迟缓爱德华菌eha基因对大肠埃希氏菌溶血基因clyA转录的调控

目的研究迟缓爱德华菌溶血活化基因eha是否能影响大肠埃希氏菌DH5α溶血素基因clyA的转录。方法将重组eha表达质粒pED101转入DH5α中,以载体质粒pACYC184为对照,观察其溶血情况。并用RT-PCR分别检测受体菌DH5α,含pED101的DH5α菌以及含载体的DH5α菌中clyA基因的转录情况。结果eha基因表达质粒的转入,可以使DH5α出现clyA基因阳性条带,且和载体无关。结论迟缓爱德华菌eha基因能正性调控DH5αclyA基因的转录,从而使其表现为溶血。

慢性牙周炎患者中间普氏菌临床分离株中溶血基因的分布

目的 :研究溶血基因在慢性成人牙周炎患者中间普氏菌临床分离株中的分布状况 ,探讨溶血基因与中间普氏菌致病性的关系。方法 :收集符合纳入标准的 5 7例慢性成人牙周炎病人的牙周袋内的龈下菌斑 ,采用厌氧培养技术分纯产黑色素的革兰氏阴性厌氧杆菌 ,用 16SrRNA聚合酶链反应 (PCR)方法鉴定为中间普氏菌的菌株 ,保存并用溶血基因的相应引物检测该基因。结果 :5 7例慢性成人牙周炎患者中 ,2 0例检出中间普氏菌 ,检出率为 35 1%。 35株中间普氏菌的临床分离株中 ,5株能够检测到溶血基因 ,另外 30株不能检测到溶血基因。结论

迟缓爱德华菌溶血相关基因的测序和初步的功能分析

溶血素是迟缓爱德华菌 (Edwardsiellatarda简称ET)的重要致病因子。用鸟枪法从ET 1 2菌的染色体中克隆到 1株含有溶血活性的克隆子 ,经测定其序列的大小为 42 64bp ,和已报道的ET两种溶血素基因无同源性 ,其中开放阅读框 3(ORF3) 42 4bp序列和伤寒沙门氏菌溶血调控基因 (slyA)序列有 68%同源性。含有完整的ORF3的亚克隆子有溶血性 ,而卡那霉素基因插入ORF3内的酶切位点 ,其转化子无溶血性。斑点杂交和Southernblot证实 ,该基因片段来源于供体菌ET 1 2 ,而且也存在于其他ET菌染色体上 ,但这些ET菌表型不一定溶血。含有溶血相关基因重组质粒的大肠杆菌 (Escherichiacoli简称E .coli)JM1 0 9、E .coliLE392有溶血现象。含有溶血相关基因重组质粒的ET菌 ,不一定有溶血现象。该基因不是溶血素结构基因 。

新的迟缓爱德华菌溶血相关基因的检测

目的 检测新的溶血相关基因 (eha)在迟缓爱德华菌 (ET)染色体上的分布。方法 PCR扩增部分溶血相关基因 ,制成地高辛探针与 2 6株ET菌进行斑点杂交和Southernblot。结果 新的ET溶血相关基因以单拷贝形式存在于一部分ET菌染色体上 ,且这部分ET菌表型既有溶血 ,也有不溶血。

迟缓爱德华氏菌新的溶血活化基因功能的研究

目的 探讨新的迟缓爱德华氏菌溶血活化基因 (eha)的功能。方法 PCR扩增部分溶血活化基因 ,制成地高辛探针和 2 6株Et菌进行斑点杂交和Southernblot。结果 新的迟缓爱德华氏菌 (Et)溶血活化基因以单拷贝形式存在于一部分Et菌染色体上 ,且pED10 2菌的Vero细胞毒和溶血活性作用主要位于胞浆蛋白和胞隙蛋白中。将有溶血活化基因的 pED10 2重组质粒电击入不溶血的Et菌和大肠杆菌 (LE3 92、JM 10 9) ,Et菌仍无溶血现象 ,大肠杆菌有溶血现象。结论 eha基因不是溶血素结构基因 。

枯草芽孢杆菌溶血相关基因yqxC的表达及功能鉴定

【目的】确定枯草芽孢杆菌溶血相关基因yqxC的功能。【方法】采用PCR方法,扩增枯草芽孢杆菌溶血相关基因yqxC,构建GST融合表达载体,并在大肠杆菌中进行表达。使用含体积分数5%绵羊血的琼脂平板,检测可溶性融合蛋白GST-YqxC的溶血活性。此外,采用RT-PCR检测yqxC基因在枯草芽孢杆菌中的转录情况。【结果】获得的可溶性融合蛋白GST-YqxC,在绵羊血琼脂平板上显示出较强的溶血活力;通过RT-PCR,检测到yqxC基因可以在枯草芽孢杆菌中转录。【结论】枯草芽孢杆菌yqxC基因编码蛋白YqxC有较强的溶血活性,且能够发生转录,yqxC很可能是引起枯草芽孢杆菌溶血的基因之一。

牛分枝杆菌溶血磷脂酶基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

为研究牛分枝杆菌(M.bovis)溶血磷脂酶基因在致病机理中的作用,本研究构建了表达M.bovis的溶血酶(LIP)基因的重组质粒pET30a-LIP,经IPTG诱导在大肠杆菌BL21(DE3)中高效表达,SDS-PAGE分析表明,重组蛋白表达量占菌体总蛋白的20%;该蛋白经电洗脱纯化后,纯度达95%以上;免疫印迹实验表明,原核表达的蛋白可与兔抗牛分枝杆菌多克隆抗体结合,具特异的免疫反应性。

水稻溶血磷脂酸酰基转移酶基因(LPAT)家族生物信息学分析及在籽粒油脂合成中的作用

【目的】挖掘水稻溶血磷脂酸酰基转移酶(Lysophosphatidic acid acyltransferase,LPAT)基因家族成员信息,分析其生物信息学特征及在水稻籽粒油脂合成中的作用。【方法】通过生物信息学分析,对OsLPAT基因家族进行基因结构、系统进化树、组织表达谱以及激素和逆境表达谱等分析。利用比较代谢组和转录组学的方法,分析OsLPAT家族各成员在水稻籽粒油脂合成中的作用。【结果】水稻基因组中LPAT家族包含5个成员,分别命名为OsLPAT1~OsLPAT5。除OsLPAT1外,其他成员均含有4~6个外显子,且各成员均包含Acyltransferase C-terminus(PF01553)结构域;进化分析显示,LPAT基因在单子叶植物中较为保守;OsLPAT2的表达受多种逆境条件及激素诱导,OsLPAT3和OsLPAT5的表达受到脱落酸(Abscisic acid,ABA)的强烈诱导,而OsLPAT4则特异性地受到渗透胁迫的诱导;比较代谢组和转录组学分析显示,OsLPAT家族各成员分别在籽粒发育的不同阶段发挥功能,从而促进油脂(Triacylglycerol,TAG)合成。【结论】水稻基因组中存在5个LPAT基因,其表达受到不同激素的诱导,可能在水稻激素响应过程中发挥作用。该家族成员参与了不同发育阶段籽粒中的油脂前体磷脂酸(Phosphatidic acid,PA)的合成,从而正调控籽粒中的油脂合成。

双重PCR检测海产品中携带trh毒力基因副溶血性弧菌的研究

为建立有效鉴别副溶血性弧菌及携带耐热相关溶血毒素基因的毒性弧菌的方法,用副溶血性弧菌种属特异性基因tlh及毒性基因trh设计引物进行双重PCR检测,对双重PCR体系进行优化,并对其特异性及PCR灵敏度进行检测,验证双重PCR体系检测能力及对人工污染样品的灵敏度。结果表明,该方法对海产品中的副溶血性弧菌及携带trh毒性基因的弧菌具有检测特异性,且灵敏度较高,可为食品检测提供一定的参考依据。

副溶血弧菌LAMP检测方法的建立

副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)是一种能引起食源性疾病的重要病原菌。首次将一种新颖的核酸扩增技术-环介导等温扩增技术(loop-mediatedisothermalamplification,LAMP)应用于副溶血弧菌的快速检测。针对副溶血弧菌不耐热溶血毒素基因(tlh)设计4条特异性引物(两条内引物和两条外引物)进行LAMP扩增,对扩增反应进行优化,最佳反应时间为60min,反应温度为60℃。对12种细菌共28株菌进行LAMP扩增,仅14株副溶血弧菌得到阳性扩增结果,证明引物具有很高的特异性。副溶血弧菌基因组DNA和纯培养物的检测灵敏度分别约为90fg和24cfu/ml。对模拟食品样品进行直接检测,检测限为89cfu/g。结果表明,该方法检测副溶血弧菌特异性强、灵敏度高,并且操作简便、检测成本低,1小时即可完成,有望发展成为快速检测副溶血弧菌的有效手段。

用基于TaqMan探针的Real-time PCR技术定量检测副溶血弧菌

副溶血弧菌是一种引起食源性疾病的重要病原菌,传统的鉴定方法费时费力且容易出现假阴性,建立一种定量检测副溶血弧菌基因的方法尤为重要。根据GenBank公布的副溶血弧菌的gyrB基因序列设计一对引物和TaqMan探针,建立了基于TaqMan探针的RealtimePCR方法。通过对9种细菌(12株菌株)的DNA进行扩增,结果所有4株副溶血弧菌均可产生扩增曲线,其他8株非副溶血弧菌均不产生扩增曲线,证明了引物和探针具有很高的特异性。细菌纯培养物品和人工布菌的检测敏感度分别为1CFUPCR反应体系和10CFUPCR反应体系,相关系数均为0.99(r2=0.99),整个试验可在1h内完成。建立的方法可用于海产品中副溶血弧菌的快速定量检测。

迟缓爱德华菌溶血活化蛋白EHA的原核表达及生物学活性

目的研究迟缓爱德华菌(Et)溶血活化基因(eha)原核表达蛋白EHA的生物学特性。方法构建重组载体pET28a+-eha,转入大肠埃希菌BL21,得到克隆子pEHA1。克隆子pEHA1超声破碎后离心,上清用SDS-PAGE电泳分析。在不同条件下,IPTG诱导pEHA1菌表达EHA蛋白,该蛋白经Ni-NTA亲和层析柱纯化后,检测其溶血活性及Vero细胞毒性。结果测序结果表明,pET28a+-eha重组质粒的eha序列完全正确。SDS-PAGE电泳显示表达出一条17kDa左右的条带。在30℃,IPTG浓度为0.5mmol/L的情况下,克隆子pEHA1被诱导6h产生的蛋白量最多。纯化的EHA蛋白无溶血活性及Vero细胞毒性。结论eha基因不是溶血素结构基因,可能是一个调控基因。

Hhip和Lpar2基因表达与胃癌相关性的研究进展

胃癌(gastric cancer,GC)是源于胃粘膜上皮细胞的恶性肿瘤,近年来研究表明Hhip与Lpar2基因在GC的发生发展中分别发挥着抑制和促进的作用,Hhip基因通过参与Hh信号通路抑制GC细胞的增殖与侵袭,而Lpar2基因通过激活ATX-LPA信号通路促进GC的发生发展.本文就Hhip与Lpar2基因在GC患者中的表达水平变化、相关分子机制及未来在临床上的应用作一综述.

副溶血弧菌tdh基因LAMP检测技术的建立

环等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)是一种在等温条件下高特异性、高效、快速地扩增靶基因的DNA扩增技术。根据副溶血弧菌特异性的毒力基因tdh保守序列,本文设计1套特异性引物对该基因进行环等温扩增,同时对反应条件进行优化,建立携带tdh基因的致病性副溶血弧菌的LAMP快速检测技术。结果表明,LAMP最适反应在60.8℃恒温、45min内完成,与其它常见的细菌无交叉反应。LAMP方法的细菌DNA最低检出限为35.5fg/反应管,灵敏度较PCR方法高10倍。对扇贝样品中分离的菌株的检测表明,LAMP方法对检测致病性副溶血弧菌具有良好的可靠性。

应用多重实时荧光PCR方法检测副溶血性弧菌及其毒力基因

目的应用多重实时荧光PCR方法检测113株食物中毒副溶血性弧菌分离株多种毒力基因携带情况。方法用水煮法提取菌株DNA后,利用四重实时荧光PCR方法对DNA同时进行4种基因的检测。结果所有的菌株均携带tlh基因,96株菌株（84.96%）携带tdh基因,9株菌株（7.96%）携带trh基因及62株菌株（54.87%）携带orf8基因的菌株同时tdh基因检测为阳性,无同时携带trh基因和orf8基因的菌株。trh、tdh基因和orf8基因阳性的菌株分布在O1-O4血清群。结论本市大部分食物中毒菌株携带除tlh基因外的1种或1种以上的毒力基因,一半以上的菌株为大流行株;四重实时荧光PCR方法可以同时鉴定和检测副溶血性弧菌及毒力基因,建议作为食源性暴发事件的常规检测方法,获得更快速、准确、完整的结果。

双重PCR检测副溶血性弧菌的tlh和tdh基因方法建立与初步应用

目的建立同时检测副溶血性弧菌的tlh和tdh基因的双重聚合酶链式反应(PCR)法。方法根据副溶血性弧菌的tlh、tdh基因序列设计引物,进行PCR扩增及电泳检测。同时优化反应体系,测定稳定性、重复性、特异性及灵敏度。结果本实验设计的引物能特异性地扩增副溶血性弧菌的450、269 bp的片段,而对其它种类的菌物无特异性扩增,结果表明该方法特异性好,双重PCR检测灵敏度为100 cfu/ml。并进行了肛门拭子样品的检测。结论初步建立能在8 h内快速、灵敏、特异地检出副溶血性弧菌毒力菌株的双重PCR技术。

上海市售海产品中副溶血性弧菌的分布状况

海产品中副溶血性弧菌引起的食物中毒已成为我国沿海地区细菌性食物中毒的首要病原。本研究中针对上海市闵行区某农贸市场的海产品开展为期1年的调查分析,共采集257份样品。按照国家标准(GB/T4789.7-2008),以硫代硫酸钠柠檬酸胆盐蔗糖培养基(TCBS)和科玛嘉弧菌显色培养基(CV)两种选择性培养基辅助分离副溶血性弧菌疑似菌株,结合生化试验和PCR方法对疑似菌株进行鉴定,从84份阳性样本中获得107株副溶血性弧菌分离株。其结果表明:该农贸市场市售海产品中副溶血性弧菌的污染率为32.7%,其中牡蛎中副溶血性弧菌污染率最高(达54.4%),蛤蜊和海瓜子次之(分别为33.9%,25.6%)。牡蛎中副溶血性弧菌的污染水平与季节性变化直接相关。对107株分离株的主要毒力基因tdh和trh进行PCR筛查,tdh阳性菌株为10株,trh阳性菌株为1株,并且此株菌为tdh、trh双阳性菌株,tdh和trh的携带率分别为9.4%和1.0%,tdh、trh双基因的携带率为1.0%。结论:市售海产品中副溶血性弧菌污染状况较为严重。这为政府相关职能部门开展食品安全防控提供了参考依据。