检测猪链球菌2型的溶菌酶释放蛋白(MRP)的PCR方法的建立

根据猪链球菌 2型的mrp基因自行设计和合成了一对可扩增长度为 885bp目的片段的引物 ,成功地建立了检测溶菌酶释放蛋白 (MRP)的PCR方法。用XbaⅠ内切酶进行酶切 ,获得了与预期一致的 5 78bp和 30 7bp的 2个片段。并进行了PCR的特异性试验和敏感性试验。对马链球菌兽疫亚种、猪丹毒杆菌、猪肺疫巴氏杆菌和猪肺炎支原体的PCR检测结果均呈阴性 ;检测的敏感度可达 10 0个细菌。另外 ,对 9株从病猪体内分离的猪链球菌 2型菌株进行了检测 ,8株呈阳性 ;对 15份正常屠宰猪扁桃体分离物的检测结果是 1份为阳性。结果表明此法特异性和敏感性均很高 ,可作为MRP快速诊断和流行病学调查的手段。

猪链球菌2型人源分离株截短的溶菌酶释放蛋白基因的克隆及原核表达

目的:克隆及表达猪链球菌2型(S.suis2)人源分离株Habb截短溶菌酶释放蛋白(MRP)基因。方法:根据S.suis2mrp基因的序列设计引物,克隆和分析江苏海安患者分离株Habb截短mrp基因(tmrp),构建原核表达质粒pGEX4T-2-mrp。在大肠杆菌中诱导带有谷胱甘肽转移酶(GST)标签的融合蛋白tMRP-GST表达;经亲和层析法纯化后,用凝血酶酶切去除重组蛋白中的GST,制备纯化的截短MRP(tMRP)抗原。用Westernblot检测重组抗原的活性。结果:序列分析表明,获得的tmrp基因长957bp;原核表达的融合蛋白tMRP-GST的相对分子质量(Mr)约61000;凝血酶处理的tMRP抗原的Mr约为35000。Westernblot分析显示,MRP-GST、tMRP蛋白均可与MRP多克隆抗血清发生特异性反应。结论:成功地克隆人源分离株Habb截短的mrp基因,并在原核系统实现高效表达,制备的纯化抗原tMRP具有良好的抗原性,为开展相关免疫学研究奠定了基础。

猪链球菌2型溶菌酶释放蛋白诱导上皮细胞融合和凋亡

猪链球菌 2型 (SS2 )溶菌酶释放蛋白 (MRP)的致病作用迄今不明 ,为此 ,以HEp 2细胞为上皮细胞体外模型 ,将纯化的MRP溶液和细胞共孵育 ,光镜观察 ,发现MRP可诱导细胞发生两种典型形态学变化 :一是诱导细胞融合形成多核巨细胞 ,随后巨细胞发生凋亡 ;二是诱导单个细胞凋亡。透射电镜观察和流式细胞分析确证MRP具有诱导上皮细胞凋亡的功能 ,凋亡率达 1 8%。证明MRP可单独作为SS2的毒力因子。

猪链球菌2型溶菌酶释放蛋白诱导血管内皮细胞融合

猪链球菌2型(SS2)主要引起人和猪的脑膜炎,但其毒力因子溶菌酶释放蛋白(MRP)对构成血脑屏障的微血管内皮细胞有何致病作用迄今不明。为此分离仔兔脾微血管内皮细胞(SMEC),纯化后用SV40-T 抗原转化后用作试验的细胞模型。将单层SMEC 和电泳纯MRP 溶液共孵育,染色后,光镜观察,发现MRP 可诱导SMEC发生两种典型形态学变化:致密细胞单层中出现巨大空洞而呈网状;空洞内有细胞融合,形成多核巨细胞,随后巨细胞核极度浓缩释出,巨细胞消失。研究结果表明, MRP 单独足以破坏大脑的血管内皮细胞屏障。

猪链球菌2型溶菌酶释放蛋白功能性片段的原核表达及其免疫保护性

目的表达猪链球菌2型(SS2)溶菌酶释放蛋白(MRP)的功能性片段(tmrp),并检测其对小鼠的免疫保护性。方法将构建的重组克隆载体pMD-tmrp经BamHⅠ、EcoRⅠ双酶切,将切下的目的基因tmrp亚克隆至原核表达载体pGEX-3X中,转化E.coliBL21(DE3),鉴定正确后,用IPTG诱导,谷胱甘肽亲和层析纯化GST-tmrp,免疫BALB/c小鼠,测定其免疫保护率。结果阳性工程菌经IPTG诱导,表达了可溶性目的蛋白,相对分子质量约为73000。0.8mmol/LIPTG,37℃,pH7.2诱导4h,表达量最高,为25.36%。经亲和层析纯化,融合蛋白纯度达93.7%。免疫BALB/c小鼠后,免疫保护率可达60%。结论已成功获得了具有免疫活性的GST-tmrp。

溶菌酶释放蛋白介导猪链球菌2型的血凝活性

比较了猪链球菌 2型 (SS2 )MRP+ 菌株HA980 1和MRP-菌株 0 0 64 44的血凝特性及溶菌酶释放蛋白 (MRP)在血凝过程中的作用。 2株菌均能凝集人A、B、O型及猪、兔、BALB/c小鼠、豚鼠、绵羊、山羊、水牛的红细胞 ,不凝集鸡、鲫鱼、鲤鱼、金鱼的红细胞 ,且对人、猪、兔、BALB/c小鼠、豚鼠红细胞的凝集价极显著高于绵羊、山羊和水牛 (P <0 .0 1) ;MRP+ 菌株对人、猪、兔、BALB/c小鼠和豚鼠红细胞的凝集价均极显著高于MRP-株 (P <0 .0 1)。MRP+ 株的血凝活性对热处理极其敏感 ,且凝集速度和反应温度呈负相关。半乳糖、胰酶预处理MRP+ 株菌体能完全阻断其血凝 ,葡萄糖、甘露糖、乳糖、蔗糖、过氧化氢、巯基乙醇对其则无明显影响。用纯化的MRP处理红细胞、抗MRP兔血清和MRP的单克隆抗体处理菌体 ,均能显著降低MRP+ 菌株的凝集价 (P <0 .0 5 ) ,但不能完全抑制 ;用抗MRP-菌株兔血清处理菌体 ,也能显著降低MRP+ 株凝集价。试验证明 :MRP是SS2的黏附素 ,具有半乳糖特异性受体 。

含猪链球菌2型溶菌酶释放蛋白基因片段的重组腺病毒构建与鉴定

目的构建猪链球菌2型(SS2)溶菌酶释放蛋白(MRP)基因片段的重组腺病毒并对其进行鉴定。方法根据MRP的基因序列,设计合成1对引物,以SS2型基因组为模板,扩增MRP基因片段(467-1351)序列。将PCR产物通过pMD18-T载体克隆后,再连接至腺病毒穿梭载体pShuttle-CMV中构建重组穿梭质粒pShuttle-CMV-MRP,再经PmeⅠ酶切,然后转化至含腺病毒骨架质粒pAdEasy-1的BJ5183-AD-1感受态细胞中,经同源重组获得重组腺病毒质粒pAdeno-CMV-MRP。PacⅠ酶切线性化该重组腺病毒质粒,再转染AD-293细胞进行病毒包装,最后对细胞包装的病毒液进行PCR和Western blot法鉴定。结果重组腺病毒质粒pAdeno-CMV-MRP转染AD-293细胞8 d后出现明显的细胞病变,在培养细胞的上清病毒液中也检测到了MRP基因片段及其表达的蛋白。结论成功构建了SS2型MRP基因片段的重组腺病毒(rAdeno-MRP)。

CdSe/ZnS量子点探针用于检测猪链球菌2型溶菌酶释放蛋白(MRP)抗原的新方法研究

合成了高发光效率的CdSe/ZnS量子点并制备了CdSe/ZnS量子点-溶菌酶释放蛋白(MRP)抗体探针,利用凝胶电泳和分子光谱法研究了MRP抗体与CdSe/ZnS量子点的结合机理.荧光光谱法优化了CdSe/ZnS量子点-MRP抗体探针制备的影响因素,建立了一种测定MRP抗原的新方法,其线性范围为5.0×10-8～1.5×10-6mol/L,线性相关系数为0.9976,检测限为1.9×10-8mol/L.

SS2溶菌酶释放蛋白(MRP)B细胞表位预测、原核表达及免疫学特性

运用ANTHEPROT 5.0综合分析二级结构、亲水性、表面可及性与抗原性指数,预测MRP的B细胞优势表位簇;PCR扩增出表达预测的抗原肽段的基因(mrp-1),构建重组原核表达载体pET32a-mrp-1,IPTG诱导表达,以渗透性休克法纯化重组蛋白;使用重组蛋白免疫血清和灭活猪链球菌2型SS2免疫血清Western blotting检测重组蛋白的免疫原性及其与SS2免疫血清的反应性;纯化的重组蛋白免疫雌性SPF昆明小鼠,SS2攻毒受试动物评估重组蛋白对小鼠的免疫保护力。Western blotting显示预测的950～1 210aa肽段与PET32a重组表达的蛋白(MRP)具有良好的免疫原性和反应性;攻毒试验结果表明重组蛋白对小鼠的免疫保护率为菌体免疫所提供保护率的66.7%。研究为利用该细胞表位簇作为高效免疫制剂奠定了基础。

猪链球菌2型溶菌酶释放蛋白引起血小板聚集的机制研究

目的研究猪链球菌2型溶菌酶释放蛋白（MRP）引起血小板聚集的作用机制，为猪链球菌临床救治提供科学依据与理论基础。方法镍柱亲和层析法纯化MRP-N、MRP-C蛋白，通过血小板聚集仪、血栓弹力图仪以及扫描电子显微镜观察MRP蛋白引起血小板聚集的情况。结果猪链球菌2型野生株可以引起血小板的聚集，而突变株ΔMRP则不能；MRP-N蛋白可以引起血小板的聚集，而MRP-C蛋白则不能；β2整合素受体抑制剂（GPRP）能显著抑制MRP引起的血小板聚集。结论MRP是猪链球菌2型引起血小板聚集的关键因子，MRP通过β2整合素受体途径引起血小板的聚集。

猪链球菌2型MRP与EPF基因串联表达蛋白及其免疫保护作用

根据猪链球菌2型(Streptococcus suis type 2,SS2)溶菌酶释放蛋白(muramidase-released protein,MRP)和胞外蛋白因子(extracellular protein factor,EPF)的基因序列,各设计合成一对引物,以猪链球菌2型江苏分离株SS2-1的基因组为模板,扩增mrp基因1 801~2 513位序列和epf 基因1 783~2 563位序列,分别构建原核表达载体pET32a-mrp 、pET32a-epf,确定诱导表达的两种蛋白都具有免疫原性后,提取阳性克隆质粒各自进行双酶切并纯化,通过PCR串联两片段,将目的片段定向克隆到表达载体pET-32a中,重组质粒转化入大肠杆菌BL21,经IPTG诱导表达分子量约为74kD的融合蛋白.用制备的两种抗血清与纯化融合蛋白进行免疫转印,结果显示融合蛋白分别具有MRP与EPF的中和表位.用融合蛋白MRP-EPF免疫新西兰兔,以最小致死量猪链球菌强毒株SS2-1攻击,兔的存活率达50%(2/4),存活率明显高于单个表达产物.证实串联表达的融合蛋白为重要的保护性抗原.

猪链球菌2型国内分离株毒力相关蛋白的分析

提纯猪链球菌 2型江苏分离株HA980 1的毒力相关蛋白溶菌酶释放蛋白 (muramini dase releasedprotein ,MRP)和胞外因子 (extracellularfacter,EF) ,制备其抗体供免疫转印之用。另提取猪源链球菌 1 7株国内分离株、1株德国分离株及 1株猪链球菌 2型人分离株的胞壁和胞外蛋白 ,经SDS PAGE ,与HA980 1株的MRP和EF的抗体作免疫转印。 1 1株MRP阳性 ,1 0株EF及EF 阳性 ,MRP及EF的分布存在 4种表型 :MPR+ EF+ (8 1 9) ,MRP+ EF (1 1 9) ,MRP+ EF- (1 1 9) ,MRP- EF- (1 0 1 9)。

检测猪链球菌2型毒力相关蛋白的ELISA法的建立

提纯猪链球菌 2型分离株HA980 1的毒力相关蛋白溶菌酶释放蛋白 (MRP)和胞外因子 (EF) ,制备其抗体。用此抗体建立了Dot ELISA和间接ELISA检测法。分别以菌株ATCC35 2 46和HA980 1为阴性与阳性对照 ,检测 17株猪源链球菌和 1株猪链球菌 2型人分离株。结果显示 ,两种ELISA的检测结果一致 ,MRP和EF的阳性率均为 61% (11/18)。

猪链球菌2型MRP-FBP串联表达蛋白对小鼠的免疫保护力

针对猪链球菌2型(SS2)溶菌酶释放蛋白(MRP)和纤维蛋白原结合蛋白(FBP)抗原性较强的基因片段,分别设计了1对引物,用PCR扩增出了mrp基因和fbp基因的片段。利用这些片段分别构建了原核表达载体pET32a-mrp、pET32a-fbp和pET32a-mrp-fbp。将这些表达载体分别转化大肠杆菌BL21(DE3),在IPTG诱导下进行了表达。SDS-PAGE分析表明,表达的MRP、FBP、MRP-FBP的分子质量分别为47、52、80 ku。Western-blot分析表明,重组蛋白MRP-FBP可被SS2阳性血清所识别。免疫保护试验表明,串联表达的融合蛋白MRP-FBP对BALB/c小鼠的保护率达80%,是目前筛选到的制备SS2亚单位疫苗保护力最高的短片段串联免疫原。

猪链球菌2型主要毒力因子研究进展

猪链球菌2型的毒力因子主要包括荚膜多糖(CPS)、溶菌酶释放蛋白(MRP)、细胞外因子(EF)、溶血素(HLY)以及多种具有毒性作用的蛋白片段。荚膜多糖是猪链球菌2型抵抗巨噬细胞吞噬的重要物质,也是猪链球菌进行分型的标志。溶菌酶释放蛋白和细胞外因子多出现于高致病力的毒株中,MRP和EF阳性菌株一般具有较高的毒力。溶血素具有较强的细胞毒性作用,其对微血管内皮细胞的破坏作用有利于细菌在组织内的扩散。其他多种毒力因子虽也具有致病作用和免疫原性,但还有待于进一步研究。由于猪链球菌2型致病机理复杂,毒株表型多样,尚未发现可区分毒力株、弱毒力株和无毒力株的标志性因子。对猪链球菌2型的毒力因子进行深入研究,对于阐明猪链球菌2型的致病机理,寻找到快速有效的诊断治疗方法以及疫苗的构建都有重要意义。

猪链球菌2型三重PCR检测方法的建立

针对猪链球菌2型gdh、mrp及cps2J基因设计3对引物,建立了该菌的三重PCR方法。30μL反应体系中3组引物gdh1、gdh2,mrp1、mrp2及cps2J1c、ps2J2的最适浓度比为1∶1∶1.67。最佳反应条件为94℃3 min;94℃1 min,55℃40 s,72℃50 s,30个循环;72℃5 min。可扩增到目的基因gdh、mrp及cps2J的片段大小分别为689、532和457 bp;猪链球菌2型BHI培养物的检测下限为450 CFU;猪肉人工污染样品经4 h增菌,其检测下限仅为4 500 CFU。以上结果显示,该三重PCR方法可用于组织样品和纯培养物中猪链球菌2型的检测,具有快速、特异和简便的特点。

猪链球菌2型人源株MRP的表达及其单克隆抗体的制备与应用

将猪链球菌2型(SS2)人源株Habbmrp基因进行截短修饰后,克隆于pGEX4T-2载体中,转化大肠杆菌诱导表达约61000的融合蛋白MRP-GST,该蛋白经凝血酶作用去除重组蛋白中的GST标签,得到约35000纯化的MRP。Western blotting证实MRP可被SS2阳性血清特异性识别。以纯化的MRP抗原免疫BALB/c小鼠,取免疫鼠脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0融合,间接ELISA进行筛选获得了6株能稳定分泌抗MRP特异性单抗的细胞株。特异性试验表明该6株单抗与SS2的另外2种蛋白、大肠杆菌均不发生交叉反应。以2B8单抗腹水和SS2多克隆抗血清建立夹心ELISA对71株标准菌株和122株猪链球菌野毒株进行MRP的表征鉴定,标准株检测结果与背景符合率为为97.2%(69/71),其中34株标准血清型菌株检测的符合率为100%。表明该方法可用于猪链球菌的快速诊断和流行病学调查。

猪链球菌2型人源分离株MRP单克隆抗体的制备与鉴定

为建立一种针对猪链球菌2型（SS2）毒力因子的特异性检测方法，研制了抗SS2溶菌酶释放蛋白（MRP）单克隆抗体（McAb），并对其生物学活性进行了分析。将表达、纯化的SS2菌株MRP免疫BALB／c小鼠，采用淋巴细胞杂交瘤技术将免疫鼠脾细胞与SP2／0骨髓瘤细胞融合，以纯化的MRP蛋白作为包被抗原，通过间接ELISA方法筛选获得了6株能稳定分泌抗MRPMcAb的杂交瘤细胞系288、3G5、1G1、3G9、186和2C3。经用间接ELISA方法测定，单抗腹水的抗体效价均超过1：10^5，杂交瘤细胞培养上清液的效价为1：128～1：1024。Western-blotting鉴定结果表明，6株单抗均具有特异的生物学活性；以288单抗腹水和SS2多克隆抗血清建立的夹心ELISA方法可特异地检测MRP。

猪链球菌2型毒力因子多重荧光PCR检测方法的建立与应用

本研究通过在扁桃体组织中添加猪链球菌2型菌后提取的DNA为模板，建立了检测猪链球菌2型毒力因子MRP和EF的多重荧光PCR检测方法，并对部分猪扁桃体和肌肉组织进行了检测。结果发现，本方法可以快速检测出组织内的致病性猪链球菌2型，且特异性强，灵敏度达到100CFU。采用本研究建立的方法对北京和江西部分屠宰场猪扁桃体及北京市售猪肉进行检测，没有发现致病性猪链球菌2型感染。本检测方法的建立，有利于快速确定人-猪链球菌感染原的致病性，这为疫情发生后，有针对性地采取紧急防控措施、保护消费者的健康和生命安全奠定了基础。