酰胺酶活性位点。进化树分析结果表明BVE2 Lysin132是一种N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶。将Lysin132克隆到pEASY-Blunt E2 Expression Vector中,构建了E.coli-pEASY-Lysin132表达菌株。成功用IPTG诱导表达,得到了大量带有6×His标签的重组BVE2 Lysin132。经镍柱纯化后进行SDS-PAGE电泳,得到单一目的蛋白条带。酶学性质分析结果表明,重组BVE2 Lysin132的最适反应温度为30℃,在中高温下热稳定性良好,在10~50℃下孵育90 min,仍能保持70%以上的酶活力;最适pH为7.0,在pH 6.0~8.0时均能保持80%以上的酶活力,表明该酶有较宽的pH作用范围;Na+、Mg^(2+)可以使酶活力显著提高20%以上,Ca^(2+)可以使酶活力提高40%以上。抑菌实验结果表明,重组BVE2 Lysin132对革兰氏阴性菌的抑制效果较好,尤其对溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)、坎氏弧菌(V.campbellii)、哈维氏弧菌(V.harveyi)的抑制作用显著,与市售微生物溶菌酶相比,抑制效果最高提升了40%以上。因此,本研究获得了一种拥有较宽pH作用范围且热稳定性良好的内溶素,可为开发应用于水产养殖、食品保鲜、医药等领域的新型抑菌剂研发提供基础。

致病性嗜水气单胞菌气溶素基因PCR检测方法的建立

根据我国致病性嗜水气单胞菌分离株 AH-78-2气溶素 ( Aer)基因保守区的测序结果 ,设计 2对引物 ,建立了检测嗜水气单胞菌的 PCR方法。通过对 2 0株嗜水气单胞菌、1 2株相关菌株及 1 57份送检病料的检测 ,并与 SPA-Co A检测结果对照表明 ,PCR方法具有较高的敏感性与特异性 ,可检测最低 1 0 0 cfu的细菌。该方法的建立为致病性嗜水气单胞菌的检测提供了一种简便、快速的新途径 。

嗜水气单胞菌气溶素和溶血素基因的克隆与结构预测

从患出血病草鱼体上分离出1个菌株,传统分类学及16SrRNA基因鉴定其为嗜水气单胞菌,人工感染实验显示该分离菌株为强毒株。克隆该菌株的气溶素(aerolysin,aerA)基因和溶血素(hemolysin,hlyA)基因,序列分析显示这2个基因只有46.7%的同源性。Blast分析显示,hlyA基因与GenBank上已登录的hlyA序列具有较高的同源性,而aerA基因与已登录的aerA基因以及一些hlyA序列也具有较高的同源性。对与aerA基因同源性较高的这些hlyA序列进行结构域预测,发现它们均具有APT结构域和气溶素结构域,说明它们实际上应是aerA基因,只是命名上与hlyA基因混淆。用DNAstar软件预测aerA和hlyA的抗原区,显示它们均具有很好的抗原性。用特异性引物检测菌株的aerA基因和hlyA基因,结果显示2株毒力株均有特异条带,而无毒株则未扩增到特异条带,说明aerA和hlyA有可能作为鉴定嗜水气单胞菌毒力菌株的标记。

嗜水气单胞菌气溶素基因的克隆与序列分析

以嗜水气单胞菌BZ和NK分离株的DNA为模板，采用PCR技术，扩增气溶素基因（aerA）的DNA片段，将其克隆到pMD18-T载体上。通过序列测定，分析结果表明-所克隆的1393bp片段为aerA部分序列，编码产生464个氨基酸。BZ与NK之间aerA核苷酸同源性为97．6％，氨基酸同源性为98．3％，与其它分离物核苷酸同源性为71．6％～97．5％，氨基酸同源性为68．0％～98．9％。利用邻接法构建了aerA分子树状图，树状图分析表明：气单胞菌属各分离物聚为三支，其中嗜水气单胞菌各菌株之间关系密切，被聚类为同一支。

致病性嗜水气单胞菌气溶素基因的克隆与高效表达

根据 Gen Bank中致病性嗜水气单胞菌气溶素 (Aer)基因的序列设计引物 ,以国内嗜水气单胞菌分离株为模板 ,扩增出 Aer基因的全长序列。经 T载体克隆和序列测定 ,证实克隆了国内分离株的不含信号肽的 Aer全长基因。将该基因以正确的读码框架与表达载体 p ET2 8b连接 ,经 IPTG诱导、SDS- PAGE检测 ,外源基因获得高效表达。诱导 4 h的培养物中 ,融合蛋白的表达占菌体总蛋白含量的 4 8.5 7%。 Western-印迹结果显示 ,利用纯化包涵体制备的兔抗血清可以很好地识别嗜水气单胞菌产生的天然毒素 。

和厚朴酚对嗜水气单胞菌气溶素表达的抑制作用

为了研究不同浓度和厚朴酚对嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)致病力的影响,筛选抗嗜水气单胞菌感染的天然化合物,通过溶血试验、免疫印记试验、荧光定量PCR试验和动物试验进行了研究。结果发现,和厚朴酚能在亚抑菌浓度下降低嗜水气单胞菌培养物上清中的溶血活性;蛋白免疫印迹试验发现和厚朴酚能降低嗜水气单胞菌气溶素的分泌;荧光定量PCR试验进一步表明和厚朴酚与嗜水气单胞菌共培养后降低了气溶素编码基因aerA的转录而降低气溶素的分泌。此外,通过动物试验发现和厚朴酚治疗能显著提高斑点叉尾鮰(Ictalurus punctatus)嗜水气单胞菌感染模型的存活率。以上研究表明,和厚朴酚能通过降低气溶素编码基因aerA的转录而降低嗜水气单胞菌的致病力,和厚朴酚是一种潜在的新型抗嗜水气单胞菌感染的先导化合物。

人颗粒溶素与小鼠单链IL-12真核共表达质粒的构建及其在RAW264.7细胞中的表达

目的构建人天然颗粒溶素(Granulysin,GLS)和小鼠单链IL-12基因的真核共表达载体pZM02并在RAW264.7细胞中进行表达。方法将人GLS和小鼠单链IL-12基因同时克隆进多启动子真核共表达载体pBudCE4.1中,得到真核共表达质粒pZM02,以pZM02转染小鼠巨噬细胞株RAW264.7,通过RT-PCR、免疫细胞化学和ELISA的方法检测目的基因的表达。结果在转染后的RAW264.7细胞中同时检测到了人GLS和小鼠IL-12的表达。结论人GLS能够与小鼠IL-12在小鼠巨噬细胞株RAW264.7中实现共表达,pZM02的成功构建为进一步研究GLS与IL-12的协同细胞免疫作用机制和免疫治疗作用奠定了基础。

半乳糖凝集素-3、可溶性基质溶素-2检测对心力衰竭诊断的相关性研究

目的:探讨半乳糖凝集素-3和可溶性基质溶素-2(ST2)与慢性心力衰竭分级、传统心力衰竭指标的相关性。方法:选择2014-02至2015-10间在我院心血管内科就诊的慢性心力衰竭患者(慢性心力衰竭组)142例和健康体检人群(正常对照组)85例。按纽约心脏协会(NYHA)心功能分级标准将患者分为Ⅱ级、Ⅲ级、Ⅳ级。入院后完善N末端B型利钠肽原(NT-pro BNP)、高敏C反应蛋白(hs-CRP)、超声形态学等检查,并采用酶联免疫吸附法检测半乳糖凝集素-3、可溶性ST2的表达水平。结果:心力衰竭NYHA心功能Ⅲ级、Ⅳ级患者半乳糖凝集素-3、可溶性ST2明显升高。半乳糖凝集素-3、可溶性ST2与hs-CRP、NT-pro BNP呈正相关,与左心室射血分数呈负相关;可溶性ST2与左心室舒张末期内径(LVEDD)也呈正相关。Logistic分析显示,半乳糖凝集素-3和可溶性ST2与心力衰竭患者近期死亡存在相关性(P<0.05)。半乳糖凝集素-3、可溶性ST2诊断心力衰竭的受试者工作特征曲线(ROC曲线)下面积分别为0.738和0.771,差异有统计学意义(P<0.01)。结论:半乳糖凝集素-3、可溶性ST2与传统心力衰竭指标具有相关性,可用于慢性心力衰竭的诊断。

框镜鲤维氏气单胞菌CY0806株气溶素基因的生物信息学分析及原核表达

为深入研究维氏气单胞菌(Aeromonas veronii)毒力因子气溶素(aerA),本实验从框镜鲤A.veroniiCY0806株中克隆aerA基因,进行同源性分析和构建系统进化树,并进行生物信息学分析、诱导表达和检测。结果表明aerA基因全长1 471 bp,编码490个氨基酸,CY0806株aerA与A.veronii EF620533.1株同源性为95%,与EF620533.1、AB109093.1和ET034117.1在同一分支;推测其相对分子质量约为54.33 ku,理论等电点为5.90,摩尔消光系数为138 810,半衰期为30 h(体外培养的哺乳动物网状细胞),不稳定性系数为31.87,脂肪系数为71.86,总平均疏水性为-0.445;aerA蛋白具有信号肽,不存在跨膜区,二级结构分析表明aerA蛋白结构比较复杂。本研究对aerA基因进行了原核表达,产物具有一定的免疫原性。研究结果为进一步研究A.veronii aerA的功能和诊断、防治奠定基础。

含嗜水气单胞菌气溶素的免疫刺激复合物的制备及其对欧洲鳗的免疫效果

将嗜水气单胞菌气溶素(AerA)基因定向连接到pET32a(+)表达载体,转化大肠杆菌BL21(DE3),SDS-PAGE分析表明,硫氧还蛋白-气溶素融合蛋白(Trx-AerA)表达量占重组菌总蛋白量的65.5%。将上述融合蛋白与商品化的QuilA混合,分别添加Mega-10、卵磷脂、胆固醇获得Trx-AerA ISCOMs。其中同时添加Mega-10、卵磷脂、胆固醇组蛋白回收率最高为10.46%,仅添加QuilA组蛋白回收率为1.82%,两者差异显著(P<0.05)。分别采用Trx-AerA、Trx-AerA ISCOMs、Trx ISCOMs经腹腔注射免疫欧洲鳗,免疫30 d后,每个实验组取5尾实验鱼采集血清,按1∶200稀释通过ELSIA法检测抗体水平,同时采用菌数为2.0×106CFU的嗜水气单胞菌ZN1株进行攻击,测定免疫效力。结果显示:Trx-AerA免疫组相对保护率为0%(3/15),Trx-AerA ISCOMs免疫组为83.3%(13/15),Trx ISCOMs免疫组为50%(9/15);3个免疫组针对气溶素的特异性抗体水平OD450值分别为0.19,0.52,0.36,Trx-AerA ISCOMs免疫组、Trx-AerA免疫组显著高于Trx ISCOMs免疫组(P<0.05)。结果表明影响嗜水气单胞菌免疫效果的除了气溶素的抗体水平外,ISCOMs等也能够增强非特异性免疫保护应答。

颗粒溶素的表达纯化及生物学活性分析

目的:采用原核表达系统对颗粒溶素(granulysin,GNLY)进行体外表达,纯化及活性鉴定。方法:以体外培养的人外周血单个核细胞(PBMC)为模板,RT-PCR扩增编码GNLY的cDNA片段,插入pMD-18-T载体,测序正确后再亚克隆到质粒pET28a(+)中,构建重组表达质粒pET28a(+)-GNLY,转化大肠杆菌BL21(DE3)plysS,IPTG诱导表达融合蛋白,包涵体经变复性后用Ni亲和层析纯化,CFU法测定蛋白活性。结果:成功地将GNLY cDNA片段插入载体pET28a(+)中,构建了表达质粒pET28a(+)-GNLY。经诱导在原核表达系统中以包涵体形式高效表达了相对分子质量为9 000的融合蛋白,变复性纯化后的GNLY蛋白经CFU法检测,发现其具有细胞毒活性且细胞毒作用具有剂量依赖性。结论:本实验利用原核表达系统成功地表达了具有生物学活性的GNLY,为研究其功能、作用机制及临床应用奠定了基础。

嗜水气单胞菌气溶素的纯化及其溶血特性分析

目的用亲和纯化法纯化嗜水气单胞菌气溶素,从单因子水平分析嗜水气单胞菌的溶血特性。方法用嗜水气单胞菌气溶素单克隆抗体McAb3C12B11为配体制备亲和层析柱,甘氨酸洗脱以获得纯化的嗜水气单胞菌ZN1气溶素。获得的纯化气溶素分别与1%欧洲鳗鲡血红细胞、1%兔血红细胞、1%羊血红细胞进行溶血特性分析,并利用单克隆抗体McAb3C12B11进行溶血抑制试验。结果经亲和纯化获得分子量约为51.7kDa的气溶素,该气溶素能在Western-blotting反应中被嗜水气单胞菌ZN1胞外产物(ECPs)免疫血清和McAb3C12B11所识别。溶血试验证实亲和纯化的ZN1气溶素和ZN1ECPs对兔血红细胞、欧洲鳗血红细胞和绵羊血红细胞的溶血效价分别为5.12×104HU/mg、3.20×103HU/mg、6.40×103HU/mg和2.56×104HU/mg、1.28×104HU/mg、3.20×103HU/mg。溶血抑制试验结果表明:当红细胞为1%兔血红细胞时,McAb3C12B11对气溶素和ZN1ECPs的溶血抑制效价均为1∶211;当红血细胞为1%欧洲鳗血红细胞时,McAb3C12B11对气溶素的溶血抑制效价为1∶210,对ZN1ECPs的溶血抑制效价仅为1∶23。结论嗜水气单胞菌气溶素在单因子条件下与嗜水气单胞菌ECPs的溶血特性存在一定的差异,嗜水气单胞菌ZN1ECPs中存在多种溶血性毒素,这些毒素对不同宿主的溶血能力存在差异,同一嗜水气单胞菌菌株对不同的宿主起主要作用的溶血性毒素不同。

铜绿假单胞菌噬菌体PaP1内溶素基因克隆、表达及活性分析

目的构建铜绿假单胞菌噬菌体内溶素重组原核表达载体,检测重组蛋白的酶学活性及抑菌活性。方法利用重组技术将铜绿假单胞菌裂解性噬菌体PaP1内溶素基因构建到表达载体pQE31中,并在大肠杆菌M15(pREP4)中诱导表达,通过非变性方法纯化重组融合蛋白,利用酶谱电泳、抑菌实验等技术检测酶学活性及抑菌活性。结果酶谱电泳方法结果显示重组融合蛋白对铜绿假单胞菌细胞壁肽聚糖有降解作用,抑菌活性检测结果显示重组融合蛋白对金黄色葡萄球菌有一定的抑菌效果。结论该研究从实验方面证实了噬菌体PaP1内溶素基因的生物学功能。

噬菌体及其内溶素的应用研究进展

抗生素的滥用使越来越多的病原菌产生抗药性,因此寻求新的抗菌素已经变得极为迫切。噬菌体以及噬菌体编码的内溶素的发现和应用,为耐药性细菌的治疗和预防开辟了新的途径。文章综述了近几年噬菌体和内溶素的研究进展及其应用。

β-连环素和基质溶素在大肠癌发生发展中的作用

目的 :探讨 β 连环素 (β cat)、基质溶素 (MMP 7)在大肠癌发生、发展中的作用 .方法 :用免疫组织化学法检测早期大肠癌及其相应正常肠黏膜、变性隐窝灶 (ACF)、腺瘤、进展期大肠癌中β cat和MMP 7的表达 .结果 :在腺瘤、早期大肠癌、进展期大肠癌中出现 β cat细胞膜表达减少 ,细胞质和 /或细胞核阳性着色等异位表达 ,MMP 7细胞质阳性表达 .由正常肠黏膜、ACF、早期大肠癌、腺瘤至进展期大肠癌 β cat在细胞膜表达呈下降趋势 (P <0 .0 5 ) ;在细胞质或细胞核表达及MMP 7阳性率呈上升趋势 (P <0 .0 5 ) .早期大肠癌中随着肿瘤细胞分化程度的降低 ,β cat在细胞膜表达逐渐减少(P <0 .0 5 ) ,细胞质或核β cat表达及MMP 7呈阳性表达与细胞分化程度无关联 (P >0 .0 5 ) .β cat异常表达及MMP 7阳性表达与早期大肠癌浸润深度和转移相关 (P <0 .0 5 ) .早期大肠癌中MMP 7表达与β cat在细胞膜表达不相关 (P >0 .0 5 ) ,而在细胞质、细胞核表达率MMP 7阳性组高于阴性组(P <0 .0 5 ) .结论 :β cat,MMP 7参与大肠癌的发生、浸润和转移 .

人颗粒溶素活性肽与小鼠白细胞介素-12共表达质粒的构建与真核表达

目的构建能分泌表达相对分子质量为9000的人颗粒溶素活性肽与小鼠白细胞介素-12(mIL-12)的真核共表达质粒,并检测其蛋白表达。方法以含有颗粒溶素cDNA序列的质粒为模板,通过PCR扩增获得相对分子质量为9000的颗粒溶素活性肽基因片段后,定向插入真核表达载体pBudCE4.1中,获得重组表达质粒pBudCE4.1-S9K,经双酶切及插入片段序列测定对质粒进行鉴定。同时,将小鼠IL-12亚克隆入pBudCE4.1另一多克隆位点,构建真核共表达质粒pBudCE4.1-S9K/mIL-12。采用RT-PCR、免疫细胞化学与Dot-ELISA法,检测颗粒溶素活性肽在RAW264.7细胞的瞬时表达与分泌。ELISA检测mIL-12的表达。结果酶切、PCR及测序鉴定证实,颗粒溶素活性肽基因插入片段正确;RT-PCR和免疫细胞化学检测表明其可以在细胞中瞬时表达;Dot-ELISA检测表明颗粒溶素可分泌到细胞外。ELISA检测细胞培养上清有mIL-12表达。结论已成功构建真核表达质粒pBudCE4.1-S9K/mIL-12,并能体外表达,为下一步利用颗粒溶素与mIL-12基因治疗肿瘤奠定了基础。