五带虻溶纤活性蛋白的纯化和性质

五带虻ＴａｂａｎｕｓｑｕｉｎｑｕｅｃｉｎｃｔｕｓＲｉｃａｒｄｏ腹部匀浆液经硫酸铵沉淀、ＳｅｐｈａｄｅｘＧ－７５凝胶层析、Ｆｉｂｒｉｎ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ亲和层析和电泳制备等方法纯化后，获得在ＳＤＳ－ＰＡＧＥ图谱上呈现单一区带的溶纤活性蛋白。该蛋白质既具有纤溶酶作用，又具有激活纤溶酶原的作用，其分子量为４０ｋＤ，等电点为４．５，最适作用ｐＨ为９．０，最适作用温度为２８℃，３７℃处理２ｈ活性完全丧失，Ｃａ２＋、Ｍｎ２＋、Ｃｕ２＋、Ｚｎ２＋、Ｈｇ２＋和ＰＭＳＦ能抑制其活性。

华广虻(Tabanusamaenus Walker)溶纤活性蛋白的纯化及生物活性分析

经过 ７５％ 饱和度硫酸铵沉淀、 Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ７５ 凝胶过滤层析、 Ｌｙｓ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４ Ｂ 亲和层析和电泳制备洗脱，从华广虻（ Ｔａｂａｎｕｓ ａｍ ａｅｎｕｓ Ｗ ａｌｋｅｒ）腹部组织匀浆液中分离纯化出分子量约为 ６７ｋ Ｄ 的溶纤活性蛋白 Ｔ Ａ Ｆ Ｐ经纤维蛋白平板测定表明， Ｔ Ａ Ｆ Ｐ 只具有纤溶酶作用，不具有激活纤溶酶原的作用；但 Ｔ Ａ Ｆ Ｐ 能分解纤溶酶原激活剂的生色底物—— Ｃｈｒｏｍ ｏｚｙｍ Ｕ Ｋ 及 Ｓ２２８８还能水解胰蛋白酶专一底物 Ｂｚ Ｐｈｅ Ｖａｌ Ａｒｇ Ｎ Ａ 及 Ｃ Ｂ Ｚ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ａｒｇ Ｎ Ａ，表明 Ｔ Ａ Ｆ Ｐ具有类胰蛋白酶活性，专一水解精氨酸形成的酰胺键（或肽键） Ｔ Ａ Ｆ Ｐ无胰凝乳蛋白酶活性

华广虻溶纤活性蛋白(TAFP)的性质和对大鼠血液流变学的影响

华广虻溶纤活性蛋白 (TAFP)经血纤蛋白平板法和试管凝块法测定表明 ,TAFP只具有纤溶酶作用 ,不具有激活纤溶酶原的作用 .TAFP的最适 p H为 7.5,且在 p H为 6.0时最稳定 .蛋白水解酶抑制剂对 TAFP的抑制作用显示 :STI>antipain>SBBI>antitrypsin>TLCK>leupeptin>bacteracin>PMSF>TPCK,金属蛋白酶抑制剂 1 ,1 0 - phenanthroline对 TAFP没有抑制作用 .TAFP能显著的延长大鼠出血时间、抑制血小板聚集性 ;显著降低血浆中血纤蛋白原含量、全血粘度、血浆粘度、红细胞压积 ;

少棘蜈蚣纤溶活性蛋白的抗血栓作用

目的研究少棘蜈蚣(Scolopendra subspinipes mutilans L.Koch)纤溶活性蛋白的抗血栓作用。方法采用离子交换层析和分子筛等制备法从少棘蜈蚣中纯化到蜈蚣纤溶酶(Scolopendra subspinipes mutilans L.Koch fibrinolyti cenzyme,SSFE),用纤维蛋白平板检测酶活力,常规方法检测了SSFE溶血性和出血性,进行了SSFE体外溶栓和体内溶栓实验,并检测了凝血酶原时间(PT)、活化部分凝血酶时间(APTT)和凝血酶时间(TT)3个标准化指标。结果PAGE显示SSFE为单一组分,具有纤溶活性;证明SSFE无致出血性且无致溶血活性,低、中、高剂量SSFE使小鼠APTT和TT均明显延长,中剂量SSFE对PT有延长作用,而高剂量作用不明显。结论蜈蚣纤溶酶具有抗血栓作用。

地鳖纤溶活性蛋白(EFP)的分离纯化、红外光谱分析及抑制鸡胚尿囊膜(CAM)血管生成研究

以传统中药材地鳖为原料,采用匀浆、盐析、硫酸铵分段沉淀、透析和DEAE-52纤维素离子层析等纯化方法,从其体内分离纯化得到一种纤溶活性蛋白(Fibrinolyric protein of Eupolyphaga sinensis Walker,EFP),采用SDS-PAGE电泳法对该蛋白进行了分子量和纯度测定,结果表明,从地鳖中提取纯化的EFP为相对分子量为41300的单一成分,具有明显的纤溶活性,由蛋白质和糖的红外光谱特征吸收峰可推断EFP为一种糖蛋白.EFP对鸡胚尿囊膜新生血管生成有良好的抑制作用,比阳性对照组(地塞米松组)对鸡胚生长发育影响要小.地鳖虫纤溶活性蛋白组分具有抑制血管生成的作用,有可能用于肿瘤治疗.

地鳖纤溶活性蛋白对H22荷瘤小鼠的抑瘤作用

目的探讨地鳖纤溶活性蛋白(fibrinolytic protein from Eupolyphaga sinensis Walker,EFP)对H22荷瘤小鼠的抑瘤功效。方法采用水提取法对地鳖进行成分分离;皮下接种肿瘤细胞建立荷瘤小鼠动物模型;灌胃和皮下注射法观察EFP的抑瘤作用;ELISA法检测血清抗H22抗体水平;记录各组体重变化、脾脏和胸腺等免疫器官的器官系数,检测肝脏丙二醛(MDA)水平、肝脏超氧化物歧化酶(SOD)活性、肝脏谷丙转氨酶(GPT)和谷草转氨酶(GOT)以及血清谷丙转氨酶(GPT)活力等生理生化指标。结果EFP具有明显的抑瘤活性。经EFP灌胃和皮下注射后的荷瘤小鼠,与对照组荷瘤小鼠相比其胸腺指数、脾指数明显增加;抗H22抗体水平以及MDA、SOD、GPT、GOT活性明显增加;肿瘤生长缓慢。结论EFP是地鳖抗肿瘤作用的主要有效成分,EFP在动物体内具有抗肿瘤作用,能通过增强荷瘤小鼠参与免疫抗体以及相关酶的活性而发挥抗肿瘤作用。

地鳖纤溶活性蛋白的纯化及性质研究

通过硫酸铵分段沉淀、DEAE-纤维素柱和SephadexG-75柱层析从雌地鳖(Eupolyphagesinensiswalker)体内分离纯化到一种相对分子质量约为41.3kD的纤溶活性蛋白,纤维蛋白平板测定表明,该蛋白具有纤溶作用,经SDS-PAGE电泳显示为一条带,含糖量为10.5%。其水解纤维蛋白的比活力为547.86u/mg。该成分受蛋白抑制剂和丝氨酸蛋白酶抑制剂PMSF的抑制,但EDTA对其影响不大,提示该成分属于丝氨酸蛋白酶类。该成分在40℃下基本稳定,最适温度40℃,最适pH为8.0,其激活纤维蛋白溶解酶(PLG)的机制与尿激酶(UK)有一定区别。推测其可能是一种新的地鳖纤溶酶组分。

地鳖纤溶活性蛋白对荷瘤小鼠肿瘤微血管密度及血管内皮细胞生长因子表达的影响

目的:研究地鳖纤溶活性蛋白(EFP)对H22和S180荷瘤小鼠肿瘤组织微血管密度(MVD)及血液中血管内皮细胞生长因子(VEGF)的影响,以判定EFP是否具有抗肿瘤新生血管生成作用。方法:建立H22荷瘤小鼠动物模型,采用免疫组化方法标记CD34,检测了EFP对小鼠H22和S180肿瘤组织MVD的作用情况,采用双抗体夹心ELISA法检测H22和S180荷瘤小鼠血清中VEGF含量。结果:与对照组相比,EFP可显著降低MVD及VEGF的表达。结论:EFP有抑制肿瘤新生血管形成的作用。

地鳖虫纤溶活性蛋白组分抑制肿瘤作用研究

目的地鳖虫纤溶活性蛋白组分对体内外肿瘤的抑制作用。方法用MTT法、流式细胞术和AnnexinV-FITC/PI双荧光染色分别检测地鳖虫纤溶活性蛋白组分对体外培养的Hela细胞增殖、细胞周期及凋亡情况的影响;用S180荷瘤小鼠检测地鳖虫纤溶活性蛋白组分的体内抑瘤作用。结果地鳖虫纤溶活性蛋白组分对体外培养的Hela细胞具有抑制细胞增殖、改变细胞周期并能诱导细胞凋亡的作用,对S180荷瘤小鼠具有抑瘤作用。结论地鳖虫纤溶活性蛋白组分具有一定的抑制肿瘤作用。

地鳖纤溶活性蛋白对S180和H22荷瘤小鼠肿瘤的抑制及诱导细胞凋亡作用

目的研究地鳖虫纤溶活性蛋白(fibrinolytic proteinsof Eupolyphaga sinensis,EFP)对肿瘤细胞凋亡的诱导作用及其机制。方法采用纤溶平板法检测了EFP纤溶活性;采用流式细胞术检测了EFP高、中、低浓度对小鼠S180和H22实体瘤组织细胞凋亡的诱导作用;采用免疫组织化学法检测了Caspase-3的表达;采用TRAP-PCR银染法检测了腹水瘤组织端粒酶活性。结果 EFP对S180和H22实体瘤有一定的抑瘤作用,对H22和S180腹水瘤细胞端粒酶活性有一定降低作用,可提高Caspase-3表达水平,诱导细胞凋亡。结论 EFP具有诱导S180和H22肿瘤细胞凋亡作用。

链霉菌C-3662产生的纤溶活性蛋白酶的纯化与理化性质

从链霉菌 C- 3662发酵上清液中 ,通过硫酸铵沉淀 ,CM- Sepharose Fast Flow和 Phenyl-Sepharose Fast Flow等层析色谱 ,分离纯化得到了具有纤溶活性的蛋白酶 CGW- 3,反向 HPLC鉴定纯度为 90 % ;每立升发酵上清液可得到 8mg纯品 ,活性回收率 46% ,CGW- 3为一单肽链蛋白 ,分子量 2 2 72 1 ,对丝氨酸蛋白酶抑制剂 PMSF敏感 ,对 EDTA不敏感 ;其 N端 1 5个氨基酸的顺序为 VVGGTRAAQGEFPFM,与微生物来源的胰蛋白酶类丝氨酸蛋白酶有较高的同源性 . CGW- 3的等电点 p I9.0 ,纤溶活性的最适 p H为 7.5～ 8.0 ,对温度比较敏感 .CGW- 3不仅具有直接降解纤维蛋白作用 。

地鳖虫纤溶活性蛋白组分抑制血管的生成

从地鳖虫(Eupolyphaga sinesisWalke)中分离纯化出纤溶活性蛋白组分———地鳖虫纤溶活性蛋白(Fibrinolyric protein ofEupolyphage sinesis,EFP),研究其对血管生成的抑制作用。以新鲜地鳖虫为原料,采用硫酸铵分段盐析,经DEAE-纤维素和SephadexG-75柱等方法分离纯化EFP,用不同浓度的EFP作用于人微血管内皮细胞(MVEC),用MTT法测定EFP对MVEC增殖的影响,用单细胞凝胶电泳和AnnexinV-FITC/PI双荧光染色观察细胞凋亡情况,采用流式细胞术检测EFP对MVEC细胞周期的影响,并采用鸡胚绒毛尿囊膜的新生血管模拟肿瘤的新生血管,检测EFP对鸡胚尿囊膜(CAM)血管生成的作用。结果表明:1)MTT法测得EFP可抑制MVEC细胞增殖,增殖抑制率达46%;2)EFP可诱导MVEC细胞凋亡,且成剂量依赖关系,用单细胞凝胶电泳法检测细胞凋亡,随着EFP浓度的增大,拖尾细胞增多;用AnnexinV-FITC/PI进行双荧光染色发现,当EFP处理浓度达2μg/ml时,出现了大量凋亡晚期细胞;3)EFP可干扰MVEC的细胞周期,出现S期和G2/M期阻滞;4)用鸡胚尿囊膜实验观察到EFP剂量为0.06mg/egg即可抑制鸡胚尿囊膜血管生成,最高抑制率可达35.8%。提示地鳖虫纤溶活性蛋白组分具有抑制血管生成的作用。

福寿螺纤溶活性蛋白的纯化及性质研究

通过硫酸铵分段沉淀、DEAE-32纤维素柱和SephadexG-75柱层析,从福寿螺(Ampullarum crossean)体内分离纯化出一种相对分子质量约为40kDa的纤溶活性蛋白,紫外光谱法测定表明,该蛋白具有纤溶作用,经SDS-PAGE电泳显示为一条带。研究表明,该蛋白作用最适pH为8.0,最适温度为59℃,热稳定性较好,金属离子Na+对酶的活力无影响,而K+、Mg2+、Ca2+可提高此蛋白酶的活力。采用平板法测定此蛋白酶的血纤维蛋白溶解活性,证明此酶具有强烈的纤溶活性。

土鳖虫纤溶活性蛋白抗小鼠血栓形成作用研究

目的:研究土鳖虫纤溶活性蛋白的抗凝、纤溶和抗血栓形成作用。方法:小鼠灌胃土鳖虫纤溶活性蛋白后,取血浆测定白陶土部分凝血活酶时间(KPTT)、凝血酶时间(TT)和凝血酶原时间(PT),测定组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)和其抑制物(PAI)的活性;用角叉菜胶诱发小鼠体内血栓形成,测量尾部血栓形成的长度。结果:土鳖虫纤溶活性蛋白能够显著延长小鼠TT,使t-PA活性增强,同时抑制PAI的活性,显著抑制角叉菜胶所致的尾部血栓形成。结论:土鳖虫纤溶活性蛋白能部分抑制凝血途径,激活纤溶系统,抑制血栓形成。

黄粉虫纤溶活性蛋白酶(TFP)酶学性质以及红外光谱分析

目的研究黄粉虫纤溶活性蛋白(Tenebrio Fibrinolyric Proteins,TFP)的酶学性质及对其进行分类。方法以BAEE、BAPNA和酪蛋白为底物分别测TFP的Km值;分别研究PMSF和胰蛋白酶对TFP活性的影响。结果以BAEE和BAPNA为TFP底物,Km值分别为0.182 mmol/L和1.138 mmol/L,表明TFP与BAEE亲和力最好,酯酶活力>酰胺酶活力>肽键酶活力。丝氨酸蛋白酶抑制剂PMSF能有效抑制TFP活性,而偏弱碱性环境下胰蛋白酶未降解TFP,胰蛋白酶与TFP红外结构图谱相似,可以初步证明TFP属于丝氨酸蛋白酶。结论黄粉虫纤溶活性蛋白酶的酯酶活力最好,属于丝氨酸蛋白酶。

黄黑小斑蝥纤溶活性蛋白分离纯化及性质研究

目的以药用斑蝥(Mylabris)为原料,从其中分离纯化得到一种具有纤溶性的蛋白MFP(Fibrinolyric Protein of Myla-bris)。方法采用硫酸铵分段盐分、透析和DEAE-32纤维素离子交换层析等纯化方法进行分离纯化,SDS-PAGE电泳测定其分子量,纤维蛋白平板法测定其纤溶活性。结果该目的蛋白相对分子质量约为95.5 kD,其水解纤维蛋白的相对比活力为14.7 u/mg;该成分在35℃下最稳定,65℃及以上活性丧失,金属离子K+,Na+对其活力无影响,Mn2+,Ca2+对其有明显抑制作用,最适pH为6.0。结论研究分离出的斑蝥活性蛋白确为一种具有纤溶性的蛋白组分,并证明其纤溶作用机理为纤溶酶原激活;体外溶栓实验表明,其对血栓的溶解具有一定作用;溶血实验结果表明,该纤溶活性蛋白溶液无溶血反应。

地鳖虫纤溶活性蛋白cDNA序列克隆与毕赤酵母表达

依据已报道的地鳖虫成熟肽cDNA序列设计引物,通过RT-PCR法从地鳖虫(Eupolyphage sinensis Walker)中克隆得到675bp地鳖虫纤溶活性蛋白(fibrinolytic protein,EFP)成熟肽编码序列。将此片段克隆到表达载体pPICZα-A中,转化毕赤酵母GS115,甲醇诱导表达得到重组表达蛋白,经SDS-PAGE电泳和活性鉴定,表明重组EFP在毕赤酵母中均获得表达,重组表达蛋白相对分子质量为28.2kD,表达产物分子质量与理论分子质量相符。重组蛋白在毕赤酵母中以分泌形式表达,具有纤溶活性。

地鳖纤溶活性蛋白含药血清对人肺癌A549细胞凋亡及凋亡相关表达的影响

目的研究地鳖纤溶活性蛋白(EFP)含药血清对人肺癌A549细胞凋亡的影响及凋亡相关基因的表达。方法制备不同浓度EFP小鼠含药血清;采用MTT法检测EFP对A549细胞的增殖抑制效果;采用Annexin V-FITC/PI双荧光染色观察细胞凋亡情况;应用流式细胞术检测EFP对A549细胞周期的影响;采用免疫组化法检测凋亡相关基因Bax表达水平的改变。结果 EFP含药血清各组对A549细胞有明显抑制作用;EFP使A549细胞发生细胞凋亡,细胞周期发生改变;随着药物浓度的增加,Bax表达逐渐增强,Bcl-2表达逐渐减弱。结论 EFP有较强的体外抗肿瘤活性;EFP可能通过调控Bcl-2,Bax基因表达而诱导凋亡。

黄粉虫纤溶活性蛋白免疫原性与抗血栓作用的研究

为了研究黄粉虫纤溶活性蛋白(Tenebrio Fibrinolytic Proteins,TFP)的免疫原性及其抗血栓作用,本研究将纯化的TFP经皮下注射免疫小鼠,间接ELISA法检测小鼠血清中的抗体含量及抗体效价;小鼠灌胃TFP后,取血浆检测凝血酶时间(thrombin time,TT)、凝血酶原时间(prothrombin time,PT)、活化部分凝血活酶时间(activated partial thromboplastin time,APTT)、组织型纤溶酶原激活剂(tissue-type plasminogen activator,t-PA)和其抑制物(plasminogen activator inhibitor,PAI),角叉菜胶使小鼠尾部形成血栓,测量血栓形成长度.结果显示,TFP免疫小鼠后产生特异性抗体且随着免疫次数的增加,抗体含量逐渐升高,末次免疫后产生的抗体效价为1∶640;TFP可以显著延长TT,增强t-PA的活性,抑制PAI的活性,同时显著抑制由角叉菜胶引起的小鼠尾部血栓的形成.这说明TFP具有良好的免疫原性且具有一定的抗血栓作用.

蚁狮纤溶活性蛋白的发现及理化研究

本实验采用硫酸铵分段盐析法分离和提取得到了具有纤溶活性的蚁狮粗蛋白,使用纤维平板法检测目标蛋白纤溶活性,结果显示三个不同浓度梯度的粗蛋白均具有明显的纤溶活性;测得其最适温度为37℃,最适pH值约为6.0;金属离子Ba^2+、Cu^2+、Mg^2+、Mn^2+对蚁狮纤溶活性蛋白具有较强的抑制作用,Na^+对其抑制作用较小;抑制剂EGTA对粗蛋白抑制率较高,βME对其影响较小;使用BCA试剂盒测定蚁狮纤溶活性粗蛋白浓度为4mg/mL左右。