昆虫溶茧酶基因的初步鉴定与演化分析

溶茧酶(cocoonase)是研究昆虫演化及其生理适应性的重要酶类。通过The MEME Suite分析得到4条昆虫溶茧酶特征基序,利用HMMER和BLAST程序分析了105种昆虫的溶茧酶基因分布情况,但是仅在36种鳞翅目昆虫中鉴定到了溶茧酶的编码基因,特别是在蛱蝶科(如袖蝶等)昆虫里有明显的扩增条带。进一步通过Gromacs软件初步模拟溶茧酶及其相似的胰蛋白酶在家蚕唾液中的活性与稳定性,结果发现溶茧酶的最终能量更低,表明其更适应家蚕吐出液环境。以上鉴定与分析结果为进一步研究昆虫溶茧酶的演化模式和生理功能积累了一定的基础信息。

家蚕蛾溶茧酶分泌器官及蛾吐出液的研究

家蚕蛾溶茧酶可能来源于下颚、嗉囊和中肠,嗉囊是否具有分泌溶茧酶的能力至今缺乏直接的证据。分别用光学显微镜和透射电镜观察了家蚕蛾下颚、嗉囊和中肠的组织结构,发现嗉囊不具备分泌器官的形态特征,是由薄的膜围成的囊状结构,没有观察到分泌细胞及其分泌物;而下颚和中肠具有分泌细胞,存在大量的分泌物质。对蛾吐出液进行酶活性检测,发现蛾吐出液除具有酯酶活力外,还具有纤溶酶活力。分别对下颚、嗉囊和中肠的组织蛋白作酯酶活力和纤溶酶活力测定,发现嗉囊组织蛋白不具有这两种酶活力,而下颚和中肠的组织蛋白具有较强的酯酶和纤溶酶活力。以上实验结果表明:家蚕蛾溶茧酶的来源不是嗉囊,溶茧酶可能来源于下颚和中肠。

蚕蛾溶茧酶的研究进展

溶茧酶是蚕蛾在羽化的过程中分泌的一种酶,其作用是软化和溶解茧层以便使蚕蛾从茧里出来。据目前研究所知,蚕蛾羽化时,是由多个器官合成分泌的溶茧酶共同起作用的。本文从蚕蛾吐出液的研究,溶茧酶的来源、生理生化特征、基因克隆以及开发应用等方面综述了溶茧酶的研究进展。

斑点免疫印迹法快速测定4品种家蚕蛾下颚溶茧酶含量

目的:测定4品种家蚕蛾下颚溶茧酶含量,并建立斑点免疫印迹法在中药材药效成分含量的测定方法。方法:以兔抗溶茧酶多抗为一抗,应用斑点免疫印迹法对4品种家蚕蛾下颚溶茧酶含量作定性检测,杂交信号应用Quantity one软件作定量分析。结果:4品种家蚕蛾下颚的个体溶茧酶平均含量分别为6.41、8.09、7.62、1.88μg/头。结论:不同品种家蚕蛾间下颚溶茧酶含量差异显著。斑点免疫印迹法简便快捷,结果准确,无需大型设备,可用于类似中药材药效物质的含量测定与品质评价。

家蚕溶茧酶基因的真核表达及其产物的生物活性检测

为了研究家蚕Bombyxmori溶茧酶基因(cocoonae)真核表达及其产物的生物活性,将溶茧酶基因(GenBank登录号EF428980)克隆至杆状病毒转移载体pFastBacTM1中获得pFast-cocoonase,将其转化DH10Bac感受态细胞后,PCR方法检测证实所分离的重组病毒DNA中含有目的片段溶茧酶基因。用脂质体法转染家蚕BmN细胞,获得重组病毒。SDS-PAGE分析显示,感染重组杆状病毒Bac-cocoonase的细胞表达产物在约为27.6kD处出现特异性条带,这与预测的蛋白大小相符。用该表达产物与茧丝反应后,电镜下观察茧丝的形态,结果表明表达产物对茧丝的丝胶层有一定的水解作用。

家蚕溶茧酶基因的克隆、序列分析及原核表达

【目的】获得家蚕溶茧酶基因的全长序列,实现溶茧酶基因在大肠杆菌中的融合表达。【方法】利用cDNA末端扩增技术(RLM-RACE)克隆了家蚕溶茧酶基因cDNA序列(GenBank登录号:EF428980)。【结果】家蚕溶茧酶基因cDNA序列全长1047bp,其中780bp的蛋白质编码区可编码260个氨基酸,预测蛋白质分子量为27.6kD,等电点(pI)为8.89。家蚕溶茧酶基因包含4个内含子。用Signal P3.0Server程序分析家蚕溶茧酶基因,预测其从第1～22位为信号肽序列。SMART分析结果预测其第34～254位氨基酸序列具有类胰蛋白的丝氨酸蛋白酶活性。重组质粒pET-32a-Cocoonase转化E.coli BL21进行原核表达,SDS-PAGE分析结果表明,家蚕溶茧酶基因以融合蛋白形式表达,相对分子量为48kD。【结论】本研究成功地克隆、表达了家蚕溶茧酶基因,分析和预测了它的结构和功能,为其进一步的生物学功能研究及其应用奠定了基础。

家蚕蛾吐出液溶茧酶的溶栓作用研究

利用CM-Sepharose Fast Flow弱阳离子交换层析从家蚕蛾吐出液中收集得到溶茧酶。通过精氨酸酯酶活力测定其酶活力为11.92 U/mg,利用纤维蛋白原降解试验和纤维蛋白平板试验初步验证其具有溶栓作用。小鼠腹部皮肤皮内注射家蚕蛾吐出液溶茧酶试验发现,当每公斤体质量注射的酶剂量为0.25μg/μL时,开始出现溶血;在小鼠体内溶栓试验中,每公斤小鼠体质量注射家蚕蛾吐出液溶茧酶的剂量分别为0(对照)、100、200、300、400μg时,48 h后小鼠尾部血栓比例呈逐渐减小的趋势,去除率分别为(5.00±0.41)%、(16.67±0.21)%、(37.97±0.74)%、(49.15±0.65)%、(74.67±0.62)%。

家蚕溶茧酶收集方法的建立及活性测定

对家蚕溶茧酶的收集、活性测定进行了研究。结果表明,不同的环境条件会影响蚕蛾的羽化率和家蚕溶茧酶的质量。家蚕溶茧酶具有精氨酸酯酶的活力,酶活力大小与其吐出液的颜色深浅有关。

僵蚕溶茧酶抑制剂的纯化与抗肿瘤活性研究

目的分离纯化僵蚕溶茧酶抑制剂(Jiangcan cocoonase inhibitor,JCCI),研究其体内外对人肝癌SMCC-7721细胞增殖的抑制活性。方法依次应用以家蚕溶茧酶为配体的亲和色谱、Sephadex G-50凝胶过滤色谱、Superdex 75快速蛋白液相色谱(fast protein liquid chromatography,FPLC),从僵蚕粗蛋白提取物的85%硫酸铵沉淀物中分离纯化JCCI。以Edman降解法测其N端氨基酸序列。应用MTT法与荷瘤裸鼠模型,检测其体内外抑制SMCC-7721细胞增殖与生长活性。结果JCCI相对分子质量为13973.63,其N端前10个氨基酸序列为VRNKRQSNDD。抑制剂动力学分析结果表明,JCCI是溶茧酶的非竞争性抑制剂,米氏常数(Km)平均值为76.50,二者物质的量之比为1∶1。JCCI可显著抑制SMCC-7721肝癌细胞体外增殖与体内荷瘤裸鼠的肿瘤生长,体外给药36 h的半数抑制浓度(median inhibition concentration,IC_(50))为260.52μg/mL,JCCI抑制率与剂量线性相关。结论JCCI是一种首次从僵蚕中分离纯化的具有抗肿瘤活性的丝氨酸蛋白酶抑制剂。

代方银教授课题组揭示“破茧成蝶”的遗传基础及其应用

2020年9月28日,遗传学领域国际著名期刊《PLoS Genetics》在线发表代方银教授课题组的研究论文“Cocoonase is indispensable for Lepidoptera insects breaking the sealed cocoon”。该项研究揭示了溶茧酶基因对于鳞翅目结茧昆虫的生物学意义与其在家蚕种质创制中的应用。