溶血素 E基因原核表达载体的构建与蛋白诱导表达

目的构建大肠杆菌(Escherichia Coli,E.coli)溶血素E(Hemolysin E)基因的重组质粒pCZN1-hlyE,诱导表达目的蛋白。方法通过NCBI数据库检索获取E.coli Hemolysin E基因序列(NC_000913.3),采用基于PAS(PCR-based Accurate Synthesis)的全基因合成法,设计全长拼接引物,合成目的基因,并成功构建重组质粒pCZN1-hlyE。将构建好的pCZN1-hlyE重组质粒转入大肠杆菌TOP10菌株中,并用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导Hemolysin E基因的表达,生成Hemolysin E毒力蛋白。结果经SDS-PAGE凝胶电泳,Western blot分析鉴定目的蛋白Hemolysin E分子量为28.72 kDa,与Hemolysin E基因核酸序列经DNAMAN软件分析所得蛋白分子量一致。结论被诱导表达的Hemolysin E蛋白存在于菌体裂解液上清中,并纯化制备重组蛋白。

水生动物病原菌Ⅵ型分泌系统(T6SS)及其溶血素共调节蛋白研究进展

Ⅵ型分泌系统(typeⅥsecretion system,T6SS)是多种革兰氏阴性菌编码的蛋白分泌装置,在毒力因子释放、生物被膜形成、铁离子摄取、囊泡运输、环境压力适应性及细菌胞内存活等方面发挥着重要功能,在副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)、哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)、嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)和迟钝爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)等水生动物病原菌的致病过程中发挥着关键作用。然而,有关水生动物病原菌T6SS组分及其功能的报道还比较匮乏。本文对几种水生动物病原菌T6SS的生物学功能与调控机理,以及T6SS关键调控因子溶血素共调节蛋白Hcp的系统进化关系与功能等最新研究情况进行了综述,并在水生动物病原菌T6SS的生物学功能、T6SS活性调控与环境因素的关联性、T6SS与致病菌代谢之间的调控关系等方面提出未来研究建议,以期为进一步开展水生动物致病机制研究及水产养殖细菌病的防控提供新思路。

副溶血性弧菌不耐热溶血素的生物信息学分析与分子动力学模拟

副溶血性弧菌是一种革兰氏阴性人畜共患致病菌,可引发人类胃肠炎等食源性疾病。副溶血性弧菌具有多种毒力因子,热不稳定溶血素(thermolabile hemolysin,TLH)即是其中之一。该研究对副溶血性弧菌的tlh基因进行了克隆及测序,对tlh基因编码的TLH蛋白进行了生物信息学分析及结构和功能预测。结果表明,TLH蛋白由418个氨基酸组成,预测分子质量为47.36 kDa。在TLH蛋白中确定了几个保守的结构域和基序,包括SGNH水解酶结构域和GDSL基序;对TLH蛋白的三维结构进行了同源建模及验证,在此基础上通过分子动力学模拟分析其稳定性、与4-硝基苯基月桂酸酯(p-nitrophenylaurate,PNPL)的相互作用能力及结合底物对结构紧密度和残基灵活性的影响,揭示了催化三联体Ser153-His390-Asp393周边是一个重要的药物靶点活性口袋,具有高度保守的残基序列,并在底物结合后表现出残基灵活性差异。该研究分析了副溶血性弧菌TLH蛋白的性质和结构,可以为保障水产品的安全性、提高水产品原料安全评价水平提供理论支持。

川乌水提取物及其单体成分对金黄色葡萄球菌α-溶血素分泌的抑制作用

目的探讨川乌水提取物及其单体成分对金黄色葡萄球菌α-溶血素分泌的抑制作用。方法采用转录组测序技术(RNAseq)分析川乌水提取物对金黄色葡萄球菌USA300 hla,psma,isda基因转录水平的影响。采用反转录-实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-qPCR)法测定川乌水提取物及质量浓度分别为0.01,0.1,1 mg/mL的乌头原碱、次乌头碱、新乌头碱单体成分对hla,psma,isda基因表达水平的影响,采用溶血定量试验考察溶血活性。采用免疫印迹(Western blot)法考察质量浓度分别为0.01,0.1,1 mg/mL的乌头原碱、次乌头碱、新乌头碱单体成分对金黄色葡萄球菌菌液上清液中α-溶血素分泌的影响。结果USA300经250 mg/mL川乌水提取物处理后,α-溶血素、δ-溶血素、酚溶性调节蛋白等毒力因子相关基因的表达均显著下调(P<0.005)。USA300经250 mg/mL川乌水提取物及1 mg/mL乌头原碱、次乌头碱、新乌头碱单体成分处理后,hla,psma,isda基因转录水平均受到显著抑制(P<0.05),其中对hla基因的抑制作用最显著;金黄色葡萄球菌的溶血活性均受到显著抑制(P<0.01)。USA300经0.01,0.1,1 mg/mL乌头原碱、次乌头碱、新乌头碱单体成分处理后,金黄色葡萄球菌菌液上清液中α-溶血素分泌量与乌头原碱呈浓度依赖性降低,但经次乌头碱、新乌头碱单体成分处理后的趋势不明显。结论川乌水提取物及其单体成分可抑制金黄色葡萄球菌中α-溶血素的分泌,尤其是单体成分乌头原碱有用于抗金黄色葡萄球菌感染的潜能。

霍乱弧菌溶血素共调节蛋白(Hcp)的原核表达、纯化及多克隆抗体制备

目的原核表达、纯化霍乱弧菌溶血素共调节蛋白(hemolysin coregulatory protein,Hcp),并制备其多克隆抗体。方法PCR扩增霍乱弧菌Hcp基因并克隆入pET28a载体中构建重组表达载体;将重组载体pET28a-hcp转化E.coil BL21(DE3)中,进行表达条件优化及表达形式鉴定。获取可溶性Hcp蛋白行Ni-NTA柱纯化,纯化的Hcp蛋白免疫BALB/c小鼠以制备多克隆抗体,并用间接酶联免疫吸附试验(ELISA)检测抗体效价,以评估其免疫原性。再以Western blot法分析抗体对霍乱弧菌Hcp蛋白的特异性识别。结果重组载体pET28a-hcp的酶切片段与预期相符,测序结果与GenBank数据库中hcp基因序列一致,成功构建pET28a-hcp重组质粒,重组质粒经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达相对分子量为28kD的目的蛋白;经Ni-NTA柱纯化后获得较纯的Hcp蛋白,免疫小鼠可获得效价为1∶512000的抗Hcp多克隆抗体(anti-Hcp);Western blot鉴定结果显示anti-Hcp具有识别霍乱弧菌Hcp蛋白的特异性。结论成功获得可溶形式表达的Hcp蛋白,免疫小鼠后获得高效价的抗Hcp多克隆抗体,为后续研究Hcp蛋白在非O1/非O139群霍乱弧菌T6SS致病过程中的作用奠定了基础。

新型溶血素在血常规检验中的应用优势探讨

研究新型溶血素在血常规检验中的应用优势。方法 择取在本院进行血常规检验的健康体检者100名,检验时间为2023年2月至3月。将所有健康体检者的血液标本分为两份,分别应用传统溶血素、新型溶血素进行血常规检验,对比检测时间、成本以及检验结果。结果 新型溶血素组的检测所用时间、成本分别为(24.05±3.43)min、(59.18±3.17)元,均少于传统溶血素组,HGB水平(132.28±7.46)g/L高于传统溶血素组,差异具有统计学意义(P<0.05);两种溶血素使用后的WBC、RBC、PLT以及HCT、MCV、MCH检测值数据相差不大,差异无统计学意义(P>0.05)。结论 在血常规检验中,新型溶血素会促使HGB水平升高,但通过相应措施进行干预能够进行矫正,且不会对WBC、RBC、PLT等指标产生影响,可提高检测效率以及减少检测费用。

单增李斯特菌溶血素LLS/LLO缺失株的构建及小鼠免疫保护性研究

旨在探究单增李斯特菌溶血素S/O(LLS/LLO)对单增李斯特菌(LM)的部分生物学特性影响及单增李斯特菌溶血素S/O基因缺失株的免疫原性。利用同源重组技术在本实验室已成功构建并保存的LM90SB2Δlls菌株基础上构建LM90SB2Δlls-Δllo,并绘制LM90SB2和LM90SB2Δlls-Δllo的生长曲线,测定半数致死量(LD_(50))、组织载菌量(同时采用灌服和腹腔注射方式)等,进行小鼠免疫保护性研究,分析溶血素基因llsB/hly缺失对LM的生长特性以及毒力的影响。结果:成功构建LM90SB2Δlls-Δllo缺失株,且能在体外稳定遗传。测定生长曲线,LM90SB2的生长活性略高于LM90SB2Δlls-Δllo;LM90SB2的LD_(50)为3.65×10^(7.23)CFU,LM90SB2Δlls-Δllo的LD_(50)大于2.7×10^(9)CFU;通过灌服及腹腔注射,与LM90SB2相比,LM90SB2Δlls-Δllo在小鼠脑、肝、脾中的载菌量均明显减少,差异极显著(P<0.01)。抗体含量除第21天亲本株略高于缺失株,其余天数缺失株均略高于亲本株;通过小鼠免疫保护率结果分析,2株菌免疫后小鼠存活率均为75%,对照组小鼠存活率为30%。本研究表明,llsB/hly基因缺失对LM90SB2的毒力有明显影响,但并不会影响LM的免疫原性,缺失株LM90SB2Δlls-Δllo对亲本株LM90SB2的侵袭具有良好的免疫保护效果。

巨噬细胞膜杂合脂质体的制备及抗创伤弧菌溶血素A的作用研究

目的以巨噬细胞膜和脂质体杂合,制备仿生纳米载体-巨噬细胞膜杂合脂质体,用于创伤弧菌溶血素A(VvhA)的清除及毒性抑制。方法提取巨噬细胞膜,通过薄膜挥发-挤出法与脂质体杂合,构建巨噬细胞膜杂合脂质体并进行表征;通过溶血实验和细胞毒性实验对杂合载体的体外解毒能力进行评价,小鼠皮肤感染模型来评价载体的解毒能力。结果体内外抗类毒素研究表明,巨噬细胞膜杂合脂质体的体外抗溶血率达到97.03%,能够有效抑制皮下感染小鼠的皮肤溃烂,并使腹腔感染小鼠的生存率达到80%。结论构建的巨噬细胞膜杂合脂质体对创伤弧菌外毒素VvhA引起的细胞及皮肤组织毒性具有良好的抑制作用。

新型溶血素与传统溶血素在临床血常规检验中的应用研究

目的对比研究新型溶血素与传统溶血素在临床血常规检验中的应用价值。方法选取2015年1~6月在本院进行健康体检的90例正常健康人作为研究对象,随机分为传统组和新型组（每组45例）,采集2组研究对象的血液样本,分别使用传统和新型溶血素进行血常规检验和结果比较。结果新型组与传统组的WBC、RBC、PLT水平比较,差异均无统计学意义（P〉0.05）;新型组的Hb水平为（129.59±7.85）g/L,高于传统组水平（123.54±5.42）g/L,P〈0.05。结论在临床血常规检验中,使用新型溶血素检测获得的WBC、RBC、PLT结果与传统溶血素相同,新型溶血素会使血红蛋白偏高,但由于误差在可控范围内,且可通过调整因数值予以纠正,从生物安全性和检测成本角度来看,新型溶血素用于血常规检验的优势更为明显。

广叶绣球菌溶血素基因的序列分析及表达动态

通过转录组测序获得了一个广叶绣球菌(Sparassis latifolia)编码的溶血素基因(latifolysin),进行生物信息学分析,并利用实时定量PCR分析溶血素基因表达水平,采用同位素标记相对和绝对定量(isobaric tags for relative and absolute quantification,iTRAQ)标记结合二维液相色谱串联质谱鉴定分析溶血素表达差异。结果表明latifolysin基因全长为399bp,编码133个氨基酸。保守功能域搜索显示latifolysin具有与杨树菇溶血素(aegerolysins)蛋白家族相同的结构域和功能位点,两者序列相似性40%。杨树菇溶血素家族蛋白在真菌中呈不连续性分布。系统进化树结果显示绣球菌溶血素隶属于担子菌类群,与草菇(Volvariella volvacea)遗传关系较近。实时定量PCR和蛋白定量结果表明,latifolysin和绣球菌溶血素在广叶绣球菌幼菇期表达量最高,且显著高于菌丝体中表达水平。

猪链球菌2型Ⅲ型溶血素的研究

为了探讨猪链球菌2型(Streptococcus suis serotype 2,SS2)的Ⅲ型溶血素是否具有溶血活性以及Ⅲ型溶血素在SS2致病过程中的作用,本研究利用同源重组基因敲除法成功构建了SS205ZY的Ⅲ型溶血素(slyrp)基因缺失突变菌株Δslyrp及双基因缺失突变菌株Δsly/Δslyrp,并比较了野生菌株和基因缺失突变菌株的溶血能力以及对小鼠的致病力。结果表明,slyrp基因敲除后可导致SS2裂解红细胞的能力有所下降,而双基因缺失突变菌株Δsly/Δslyrp的溶血能力完全丧失;slyrp基因敲除后对小鼠的致病力没有影响。结果提示猪链球菌2型Ⅲ型溶血素具有一定的溶血能力,该Ⅲ型溶血素在SS2感染过程中,对溶血素(sly)起协同作用,不是SS2主要的毒力相关基因。

临床血常规检验中新型溶血素与传统溶血素的对比分析

目的研究对比临床上血常规检验(Blood-RT)中新型的溶血素与传统的溶血素。方法选取2016年3—9月于本院进行治疗的50例健康体检者为本次研究的对象,采集血液标本,将采集的每位受试者的血液标本平均分成两份,分别记为观察组和对照组。对照组使用传统的溶血素行Blood-RT,观察组使用新型的溶血素行Blood-RT,观察并比较两组血液标本中血红蛋白(HGB)、白细胞(WBC)、红细胞(RBC)及血小板(PLT)的含量,以及两组的检测时间和检测成本。结果观察组的HGB水平明显高于对照组,而WBC,RBC,PLT水平明显低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。观察组的检测时间和检测成本明显低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论使用新型溶血素可以较好地影响WBC,RBC,PLT,HGB的含量,有助于临床检测,值得推广。

猪链球菌2型江苏分离株溶血素基因检测及序列分析

根据猪链球菌2型(Streptococcus suis type 2)溶血素基因(sly)设计和合成了一对可扩增其完整阅读 框的引物,对HA9801等6株猪链球菌2型江苏分离株,1株德国分离株SS2-D及猪链球菌C群参考株 ATCC35246的核酸进行PCR扩增,结果显示HA9801等6株江苏分离株及德国株SS2呈阳性,ATCC35246 呈阴性。HA9801株PCR产物纯化后测序,序列分析表明该DNA片段与猪链球菌2型1933株的sly基因同源 性为99％。

新型溶血素和传统溶血素在血常规检验中的临床应用效果观察

分析新型溶血素和传统溶血素在血常规检验中的临床应用效果。选取2015年1月~2016年1月在我院进行健康体检人群500例。随机分为常规组和观察组各250例。两组人群均行血常规检验,其中常规组采取传统溶血素进行检验,观察组采取新型溶血素进行检验,对比两组检验结果。观察组血红蛋白含量显著高于常规组,差异有统计学意义(P<0.05),两组白细胞计数与血小板计数比较无明显差异(P>0.05)。在血常规检验中采取新型溶血素进行检验将使得血红蛋白的含量明显偏高,但是可采取相应的措施给予纠正,且新型溶血素具有更高的生物安全性与较低的检测成本。

新型溶血素和传统溶血素在血常规检验中的应用对比

目的探讨新型溶血素和传统溶血素在血常规检验中的临床应用效果。方法选取2014年1月~2015年4月期间进行体检的64例健康者,将患者随机分为对照组和观察组,分别采用传统溶血素和新型溶血素进行血常规检验,对两种溶血素的临床应用效果进行比较。结果对照组和观察组的白细胞计数、血小板计数差异无统计学意义（P〉0.05）,观察组血红蛋白显著高于对照组,差异有统计学意义（P〈0.05）。结论采用传统溶血素进行血常规检验的准确性较高,采用新型溶血素进行血常规检验会使得血红蛋白的水平明显偏高,因此需要进行纠正。

新型溶血素与传统溶血素在临床血常规检验中的应用研究

目的:评价并研究新型溶血素和传统溶血素在临床血常规检验当中应用的价值。方法:本研究选择采用对比分析的方法进行调查,所有研究对象为2016年3月至2017年8月本院接收的血常规质控标本,本研究共计选择53份作为研究对象,分别对其采用新型溶血素和传统溶血素方法,在相同条件下对相关指标进行检验,主要检测Hb、WBC以及PLT,并且对分析结果进行测定。结果:比较新型溶血素和传统溶血素在血常规检验方面的价值,从Hb、WBC以及PLT角度来说,两种方法的检验存在差异性,P<0.05,具有统计学意义;新型溶纤素对于WBC以及PLT检验结果没有产生严重的影响。结论:和传统溶血素进行比较,新型溶血素的重复性相对较差而且会对Hb的检测结果产生较大的影响,能够通过对因数的调整进行纠正,临床对此应该予以足够的关注和重视。

日本对虾溶血素的活性测定及性能研究

于1997年10－11月，以青岛市红岛养殖场养殖的日本对虾为材料，采用分光光度法对其血淋巴中的溶血素进行活性检测，研究多种理化因子对其溶血性能的影响，以及日本对虾溶血素经细菌和虫草多糖肌肉注射刺激后的活性变化。结果表明，日本对虾溶血素的活性同对虾的健康状况密切相关。该溶血累经60℃以下处理溶血作用有所增强，在pH=5－9时溶血活性最高，Ca2＋、Fe2＋可增强溶血作用。注射大肠杆菌（2×107cells／尾）和虫草多糖能够诱导日本对虾溶血素的产生，使溶血活性有所提高；而注射哈维氏弧菌（7×107cells／尾）会导致对虾发病，降低溶血素的活性。

鳗源嗜水气单胞菌β-溶血素基因的克隆及表达

应用PCR技术,从1株鳗源嗜水气单胞菌ML316中扩增得到β 溶血素基因AHL316HEM,将AHL316HEM克隆到pGEM TEasyVector,经分析验证后重组到pcDNA3.0中,构建了重组质粒PDLH。转化重组质粒PDLH的大肠杆菌(Escherichiacoli)DH5α能在血琼脂培养皿中形成明显的β 溶血斑,重组菌纯化的胞外产物溶血价为1.28×104HU·mg-1,同时重组菌的胞外产物能被原始菌株的高免血清特异性地识别。结果证实,克隆到鳗源嗜水气单胞菌β 溶血素基因,重组质粒PDLH能够表达具有天然生物学活性的β 溶血素,为构建嗜水气单胞菌核酸疫苗奠定了基础。

致病性哈维氏弧菌溶血素基因克隆及其检测

从山东沿海的发病鲈鱼（Lateolabrax japonicus）分离到1株致病性哈维氏弧菌（Vibrio harveyi），从该菌的染色体DNA扩增出一条长约1．4kb的特异性片段。DNA序列分析表明，该克隆片段含有完整的1254bp溶血素基因，该溶血素基因与哈维氏弧菌VIB645的溶血素基因VhhA和VhhB的相似性分别为99．0％和98．5％；与副溶血弧菌（V．parahaemolyticus）热稳定性溶血素基因（TDH）的相似性为74．5％；与拟态弧菌（V．mimicus）、创伤弧菌（V．vulnificus）、霍乱弧菌（V．chderae）磷脂酶基因的序列相似性分别为57．4％、59．2％、53．0％；与最小弧菌、创伤弧菌、霍乱弧菌、霍氏弧菌（V．hollisae）、河流弧菌（V．tguvialis）、鳗弧菌（V．anguillarum）的溶血素基因的相似性仅为19．9％～24．8％。根据溶血素基因的保守区段，设计了1对特异引物。分析表明，该引物能特异检测哈维氏弧菌。其可检测的DNA最小量为0．001ng。用该方法对55株不同来源的患病鱼分离的疑似病原菌进行检测，结果检出8株哈维氏弧菌，检出率为14．55％，从健康动物中检出数占所检弧菌数的6．25％，海洋环境为10．53％，海水养殖环境为26．53％，表明哈维氏弧菌在不同的海水环境及健康海洋动物中普遍存在，在养殖水体中的数量高于其他海水环境。