双重PCR检测海产品中携带trh毒力基因副溶血性弧菌的研究

为建立有效鉴别副溶血性弧菌及携带耐热相关溶血毒素基因的毒性弧菌的方法,用副溶血性弧菌种属特异性基因tlh及毒性基因trh设计引物进行双重PCR检测,对双重PCR体系进行优化,并对其特异性及PCR灵敏度进行检测,验证双重PCR体系检测能力及对人工污染样品的灵敏度。结果表明,该方法对海产品中的副溶血性弧菌及携带trh毒性基因的弧菌具有检测特异性,且灵敏度较高,可为食品检测提供一定的参考依据。

副溶血弧菌LAMP检测方法的建立

副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)是一种能引起食源性疾病的重要病原菌。首次将一种新颖的核酸扩增技术-环介导等温扩增技术(loop-mediatedisothermalamplification,LAMP)应用于副溶血弧菌的快速检测。针对副溶血弧菌不耐热溶血毒素基因(tlh)设计4条特异性引物(两条内引物和两条外引物)进行LAMP扩增,对扩增反应进行优化,最佳反应时间为60min,反应温度为60℃。对12种细菌共28株菌进行LAMP扩增,仅14株副溶血弧菌得到阳性扩增结果,证明引物具有很高的特异性。副溶血弧菌基因组DNA和纯培养物的检测灵敏度分别约为90fg和24cfu/ml。对模拟食品样品进行直接检测,检测限为89cfu/g。结果表明,该方法检测副溶血弧菌特异性强、灵敏度高,并且操作简便、检测成本低,1小时即可完成,有望发展成为快速检测副溶血弧菌的有效手段。

应用多重实时荧光PCR方法检测副溶血性弧菌及其毒力基因

目的应用多重实时荧光PCR方法检测113株食物中毒副溶血性弧菌分离株多种毒力基因携带情况。方法用水煮法提取菌株DNA后,利用四重实时荧光PCR方法对DNA同时进行4种基因的检测。结果所有的菌株均携带tlh基因,96株菌株（84.96%）携带tdh基因,9株菌株（7.96%）携带trh基因及62株菌株（54.87%）携带orf8基因的菌株同时tdh基因检测为阳性,无同时携带trh基因和orf8基因的菌株。trh、tdh基因和orf8基因阳性的菌株分布在O1-O4血清群。结论本市大部分食物中毒菌株携带除tlh基因外的1种或1种以上的毒力基因,一半以上的菌株为大流行株;四重实时荧光PCR方法可以同时鉴定和检测副溶血性弧菌及毒力基因,建议作为食源性暴发事件的常规检测方法,获得更快速、准确、完整的结果。

副溶血弧菌tdh基因LAMP检测技术的建立

环等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)是一种在等温条件下高特异性、高效、快速地扩增靶基因的DNA扩增技术。根据副溶血弧菌特异性的毒力基因tdh保守序列,本文设计1套特异性引物对该基因进行环等温扩增,同时对反应条件进行优化,建立携带tdh基因的致病性副溶血弧菌的LAMP快速检测技术。结果表明,LAMP最适反应在60.8℃恒温、45min内完成,与其它常见的细菌无交叉反应。LAMP方法的细菌DNA最低检出限为35.5fg/反应管,灵敏度较PCR方法高10倍。对扇贝样品中分离的菌株的检测表明,LAMP方法对检测致病性副溶血弧菌具有良好的可靠性。

双重PCR检测副溶血性弧菌的tlh和tdh基因方法建立与初步应用

目的建立同时检测副溶血性弧菌的tlh和tdh基因的双重聚合酶链式反应(PCR)法。方法根据副溶血性弧菌的tlh、tdh基因序列设计引物,进行PCR扩增及电泳检测。同时优化反应体系,测定稳定性、重复性、特异性及灵敏度。结果本实验设计的引物能特异性地扩增副溶血性弧菌的450、269 bp的片段,而对其它种类的菌物无特异性扩增,结果表明该方法特异性好,双重PCR检测灵敏度为100 cfu/ml。并进行了肛门拭子样品的检测。结论初步建立能在8 h内快速、灵敏、特异地检出副溶血性弧菌毒力菌株的双重PCR技术。

上海市售海产品中副溶血性弧菌的分布状况

海产品中副溶血性弧菌引起的食物中毒已成为我国沿海地区细菌性食物中毒的首要病原。本研究中针对上海市闵行区某农贸市场的海产品开展为期1年的调查分析,共采集257份样品。按照国家标准(GB/T4789.7-2008),以硫代硫酸钠柠檬酸胆盐蔗糖培养基(TCBS)和科玛嘉弧菌显色培养基(CV)两种选择性培养基辅助分离副溶血性弧菌疑似菌株,结合生化试验和PCR方法对疑似菌株进行鉴定,从84份阳性样本中获得107株副溶血性弧菌分离株。其结果表明:该农贸市场市售海产品中副溶血性弧菌的污染率为32.7%,其中牡蛎中副溶血性弧菌污染率最高(达54.4%),蛤蜊和海瓜子次之(分别为33.9%,25.6%)。牡蛎中副溶血性弧菌的污染水平与季节性变化直接相关。对107株分离株的主要毒力基因tdh和trh进行PCR筛查,tdh阳性菌株为10株,trh阳性菌株为1株,并且此株菌为tdh、trh双阳性菌株,tdh和trh的携带率分别为9.4%和1.0%,tdh、trh双基因的携带率为1.0%。结论:市售海产品中副溶血性弧菌污染状况较为严重。这为政府相关职能部门开展食品安全防控提供了参考依据。