人源类溶菌酶蛋白4的多克隆抗体制备及其表达分析

目的:以原核表达的人源类溶菌酶蛋白4(LYZL4)为免疫原制备多克隆抗体,检测LYZL4在睾丸组织中的定位,为阐明其生理功能提供依据。方法:将LYZL4编码基因克隆于原核表达载体pET32a,IPTG诱导重组LYZL4(r LYZL4)表达。分别使用Ni-NTA树脂和甲壳素亲和层析纯化rLYZL4,采用双层琼脂平板扩散法检测杀菌活性。以Ni-NTA树脂纯化产物为免疫原制备兔抗rLYZL4多克隆抗体,通过ELISA测定抗体效价,Western印迹检测抗体特异性后,检测LYZL4蛋白在人体各组织的分布及其在精子和精浆中存在情况,免疫组化确认LYZL4在人睾丸组织中的定位。结果:原核表达系统可有效表达rLYZL4,其对溶壁微球菌及大肠杆菌无杀灭活性。制备的兔抗rLYZL4多克隆抗体具有很高的效价和特异性,在睾丸、附睾及人精子蛋白提取物中可检测到LYZL4存在,在生精小管中,LYZL4定位于圆形精子细胞及长形精子细胞的顶体上。结论:本研究成功以原核表达的rLYZL4制备了该蛋白的多克隆抗体,确认LYZL4在睾丸和附睾有表达,并定位于精子顶体上,提示其可能与顶体结构或功能相关。

人源类溶菌酶蛋白6在男性生殖系统中的表达

目的:检测人源类溶菌酶蛋白6(LYZL6)在男性生殖系统中的表达情况,以揭示其可能的生理功能。方法:将整合LYZL6编码基因的毕赤酵母菌株进行高密度培养,甲醇诱导表达后甲壳素亲和色谱纯化。采用双层琼脂平板扩散法观察重组LYZL6的杀菌活性。以纯化的重组蛋白为免疫原制备兔抗LYZL6多克隆抗体,ELISA检测抗体效价。通过Western印迹检测LYZL6蛋白在人各组织及精液中的分布,并采用免疫组化法确认LYZL6在人睾丸中的表达情况。结果:在低p H条件下重组LYZL6对溶壁微球菌杀菌活性较高。以重组LYZL6为免疫原制备的抗体具有高效价,Western印迹检测表明LYZL6仅在睾丸和附睾中表达,且睾丸表达水平较高。在人精子蛋白提取物中检测到了LYZL6,精浆中并未检测到明显蛋白条带。免疫组化检测显示在睾丸组织中,LYZL6定位于晚期精母细胞及圆形精子细胞。结论:在低p H条件下,重组LYZL6具有较强的溶解细菌细胞壁的能力;LYZL6被睾丸上皮分泌后结合于精子上,提示LYZL6有可能在精卵融合过程的某个环节发挥作用。

人源类溶菌酶蛋白4在受精过程中的作用及酶学性质研究

目的:对人源类溶菌酶蛋白4(LYZL4)在受精过程中的作用和重组蛋白的酶学性质进行研究,从而揭示LYZL4的生理功能。方法:细胞免疫荧光法检测LYZL4在精子细胞上的亚细胞定位,RT-PCR分析精子表面LYZL4的来源,通过精子穿透试验分析LYZL4在受精过程中的作用。构建真核重组表达载体p PIC9K-LYZL4,转化毕赤酵母GS115菌株后,甲醇诱导表达;甲壳素亲和层析和凝胶过滤层析从发酵上清中纯化重组LYZL4蛋白(rLYZL4),通过Western印迹进行验证。ELISA测定rLYZL4的透明质酸结合能力,分光光度法测定rLYZL4的胞壁质酶活性、透明质酸酶活性和自由基清除能力。结果:LYZL4免疫荧光定位于成熟精子头部的顶体膜上,RTPCR检测表明精子表面的LYZL4蛋白来源于睾丸和附睾的分泌,兔抗LYZL4多克隆抗体可明显抑制精卵结合。毕赤酵母表达系统成功表达了rLYZL4,酶活性分析显示rLYZL4无胞壁质酶和透明质酸酶活性,但能够结合透明质酸,并具有较强的自由基清除能力。结论:LYZL4由睾丸和附睾分泌后定位于成熟精子头部的顶体膜上,可在精卵结合过程中发挥作用,其还能够结合透明质酸并清除自由基,提示LYZL4可能作为一种多功能分子在精子保护及精卵结合过程中发挥作用。

母乳中溶菌酶浓度的测定

对23例第一胎产妇的母乳进行动态测定溶菌酶浓度,共117次。并在产后每周取奶一次共4次进行观察,测定结果均值及各受试者之间母乳中溶菌酶含量均有显著差异,P<0.01其平均值在一周内逐日上升,以产后第六天为最高,在国内首次证实初乳中有高浓度的溶菌酶。它和母乳中其它的防御因子一样,对婴儿的健康发育是有着重要意义。

喉癌组织间质中巨噬细胞内溶菌酶的活性研究

为探讨溶菌酶(lysozyme,LZM)对喉癌的抗肿瘤作用,应用免疫组化技术对喉癌患者的癌组织石蜡切片中 LZM 分布进行观测,结果表明:LZM 在巨噬细胞(macrophage,M(?))内呈阳性反应,溶菌酶阳性巨噬细胞(lysozyme positive macrophage,LPM)主要分布在喉癌间质,喉癌间质 LPM成簇分布区常伴大量淋巴细胞浸润;癌组织中 LPM 数目高于手术切端(P<0.01)。随病变范围的扩大,LPM 的数目呈现下降趋势,无颈淋巴结转移者癌组织 LPM 数目高于颈淋巴结转移者(P<0.01)。提示喉癌局部浸润的 LPM 多少与喉癌的发展、转移密切相关;LZM 在 LPM 抗肿瘤过程中起重要作用,它能促进癌间质网状结构破坏,使抗肿瘤细咆易于向肿瘤组织浸润,共同发挥抗肿瘤作用。

人源类溶菌酶蛋白6在毕赤酵母中的重组表达及活性分析

利用毕赤酵母(Pichia pastoris)重组表达人源类溶菌酶蛋白6(human lysozyme-like protein6,h Lyzl6),对其酶学性质进行分析。根据毕赤酵母密码子偏爱性设计并人工合成h Lyzl6基因,将其连接至含有乙醇氧化酶启动子(AOX1)的p PIC9K质粒构建重组表达载体p PIC9K-hlyzl6;重组表达载体经线性化后电转化入毕赤酵母GS115感受态细胞,经G418筛选获得高拷贝重组菌株后进行甲醇诱导表达。经甲醇诱导72 h后发酵液上清中酶活性达到最高值,发酵液上清经SDSPAGE检测在14.8 k Da处有重组h Lyzl6蛋白条带,分子量符合预期,通过甲壳素亲和层析可对其进行纯化;采用比浊法测定h Lyzl6酶学活性,结果表明h Lyzl6对溶壁微球菌(Micrococcus lysodeikticus)有较好的杀灭作用,最适反应温度为40℃,最适p H为5.5,其酶活力为54 700U/mg,Cu2+对其活性有明显抑制,EC50为30.2799 mg/L。采用基因工程方法首次在毕赤酵母GS115成功表达了重组h Lyzl6,证实其在体外具有杀菌活性,初步揭示h Lyzl6在男性生殖系统先天性免疫中发挥了一定作用,为进一步研究h Lyzl6的功能和应用开发奠定了基础。

人源类溶菌酶蛋白6的功能研究及生理特性分析

对人源类溶菌酶蛋白6（human lysozyme-like protein 6,LYZL6）在受精过程中的作用进行研究,并对重组LYZL6蛋白（recombinant LYZL6,r LYZL6）的生理特性进行分析,从而揭示其生理功能。细胞免疫荧光法确定LYZL6定位于成熟精子头部的顶体后区域,反转录PCR（RT-PCR）分析表明精子表面的LYZL6蛋白来源于睾丸和附睾的分泌,Western blot法分析表明精子获能前后表面LYZL6的量无明显改变。半透明带结合实验和精子穿透实验分析表明兔抗LYZL6血清未明显抑制人精子结合透明带,但可明显抑制精卵融合。利用毕赤酵母表达系统成功表达了r LYZL6,使用甲壳素亲和层析和凝胶过滤层析可从发酵上清中纯化到具有生物活性的r LYZL6。酶联免疫吸附法（ELISA）分析显示r LYZL6不具有透明质酸结合能力、透明质酸水解能力和自由基清除活性,但具有较强的肽聚糖结合能力和异肽酶活性。LYZL6由睾丸和附睾分泌后定位于成熟精子头部的顶体后区域,可以参与精卵融合,并具有肽聚糖结合能力和异肽酶活性,提示LYZL6可能通过多种机制参与精子功能。

烧伤患者尿FDP、LZM的变化及临床意义

本文观察了44例四组不同烧伤面积患者的尿FDP(fibrin degradation)、尿LZM(Lysozyme),并分析了与伤情、败血症或死亡的关系。测试结果显示:随着伤情的增重尿FDP、LZM上升幅度逐渐增高,10％以下烧伤面积尿FDP、LzM均在正常范围,分别为0.24μg/ml、4.61μg/ml,而C、D组尿FDP上升为1.65μg/ml、3.5μg/ml;尿LZM30.5μg/ml、99.24ug/ml,两者呈正相关,而且与尿蛋白、尿素氮的上升水平也呈正相关。尿FDP上升1.248ug/ml,尿LZM上升51μg/ml以上提示肾功能有衰竭情况,特别是尿FDP上升4.992,尿LZM上升91μg/ml以上标志予后不佳。本检测对判断病情,评价治疗效果,予示肾功情况、败血症的发生与病情转归有一定临床价值,而且较敏感。

牙周炎患者免疫功能的初步研究

作者对59例成年人于周炎和23例青少年牙炎患者进行了免疫功能测定,结果显示牙周炎患者的唾液S-IgA、溶菌酶、血清补体C_3和IgA含量明显低于牙周正常者;两类患者的白细胞在牙周组织可溶性抗原存在下,其粘附玻壁的能力显著下降;血清IgG和IgA含量及PHA刺激后的外周血淋巴细胞对~3H-TdR掺入量则与牙周正常者相似.实验结果提示,两类患者具有相似的局部免疫功能低下和失调现象.

冠心病患者唾液免疫学指标的测定

测定了５４例冠心病患者（心绞痛３３例、急性心肌梗塞２１例）的唾液溶菌酶、ＳＩｇＡ、ＩｇＡ、ＩｇＧ４项指标，并与６３例正常人唾液标本进行对照。心绞痛和急性心肌梗塞患者的唾液溶菌酶显著低于正常人（Ｐ＜０．０００１），ＳＩｇＡ、ＩｇＡ、ＩｇＧ水平则明显高于正常人（Ｐ＜０．０００１），心绞痛与急性心肌梗塞的ＳＩｇＡ含量差异亦有显著性（Ｐ＜０．０１）。初步显示检测唾液免疫指标，对冠心病的病理生理研究有一定的临床意义。

不同月龄牦牛睾丸中LYZL4、LYZL6的基因表达及蛋白质定位

为探讨人源类溶菌酶蛋白4(Human lysozyme-like protein4,LYZL4)和人源类溶菌酶蛋白6(Human lysozyme-like protein 6,LYZL6)在牦牛睾丸中的表达机制,分别选取6、18、30、72月龄健康的牦牛12头(每组3头)采集睾丸组织。应用qRT-PCR、Western-blot和免疫组化技术分别分析了LYZL4和LYZL6在不同月龄牦牛睾丸中的表达和定位。结果显示,在不同月龄牦牛睾丸中均检测到 LYZL4、LYZL 6 基因和相关蛋白质的表达,其基因表达量随着牦牛月龄增加呈现上升趋势。72、30月龄牦牛睾丸中 LYZL4、LYZL 6 基因及蛋白质的表达量极显著高于6月龄和18月龄牦牛( P < 0.01)。LYZL4蛋白在6月龄牦牛睾丸中定位于间质细胞内,在18月龄牦牛睾丸中主要定位于精原细胞和支持细胞内,在30、72月龄牦牛睾丸中定位于圆形精子细胞内。而LYZL6蛋白在6月龄牦牛的睾丸中定位于间质细胞内,在18月龄牦牛睾丸中主要定位于精原细胞内,在30、72月龄牦牛睾丸中定位于圆形精子细胞和初级精母细胞内。 LYZL4和LYZL 6 基因主要在牦牛性成熟后高丰度表达,而在性成熟前相对低丰度表达。因此,在牦牛雄性生殖系统的发育过程以及在精子发生的调控过程中LYZL4和LYZL6均发挥着重要的作用。

腺苷对小鼠非特异免疫和体液免疫的抑制作用

腺苷(adenosine,Ade)1.3,13,130mg·kg^(-1)抑制小鼠全血白细胞和腹腔巨噬细胞的吞噬功能;减少小鼠血清溶菌酶的含量;降低小鼠血清溶血素的生成和空斑形成细胞的溶血能力。双嘧达莫10mg·kg^(-1)减弱Ade 130mg·kg^(-1)的体液免疫抑制作用;氨茶碱100mg·kg^(-1)可减弱Ade 130mg·kg^(-1)对脾空斑形成细胞溶血能力和外周血白细胞吞噬功能的抑制作用。