养殖环境及贝源溶藻弧菌MLST分型及其毒力基因、耐药性分析

溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)是近年来贝类病害中最常见的细菌性病原之一,对贝类养殖产业的健康发展构成严重威胁。本研究旨在分析不同养殖环境水体和贝类组织中,溶藻弧菌的基因变异、毒力基因、耐药性及其分布规律。对12株溶藻弧菌分离株开展多位点序列分型(multilocus sequence typing,MLST)、毒力因子以及菌株耐药性分析,结果显示,12株溶藻弧菌的序列型(sequence typing,ST)分型互不相同,7株为Pub MLST数据库已经收录的ST型,5株因管家基因的等位基因位点变化而形成新的ST型,贝类养殖环境中的溶藻弧菌具有较高的遗传多样性。12株溶藻弧菌都携带tlh、fur和collagenase三种毒力基因,但均未检测到tdh、trh、toxR和tcpA毒力基因。溶藻弧菌携带毒力因子的种类和数量受地区分布等因素的影响。不同来源的溶藻弧菌均具有多重耐药特征,对青霉素和氨苄西林产生抗性。本研究表明,贝类养殖环境中的溶藻弧菌具有种群复杂、遗传多样性高的特点;不同来源菌株在毒力基因携带和耐药性方面存在较大差异。本研究通过探究不同区域内不同来源的溶藻弧菌遗传变异及耐药性差异,对贝源溶藻弧菌的有效防控提供一定理论参考。

溶藻弧菌冷冻保护剂配方与冻干工艺研究

【目的】研究溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)真空冷冻干燥保护剂配方与优化冻干工艺条件,并探究冷冻干燥对菌株毒力及药物敏感性的影响,为菌种在冷冻干燥保藏上的应用提供理论依据。【方法】采用真空冷冻干燥技术,以溶藻弧菌HY9901为研究对象,通过单因素试验及正交试验,探究L-谷氨酸钠、海藻糖、脱脂乳、葡萄糖、甘露醇、甘氨酸6种单一保护剂对菌株活性的影响,筛选最佳冷冻保护剂复配配方,并研究菌液浓度、预冻时间、预冻温度及复水介质4个因素对菌株冻干工艺的影响,优化溶藻弧菌冻干工艺条件。同时,通过储藏试验、半数致死量(LD_(50))试验和药敏试验,探究冻干菌株的活性变化规律及其生物特性。【结果】6种单一保护剂对溶藻弧菌冻干的保护效果存在显著差异,其效果从强到弱依次为:L-谷氨酸钠、海藻糖、脱脂乳、葡萄糖、甘露醇、甘氨酸;菌株最佳冷冻干燥保护剂复配配方为海藻糖50 g/L+L-谷氨酸钠50 g/L+脱脂乳50 g/L,其存活率为62.12%,与单一保护剂的保护效果差异显著;冻干工艺最适条件:菌液浓度1×10~8~10~9 CFU/mL、预冻时间3 h、预冻温度-80℃、复水介质为PBS或50 g/L脱脂乳,此条件下菌株存活率可达到最大值(63.72%)。最佳冻干条件下,菌株储藏60 d期间,其活性无显著差异;菌株冻干前后的LD_(50)分别为1.22×10~8、1.20×10~8 CFU/mL,LD_(50)无显著差异。菌株在冻干前后的药敏抑菌圈直径无显著差异,对氟苯尼考、氯霉素、环丙沙星等药物均表现敏感;对新霉素、卡那霉素均表现中度敏感;对丁胺卡那、哌拉西林等药物均表现耐药。【结论】溶藻弧菌HY9901的冷冻干燥复配配方为海藻糖50 g/L+L-谷氨酸钠50 g/L+脱脂乳50 g/L,冻干工艺条件为菌液浓度1×10~8~10~9 CFU/mL、预冻时间3 h、预冻温度-80℃、复水介质为PBS或50 g/L脱脂乳,该配方及工艺合理可行,具有良好的储藏性及生物稳定性。

斜带石斑鱼源致病溶藻弧菌的分离鉴定及病理性分析

【目的】2023年10月,深圳市某养殖基地斜带石斑鱼出现皮肤溃烂、皮下出血及肠炎等症状,明确引发本次斜带石斑鱼(Epinephelus coioides)突发性死亡的致病菌种类及其生物学特性,以筛选出有效抑制病原菌的消毒剂,为溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)感染斜带石斑鱼的科学防治提供理论指导。【方法】利用平板划线法,从患病濒死斜带石斑鱼的病灶组织中分离病原菌,对病原菌形态特征、生理生化特性、系统进化树、毒力基因和耐药基因及药物敏感性进行研究,并对其进行回归感染试验。【结果】从患病斜带石斑鱼组织中分离得到一株溶藻弧菌,命名为菌株SZGP226;系统进化树分析结果显示,该菌与溶藻弧菌HH101307、IB1、Xmb015聚为一支,序列相似性达99.72%;菌株SZGP226可以分解蔗糖、甘露醇、葡萄糖、尿素,氧化酶活性及V-P等生理生化指标鉴定为阳性;同时携带tlh、toxR、ctsA、sto和vpi 5种毒力基因。药敏结果显示,菌株SZGP226耐受氨苄西林、苯唑西林等9种抗生素耐药,并携带qnrB、fl oR、tetC、tetM、qnrD、gyrA、Sul1、SHV和Oxa-24等9种耐药基因。消毒剂筛选结果显示,氢氧化钠对菌株SZGP226的杀菌效果最好、最小抑菌浓度(MIC)为8 mg/mL。回归感染试验表明,菌株SZGP226对斜带石斑鱼具有强致病性,半致死浓度(LC_(50))为1.63×10^(7)CFU/mL,可引起斜带石斑鱼肝脏、肾脏和脾脏发生明显病理性损伤。【结论】溶藻弧菌是引起本次斜带石斑鱼突发性死亡的病原菌,其致病基因包括tlh、toxR、ctsA、sto和vpi,LC_(50)为1.63×10^(7)CFU/mL。氢氧化钠对菌株SZGP226的杀菌效果最好,在养殖开展前可选择氢氧化钠(3 mg/mL)对养殖环境进行消杀清理。

地中海弧菌117-T6的溶藻活性

为验证地中海弧菌117-T6(Vm 117-T6)是否具有广谱溶藻性,本实验观察了其对赤潮异湾藻、颗石藻、叉鞭金藻和东海原甲藻的溶藻作用,并对其溶藻物质的特性进行了分析。结果表明,紫菜黄斑病致病菌Vm 117-T6对赤潮异湾藻、颗石藻、叉鞭金藻和东海原甲藻等微藻具有较强溶藻活性,可使藻类叶绿素含量显著降低,是一株广谱性溶藻细菌。Vm 117-T6能在40 min内使赤潮异弯藻的活动能力下降,光合作用受抑,感染120 min即可导致藻体裂解并产生白色絮状沉淀。该菌株能降解卡拉胶,不能降解果胶、纤维素和几丁质。Vm 117-T6菌体、胞内及胞外提取物均具有较强的溶藻活性,其胞外溶藻物质易溶于水、不溶于石油醚和乙酸乙酯,具较强极性;耐高温、不易被活性炭吸附、乙醇处理会降低溶藻活性。Vm 117-T6在常规与易感条件下的关键差异蛋白包括大量的ABC转运蛋白、外膜蛋白、鞭毛蛋白及少量毒素。上述结果提示,Vm 117-T6毒力效应物中含有极性的内毒素物质,且与毒力因子转运、分泌以及细胞黏附相关的蛋白可能在其毒力作用中发挥重要作用。本实验为解析该菌株溶藻机制提供了证据,为该菌的防治及应用提供了参考。

抗哈维氏弧菌、溶藻弧菌与副溶血性弧菌三联卵黄抗体的制备及体外作用效果评估

为研究三联特异性卵黄抗体对哈维氏弧菌、溶藻弧菌与副溶血性弧菌的体外抑菌效果,通过制备哈维氏弧菌、溶藻弧菌与副溶血性弧菌三联灭活疫苗,免疫蛋鸡。收集鸡蛋制备卵黄抗体并检测其效价、纯度和特异性。通过免疫荧光、扫描电镜和体外抑菌实验初步探究其制备的三联特异性卵黄抗体对3种弧菌的体外抑菌效果。结果显示,ELISA检测特异性卵黄抗体效价高达1∶51200,并维持5周;SDS-PAGE对分离纯化的卵黄抗体分析显示,随着纯化步骤的进行,卵黄抗体中的蛋白杂带逐渐减少,纯度变高。免疫荧光和免疫印迹实验表明,特异性卵黄抗体与抗原的结合具有较高的特异性。扫描电镜进一步观察发现,相比非特异性卵黄抗体,特异性卵黄抗体处理过的弧菌,菌体互相黏附在一起,菌体细胞表面粗糙,细胞壁破损。在体外抑菌实验中,特异性卵黄抗体对弧菌具有明显的抑制效果,且抑制作用呈现剂量依赖性。研究表明,三联特异性卵黄抗体能够与哈维氏弧菌、溶藻弧菌和副溶血性弧菌发生特异性结合,通过体外实验发现,卵黄抗体通过凝集和黏附,破坏菌体细胞的完整性,从而发挥抑菌作用。实验结果为研发绿色、安全、高效的抗哈维氏弧菌、溶藻弧菌和副溶血弧菌三联特异性卵黄抗体提供理论和实验基础。

19种中药提取物对海洋致病溶藻弧菌生长和生物被膜的影响

溶藻弧菌爆发和流行给海水养殖造成巨大经济损失,生物被膜的形成导致溶藻弧菌的致病性和耐药性进一步加强。目前,中草药已经在防治病原性细菌感染疾病中展现出积极的潜力。本研究选取19种中药(枸杞、重楼、紫菀、何首乌、鸡血藤、厚朴、墨旱莲、广金钱草、栀子、桃金娘、连翘、公丁香、白英、黄柏、艾叶、知母、盐知母、酒知母、炒知母),采用不同溶剂进行提取,旨在深入探究这些中药提取物对溶藻弧菌的生长和生物被膜形成的影响。通过采用牛津杯法和96孔培养法,系统性地分析了其提取物对溶藻弧菌生长的影响;利用结晶紫染色法,探究了这些中药提取物在其亚抑制浓度下对溶藻弧菌生物被膜形成的潜在影响。结果发现其中12种中药的水提物有抑菌活性,17种中药的乙醇提取物和15种中药的乙酸乙酯提取物有抑菌活性;此外,公丁香水提取物、重楼和知母乙醇提取物、桃金娘和连翘乙酸乙酯提取物对溶藻弧菌生物被膜的形成产生了明显的抑制效果;同时,我们还发现知母及其炮制品在抑菌活性方面存在一定差异,但在对生物被膜形成的作用表现出一定的相似性。本研究的发现为细菌的防治和抗生物被膜制剂的研发具有重要的指导意义。这些发现有望为应对溶藻弧菌暴发提供新的、可持续的策略,有助于保护海洋养殖业的可持续性,维护食品安全,以及维护人类健康。

水产品中副溶血弧菌、溶藻弧菌和霍乱弧菌三重PCR检测方法的建立

为实现水产食品中多种弧菌同步快速检测,拟建立一种同时检测副溶血弧菌、溶藻弧菌和霍乱弧菌的三重PCR快速检测方法。根据副溶血弧菌的bla CARB-17基因、溶藻弧菌的gyrB基因和霍乱弧菌的toxR基因设计特异性引物。针对3种弧菌分别建立单重PCR体系并优化各项主要反应参数,确定最佳退火温度。然后建立多重PCR体系并优化其反应参数,分析三重PCR的特异性和灵敏度;并验证其实效性。结果表明:三重PCR的最佳退火温度为60℃,能同时扩增出副溶血弧菌bla CARB-17基因的230 bp片段、溶藻弧菌gyrB基因的337 bp片段,霍乱弧菌toxR基因的130 bp片段,灵敏度分别为0.583 ng/μL、0.394 ng/μL、0.866 ng/μL。该三重PCR检测方法可以从实际样品中快速特异地检出三种弧菌,具有较好的特异性,较高的灵敏度,为实际生产中检测水产食品中的弧菌污染提供参考。

太平洋牡蛎MyD88-3基因克隆及溶藻弧菌感染后的表达模式

【目的】克隆太平洋牡蛎(Crassostrea gigas)新型髓样分化因子88(MyD88)基因MyD88-3,分析其在溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)感染后的表达模式,为探究太平洋牡蛎MyD88基因在免疫调控中的作用和太平洋牡蛎健康养殖提供理论依据。【方法】克隆CgMyD88-3基因编码区(CDS),运用ProtScale、SWISS-MODEL和InterPro等进行生物信息学分析,采用实时荧光定量PCR分析溶藻弧菌感染前后,CgMyD88-3基因在太平洋牡蛎不同组织中的表达情况。【结果】CgMyD88-3基因CDS长度为537 bp,共编码178个氨基酸残基,CgMyD88-3蛋白相对分子量为20.74 kD,理论等电点为6.10。亚细胞定位预测结果显示CgMyD88-3蛋白位于细胞质,含5个酪蛋白激酶II磷酸化位点(17TEED20、29SNLE32、76TQNE79、118TAND121、123TKED126)和3个蛋白激酶C磷酸化位点(26TMK28、148TAK150、169SEK171)。CgMyD88-3氨基酸序列只含1个TIR(Toll/interleukin-1 receptor)结构域,不含Death结构域。CgMyD88-3氨基酸序列与美洲牡蛎(Crassostrea virginica)CvMyD88-like氨基酸序列相似性最高,为100%,基于MyD88氨基酸序列相似性构建的系统发育进化树显示,CgMyD88-3先和美洲牡蛎CvMyD88-like聚为一支,然后与太平洋牡蛎CgMyD88-T1和CgMyD88-T2聚为一支。实时荧光定量PCR检测发现,CgMyD88-3基因在健康太平洋牡蛎6种组织中均有表达,相对表达量最高的为外套膜组织,鳃组织次之,在其他组织中依次为血细胞>性腺>消化腺>闭壳肌。溶藻弧菌感染后,太平洋牡蛎闭壳肌、消化腺、血细胞和鳃组织中的CgMyD88-3基因相对表达量均明显升高,在闭壳肌、消化腺和血细胞中感染72 h后达最高,在鳃中感染6 h后达最高,而在外套膜组织中感染后各时间段的CgMyD88-3基因相对表达量均低于0 h。【结论】CgMyD88-3基因在健康的太平洋牡蛎各组织中均有分布,在外套膜中的相对表达量最高。溶藻弧菌刺激可诱导CgMyD88-3基因高表达,表明CgMyD88-3基因可能在太平洋牡蛎抵御外界微生物及病原体感染中扮演重要角色。

过硫酸氢钾对贝类育苗水体中溶藻弧菌的杀灭效果

本文以海蚌育苗池海水中的溶藻弧菌作为研究对象,探讨过硫酸氢钾对溶藻弧菌的杀灭效果。通过单因素试验和3因素3水平正交试验探讨不同温度、不同过硫酸氢钾浓度、不同菌液浓度对抑制溶藻弧菌效果的影响。从单因素试验结果可知,当温度处于20~30℃、过硫酸氢钾浓度20~40 mg/L、菌液浓度10^(5)~10^(7)CFU/mL时,杀菌抑制效果显著;正交试验结果显示,温度25℃、过硫酸氢钾浓度40 mg/L、菌液浓度10^(5)CFU/mL,是过硫酸氢钾溶液对溶藻弧菌杀灭效果最佳的条件;药物浓度11 mg/L时,灭菌率≧99%;药物浓度大于9 mg/L时,药物作用时间1~24 h的杀菌率差异均不显著,过硫酸氢钾药效可以维持24 h。

3种益生菌在不同浓度下对溶藻弧菌拮抗作用研究

溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)是我国水产养殖中弧菌病暴发的主要致病菌,给水产养殖行业造成了巨大的经济损失。本研究通过液态拮抗培养法和牛津杯法进行动态监测,两种拮抗培养法均显示,当益生菌(Probiotic)在稀释100倍后对2.5×10^(6) CFU/mL的溶藻弧菌有很好的抑制效果,其中EM菌(Effective Microorganisms)的抑菌活性要高于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis, B. subtilis)和乳酸菌(Lactic acid bacteria, LAB)。采用液体拮抗培养探究分别施用不同浓度的益生菌时对水体中溶藻弧菌数量的影响,从而得出最适宜的用药浓度比和用药频率。结果显示,当弧菌浓度≥≥10^(6)CFU/mL时,需要在18 h内投放浓度为10^(7) CFU/mL的枯草芽孢杆菌,或浓度为10^(6) CFU/mL的乳酸菌,或浓度为10^(6) CFU/mL的EM菌均可达到较好抑菌效果。本研究确定的益生菌最佳浓度和频率,可以为水产动物细菌性疾病的防控提供重要参考。

养殖海水中溶藻弧菌的鉴定与6种抗生素耐药性分析

本试验对哈尔滨圣亚极地公园有限公司冰海巨鲨池水取样、培养,确定为溶藻弧菌后进行了6种常见抗生素的不同浓度耐受性试验,旨在了解其耐药性情况,从而得到合理的治疗及控制方案。通过实验结果进行了一例圆燕溶藻弧菌疾病的治疗。一、材料与方法1.材料与试剂硫代硫酸盐柠檬酸盐胆盐蔗糖琼脂培养基(TCBS)、硫酸阿米卡星注射液、硫酸庆大霉素注射液、注射用头孢曲松钠、复方磺胺甲恶唑片、氨苄西林胶囊和诺氟沙星胶囊。

环境因子对溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)粘附大黄鱼(Pseudosciaena crocea)表皮粘液影响的研究

采用3H-TdR同位素示踪方法研究了环境因子对溶藻弧菌对大黄鱼表皮粘液粘附作用的影响。试验结果表明,溶藻弧菌能很好地粘附于大黄鱼表皮粘液,其粘附量在菌浓度不超过6.52×108cfu/ml情况下随菌浓度的升高而升高;粘附量在25℃下孵育180min趋于饱和,在180min以内与孵育时间呈正相关关系;粘附作用在温度25—30℃、pH值偏酸、盐度35条件下较强;在无Na+(盐度为0)时,无粘附作用;Ca2+能显著加强溶藻弧菌的粘附作用,而Mg2+作用不明显。这些结果表明,溶藻弧菌对大黄鱼表皮粘液有较强的粘附作用,其粘附作用受温度、盐度、pH值等环境因子的影响。

拮抗菌对病原性溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)粘附大黄鱼(Pseudosciaena crocea)表皮粘液的影响

采用3H-TdR同位素示踪法研究了病原性溶藻弧菌和9株拮抗菌对大黄鱼表皮粘液的粘附动力学。结果表明,10株细菌的粘附作用都符合饱和粘附动力学特征;R4、R13和R32等3株拮抗菌的最大粘附量高于溶藻弧菌;9株拮抗菌的分离常数都高于溶藻弧菌;R32的亲和指数大于溶藻弧菌,其余8株拮抗菌的亲和指数都小于溶藻弧菌。测定了9株拮抗菌对病原性溶藻弧菌粘附大黄鱼表皮粘液的竞争、排斥和置换作用,结果显示:9株拮抗菌在竞争条件下都能极显著减少溶藻弧菌对表皮粘液粘附(P<0.01);在粘附排斥方面,R4、R13、J26、J28、J312、Y59等6株拮抗菌能显著排斥病原性溶藻弧菌对大黄鱼表皮粘液的粘附作用(P<0.05);在粘附置换方面,J26、J28等2株拮抗菌能极显著(P<0.01)降低病原性溶藻弧菌对大黄鱼表皮粘液的粘附量。研究结果表明,病原性溶藻弧菌对大黄鱼表皮粘液有较强的粘附作用;9株拮抗菌能够抑制溶藻弧菌对大黄鱼表皮粘液的粘附作用,其中竞争作用效果最好,排斥作用次之,置换作用的效果最差;拮抗菌对病原菌粘附的抑制效果受多种因素的影响,各菌株的粘附动力学参数有重要的影响作用。

溶藻弧菌细胞密度相关sRNA的鉴定及其对毒力的调控作用

溶藻弧菌作为四大致病弧菌之一,可引起鱼虾的系统性疾病以及人类肠道和创伤性伤口感染,其毒力因子的表达及致病性与细胞密度紧密相关.sRNA是存在于细菌中的非编码小RNA,作为转录后调控因子广泛参与细菌的毒力、环境应激、生长代谢等过程.利用转录组测序等手段,在溶藻弧菌中筛选出了显著差异表达的细胞密度相关非编码RNA分子,sRNA0087,并对其二级结构以及靶标mRNA进行预测.通过构建其突变株及回补株,探究了sRNA0087对溶藻弧菌毒力因子的调控作用.实验结果表明,溶藻弧菌在高细胞密度(9 h)相较于低细胞密度共有82个差异表达sRNA,其中47个表达上调,35个表达下调.sRNA0087下调水平最为显著,具有典型RNA二级结构,包含4个茎环结构以及3’端poly(U)结构,其在溶藻弧菌基因组中存在多个潜在靶标mRNA分子.成功构建Δ0087缺失株和0087^(+)回补株,sRNA0087对溶藻弧菌的运动性、生物被膜形成以及胞外蛋白酶的分泌具有显著的促进作用.

海口市海产品中副溶血弧菌和溶藻弧菌的污染情况监测分析

目的:了解海口市海产品中副溶血弧菌和溶藻弧菌的污染及分布情况。方法:采集2020年~2022年海口市售的3大类海产品,参照《食品安全国家标准食品微生物学检验副溶血性弧菌检验》(GB4789.7-2013)检测副溶血性弧菌和溶藻弧菌,采用实时荧光PCR技术对副溶血性弧菌及溶藻弧菌进行鉴定,分析不同种类海产品、不同年份和不同季度的副溶血弧菌和溶藻弧菌检出情况。结果:海产品中共采集119份,其中24份检出副溶血性弧菌,阳性率20.1%;46份检出溶藻弧菌,阳性率38.7%;各类海产品中虾类副溶血性弧菌阳性率最高,为50%;贝类溶藻弧菌阳性率最高,为48%。监测年份之间比较,2021年溶藻弧菌的阳性率最高,为76.7%;2022年副溶血性弧菌阳性率最高,为25%。不同季度之间比较,第二季度溶藻弧菌的阳性率最高,为80%,第四季度副溶血弧菌的阳性率最高,为33.3%。不同年份、季度海产中溶藻弧菌阳性率差异具有统计学意义(P<0.05),不同种类、季度副溶血弧菌阳性率差异具有统计学意义(P<0.05)。结论:2020年~2022年海口市海产品中存在着副溶血性弧菌和溶藻弧菌的污染,建议加强相关部门的监管,保障人民海产品食用的安全性。

Hfq对溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)毒力的调控分析

为探讨分子伴侣Hfq对溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)毒力的调控作用,本文分析了溶藻弧菌ZJ-T野生株、hfq突变株及回补株各项与毒力相关的生理生化指标。研究结果显示:在半固体和固体LBS平板中,缺失株游动和涌动能力显著降低(P<0.001);hfq缺失株生物膜合成速度及合成量降低,但解离速度增加;在限铁环境下,缺失株生长有所减弱;缺失株胞外蛋白酶分泌增强(P<0.01);同野生株和突变株相比,缺失株对小鼠成肌细胞系C2C12细胞几乎不致死,且其对石斑鱼的半数致死量提高3个数量级。实验结果表明:Hfq对溶藻弧菌毒力具有重要调控作用,并通过调控其运动、生物膜形成、铁代谢、胞外蛋白酶分泌等生理生化过程从而调控其毒力。本研究可为溶藻弧菌病害暴发的防治提供重要理论依据。

γ-干扰素对溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)在青石斑鱼(Epinephelus awoara)巨噬细胞胞内存活的影响

采用大肠杆菌重组γ-干扰素(rIFN-gamma)单独和联合处理青石斑鱼(Epinephelus awoara)头肾巨噬细胞的方法,进行了重组γ-干扰素对溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)在巨噬细胞内存活研究。结果表明,溶藻弧菌感染巨噬细胞后暴露于-干扰素的细胞内细菌存活数量[(1380±80)CFU/mL]明显降低。然而,在24h,γ-干扰素及脂多糖联合处理组巨噬细胞内溶藻弧菌的存活数量[(463±32)CFU/mL]比暴露于含有或者不含有脂多糖,NG-单甲基-L-精氨酸(NMMA)和过氧化氢酶的-干扰素处理组少。采用γ-干扰素,γ-干扰素和脂多糖,γ-干扰素、脂多糖和NMMA,γ-干扰素、脂多糖和过氧化氢酶四种方式处理24h能提高巨噬细胞过氧化氢的释放,而不能提高NO2的产物。另外,经过-干扰素处理能够明显降低巨噬细胞对溶藻弧菌的的吞噬作用,但不影响对溶藻弧菌的杀伤作用。本文数据表明,过氧化氢的释放和细胞吞噬作用能明显减少溶藻弧菌在巨噬细胞内存活的数量。

三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)CTL基因SNP位点E4-205 C/T与抗溶藻弧菌相关性分析

C-型凝集素(C-typelectin,CTL)是甲壳类动物体液免疫中重要的免疫因子之一。但CTL基因在溶藻弧菌对三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)感染的过程中的表达及抗病机制尚有待进一步研究。为初步阐明CTL基因SNP E4-205 C/T位点与抗溶藻弧菌感染相关的分子机制,对不同基因型梭子蟹进行溶藻弧菌感染,通过绝对定量方法分析不同基因型梭子蟹肝胰腺、肌肉组织中溶藻弧菌的复制情况。发现溶藻弧菌感染后12 h内梭子蟹肝胰腺、肌肉组织中C/C组细菌数量显著高于T/T组,结果表明T/T组梭子蟹抗感染能力显著高于C/C组。进一步对该位点非同义突变(ACT-ATT)导致的一个氨基酸改变(Thr-Ile)的两种蛋白进行体外重组表达,并对两种重组蛋白CTL-ATT及CTL-ACT进行活性分析。发现两种重组蛋白对溶藻弧菌生长均具有一定的抑制作用,CTL-ATT的抑菌活性显著高于CTL-ACT。重组蛋白CTL-ATT与PAMPs的结合活性高于CTL-ACT与PAMPs的结合活性,同时两种蛋白与PAMPs和溶藻弧菌的结合活性具有浓度依赖性。结果表明三疣梭子蟹CTL基因参与机体感染溶藻弧菌后的免疫应答过程,其单核苷酸多态性与抗溶藻弧菌感染存在一定的关联性,三疣梭子蟹CTL基因SNPE4-205C/T位点为T/T基因型时的抗溶藻弧菌感染能力强于C/C型。

大黄鱼(Larimichthys crocea)白细胞介素10(IL-10)基因克隆及溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)侵染后表达变化分析

白细胞介素10(interleukin10,IL-10)是鱼类先天性免疫因子之一,在炎症反应和免疫调节中有着重要作用。本研究获得大黄鱼(Larimichthys crocea)IL-10基因cDNA序列,由899个核苷酸组成,含1个555bp的开放阅读框、编码184个氨基酸,预测编码蛋白分子量为21.24kDa、N端有22个氨基酸组成的信号肽序列。氨基酸序列多重比对表明大黄鱼IL-10具有IL-10家族特征性序列和构成2对二硫键的4个保守性半胱氨酸,与欧洲鲈(Dicentrarchuslabrax)IL-10序列相似性最高(78.5%);系统进化树分析显示大黄鱼IL-10和其他鱼类IL-10形成一个大簇,与欧洲鲈进化关系最近。荧光定量PCR(quantitative real-time PCR, qRT-PCR)检测结果显示健康大黄鱼IL-10基因在鳃和肠中高表达,肝和头肾中低表达;溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)侵染后大黄鱼肠、脑、脾、肝和头肾中IL-10基因表达量均显著上调(P<0.05),其中头肾和肝中上调幅度最大(分别为菌侵染前的10.06倍和8.79倍)。综上,大黄鱼IL-10基因表达与病原菌感染密切相关,为深入研究大黄鱼IL-10的生物学功能及免疫机制提供了基础资料。

利用核酸适配体的竞争置换作用检测溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)

溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)是水产养殖中致病性较强的一种条件致病菌,为更灵敏、高效地对其进行检测,研发出一种基于核酸适配体竞争置换作用的检测方法。首先设计并制备出磁珠-核酸适配体-荧光报告探针的检测复合物(MAP检测复合物),然后利用溶藻弧菌与其核酸适配体有较好的亲和特异性,在对样品进行检测时,样品中的溶藻弧菌就会竞争MAP检测复合物中的核酸适配体,从而置换出与该核酸适配体结合的荧光报告探针,再通过检测置换出的报告探针的荧光强度来表征溶藻弧菌的浓度,从而实现对溶藻弧菌的定量检测。结果表明,该方法对溶藻弧菌的检测限可达到1CFU/mL,与嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)、迟钝爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)、哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)、大肠杆菌(Escherichia coli)等水产养殖中的常见致病微生物没有交叉反应,并在1~20、20~100和100~1000 CFU/mL范围内都表现出较好的线性关系。另外还对MAP检测复合物的制备条件进行了优化,较为理想的制备条件为:100nmol/L核酸适配体与100nmol/L荧光报告探针按体积比1︰1混合结合30 min,制备出50 nmol/L的核酸适配体-荧光报告探针复合物,然后该复合物再与25μg/mL的磁珠按体积比1︰1混合结合60 min,制备出相应的MAP检测复合物。利用核酸适配体的竞争置换作用检测溶藻弧菌有较好的灵敏度和特异性,展现了较好的应用前景。