赖型钩端螺旋体溶血素HlyX基因的克隆、表达及其细胞毒效应

目的:克隆、表达HlyX基因并研究其细胞毒性效应。方法:从赖型钩端螺旋体017株全基因组中用PCR方法扩增出目的基因,双酶切构建重组质粒,转化E.coliJM109,诱导表达HlyX;将表达的目的蛋白免疫新西兰大白兔,制备多克隆抗体,Western blotting鉴定其免疫原性;将目的蛋白纯化、复性后作用于ECV304细胞,通过检测ECV304细胞乳酸脱氢酶(LDH)和一氧化氮(NO)的释放量研究目的蛋白的细胞毒性效应。结果:扩增出1179bp的目的基因HlyX,重组质粒经双酶切、PCR鉴定,测序结果表明重组质粒构建成功。经IPTG诱导表达的融合蛋白约64kD,主要以包涵体的形式表达,经免疫动物得到多克隆抗体,ELISA检测效价达1∶64000;Western blotting鉴定在目的蛋白的位置处有特异性阳性条带。经过HlyX融合蛋白作用的ECV304细胞LDH和NO释放量明显高于对照组(P<0.01)。结论:HlyX能在大肠杆菌中表达,表达的目的蛋白对细胞有毒性效应。

2型猪链球菌溶血素及其抗血清的免疫保护活性研究

目的探讨2型猪链球菌(SS2)溶血素(SLY)及其抗血清的免疫保护活性。方法以纯化的SLY重组蛋白作为免疫原免疫小鼠,收集抗血清,测定抗血清的效价及其中的IgG亚型,用致死剂量的SS2强毒株攻击小鼠,评价SLY的免疫保护活性。制备SLY抗血清并以其被动免疫小鼠,4h后用致死剂量的SS2强毒株攻击小鼠,评价抗血清的保护作用。结果用重组蛋白SLY免疫小鼠后收集抗血清,效价为1∶25 600,含IgG1和IgG2a两种亚型抗体,但IgG1与IgG2a的含量差异不显著。用致死剂量的SS2强毒株攻击小鼠14d后,SLY主动免疫组小鼠的存活率(60%)明显高于对照组(10%,P<0.05);SLY抗血清被动免疫组小鼠在SS2强毒株攻击7d后的存活率(90%)明显高于对照组(20%,P<0.05),攻击后14d,抗血清被动免疫组存活率(40%)与对照组(20%)差异不显著(P>0.05)。结论 SLY及其抗血清具有免疫保护活性。

肠球菌溶血素的表型及基因型检测

目的探讨影响肠球菌溶血素检测的因素,提高肠球菌溶血素检测的准确性。方法分别用兔血、人血、绵羊血检测48株肠球菌的溶血素表型,比较其检出率;用PCR检测溶血性肠球菌的溶血素cylA基因片段;对129株肠球菌同时进行溶血素表型(兔血检测)及基因型的检测,比较其检出率的差异。结果兔血、人血的肠球菌溶血素检出率分别为41.7%和35.4%,而绵羊血的肠球菌溶血素检出率为0(P<0.01);14.06%cylA基因阳性菌株未出现相应表型,6.78%溶血表型阳性菌株PCR未检测到溶血素cylA基因。结论兔血及人血对肠球菌溶血素较敏感,绵羊血对肠球菌溶血素不敏感;溶血素表型及基因型的检测不完全相符;对肠球菌溶血素同时进行表型及基因型的检测,能提高肠球菌溶血素检测的准确性。

肺炎球菌溶血素基因的克隆

目的应用基因工程技术克隆肺炎球菌溶血素(pneumolysin,Pn)基因,为研制中耳炎蛋白多糖结合疫苗奠定基础。方法根据Walker等肺炎球菌溶血素基因序列(GenBankaccessionno.X52474),设计一对各带有一个限制性酶切位点的引物,运用PCR从肺炎球菌的染色体DNA扩增出肺炎球菌溶血素基因。对该PCR产物进行酶切、回收,并将其克隆入表达载体pET-28a,然后转化至大肠杆菌JM109(DE3)宿主细胞中。结果通过常规基因克隆方法和PCR技术,成功构建重组体,酶切鉴定和基因测序证实构建正确。结论利用基因工程技术成功克隆了肺炎球菌溶血素基因。

创伤弧菌溶血素基因的高效表达与鉴定

目的:构建创伤弧菌溶血素基因(vvc)的融合表达载体,并实现创伤弧菌溶血素在大肠杆菌中的高效表达.方法:用一对创伤弧菌溶血素基因特异性引物从创伤弧菌基因组DNA中钓取vvc基因,T-A克隆后测定核苷酸序列,构建pET-32 a(+)-vvc融合表达载体,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,表达产物行SDS-PAGE并进行W est-ern B lot鉴定.结果:构建了pET-32 a(+)-vvc融合表达载体,DNA测序证明,获得的vvc基因长度为1311 bp,与Gen-Bank中报道的创伤弧菌溶血素基因序列完全一致.SDS-PAGE分析表明,vvc融合蛋白Mr为71×103,其表达量约占菌体总蛋白的32%.Western blot结果显示,目的蛋白可与创伤弧菌免疫后的小鼠血清特异性结合.结论:成功地实现了VVC基因在大肠杆菌中的高效表达,为进一步研究vvc蛋白的生物学功能奠定基础.

副溶血弧菌不耐热溶血毒素tlh基因的序列分析

目的利用PCR技术扩增副溶血弧菌不耐热溶血毒素tlh基因,对tlh基因进行生物信息学分析。方法利用PCR技术扩增tlh基因,克隆至载体pET32a+并测序。将测序结果提交国际互联网上有关生物信息网站进行生物信息学分析。结果和结论测序结果tlh14-90被GenBank收录,登录号为AY289609。tlh14-90全长1 257 bp,与国际标准株WP1的同源性为99%,含有启动子和密码子,预测其编码一个含418个氨基酸的蛋白质(TLH14-90),分子式为C2131H3184N548O649S16, 相对分子质量47 392.9,理论等电点pI为4.92,丙氨酸、亮氨酸和天冬酰氨的含量分别为11.0%、7.4%和7.2%,含有4个半胱氨酸(Cys),κ-D法推算的疏水性参数为-34。预测其二级折叠结构为α/□蛋白,三级结构未给出。

溶血性、非溶血性肠球菌的毒力差异

目的 探讨肠球菌溶血素与毒力的关系。方法 比较溶血性肠球菌在临床标本及健康人群粪便标本的检出率；比较溶血性、非溶血性肠球菌对小鼠的LD50及其对9种抗生素的敏感性。结果 临床标本肠球菌的溶血素检出率61．5％，高于健康人群粪便标本（18．4％，P〈0．05）；溶血性肠球菌的LD50[（3．9～11）×10^8cfu／mL]比非溶血性肠球菌小[（2．5～8．9）×10^10cfu／mL，P〈0．01]。除丁胺卡那、万古霉素外，溶血性肠球菌对抗生素的耐药性明显高于非溶血株。结论 肠球菌的溶血素可能与其毒力有关。

A组溶血性链球菌抗DNA酶B抗体检测的临床应用价值探讨

应用微量法检测抗DNA酶B ,以探索其在A组溶血性链球菌感染所致疾病中的临床应用价值 ,同时用乳胶凝集法检测抗链球菌溶血素O (ASO)。结果显示 :风心组、急性肾小球肾炎组抗DNA酶B阳性率分别为 86 .5 %和 90 .7% ,显著高于ASO阳性率 5 1.9%、5 5 .8% (P <0 .0 5 )。而两者联合检测阳性率在 90 %以上。风湿热组、咽炎扁桃体炎组抗DNA酶B阳性率分别为 73 .5 %和 2 8.8% ,虽和ASO (6 7.6 % ,38.5 % )差异无显著性 (P >0 .0 5 ) ,但两者联合检测阳性率可达88.2 %和 5 7.7%。提示抗DNA酶B对急性肾小球肾炎、风湿热、风心病的诊断有重要的临床价值。ASO联合抗DNA酶B检测可提高A组溶血性链球菌的检出率 。

环介导等温扩增技术快速检测副溶血性弧菌

目的建立一种检测副溶血性弧菌(Vp)快速且特异的环介导等温扩增(LAMP)检测方法。方法针对副溶血性弧菌不耐热溶血素(tlh)基因特异性序列的6个位点设计4条LAMP引物,65℃保温约60 min,完成对副溶血性弧菌的扩增,扩增产物经肉眼、SYBRGreen I染色、电泳和酶切鉴定。利用LAMP和普通PCR方法同时检测1株副溶血性弧菌和12株非副溶血性弧菌来验证LAMP方法的特异性;将副溶血性弧菌菌液作一系列10倍稀释后用LAMP和PCR方法进行检测,比较两者敏感性。结果 1株副溶血性弧菌出现LAMP扩增反应:通过肉眼、SYBR Green I染色和电泳均能观察到LAMP扩增产物的出现,酶切证实了LAMP产物的特异性;12株非副溶血性弧菌未出现LAMP扩增。LAMP检测tlh基因的特异性和敏感性与普通PCR相同,LAMP检测tlh基因的检测下限为15 cfu/mL。结论建立了一种快速、敏感、特异的副溶血性弧菌检测方法,适合日常监测及快速检测的需要。

问号钩端螺旋体鞘磷脂酶类溶血素基因功能分析及其感染细胞后转录水平变化

目的了解问号钩端螺旋体（简称钩体）鞘磷脂酶类溶血素基因sph1—sph4产物溶血活性及其感染细胞后转录水平的变化。方法以致病性问号钩体黄疸出血群赖型赖株、波摩那群波摩那型罗株和非致病性双曲钩体三宝垄群Patoc型PatocⅠ株基因组DNA为模板，采用PCR扩增全长sph1-sph4基因片段，扩增产物T—A克隆后测序。构建sph1—sph4基因原核表达系统，采用SDS-PAGE检测目的重组蛋白rSph1—rSph4的表达情况，Ni—NTA亲和层析柱提纯rSph1—rSph4。采用绵羊血平板对rSph1～rSph4溶血活性进行鉴定，实时荧光定量RT—PCR检测问号钩体赖株感染J774A.1细胞前后sph1～sph4基因转录水平的变化。结果问号钩体赖株和罗株基因组DNA中均能扩增sph1～sph4基因，双曲钩体PatocⅠ株则否。与报道的相应基因序列比较，所克隆的sph1—sph4基因核苷酸序列相似性均为100％。所构建的原核表达系统能分别表达目的重组蛋白rsph1～rSph4。rSph1～rSph4均有溶血活性，其中以rSph2溶血活性最强。问号钩体赖株感染J774A．1细胞后，sph1—sph4基因转录水平均上调，其中sph2和sph4基因mRNA水平上调更为明显。结论sph1—sph4基因仅存在于致病性问号钩体中，其表达产物有溶血活性。问号钩体赖株感染细胞后sph1～sph4基因转录水平的上调，提示此类鞘磷脂酶类溶血素可能在问号钩体感染宿主过程中有重要作用。

山茱萸对小鼠免疫系统的影响

山茱萸水煎剂10,20g/kg ig使小鼠胸腺明显萎缩;减慢网状内皮系统对碳粒的廓清速率:10g/kg升高小鼠血清溶血素抗体的含量,而5g/kg作用不显著;山茱萸5,10g/kg均使血清抗体IgG含量明显升高,并能抑制SRBC所致小鼠迟发型足垫肿胀;10,20g/kg于抗原攻击前给药明显减轻DNCB所致小鼠接触性皮炎;而20g/kg于抗原攻击后3～15h给药亦对接触性皮炎有较明显的抑制作用。

山香圆总黄酮对免疫功能低下小鼠免疫功能的影响

目的探讨山香圆总黄酮(TFS)对免疫抑制小鼠免疫功能的影响。方法在腹腔注射环磷酰胺(Cy)诱导小鼠免疫低下模型的基础上,采用碳廓清实验检测小鼠巨噬细胞的吞噬功能;分光光度法测定血清及脾细胞中溶血素水平;二硝基氟苯诱导小鼠迟发型变态反应,并用流式细胞仪检测T细胞亚群。结果TFS(240、480mg/kg,ig)可明显提高Cy诱导免疫功能低下小鼠的吞噬指数a值和校正指数K值、增加Cy诱导免疫功能低下小鼠脾细胞和血清中溶血素水平,增强Cy诱导免疫低下小鼠的迟发性变态反应。进一步研究发现,TFS(240mg/kg,ig)可明显提高CD4+、CD8+细胞数,使CD4+/CD8+细胞比值上升。结论TFS能明显改善Cy致免疫功能低下小鼠的免疫功能,其免疫调节作用与调节T细胞亚群有关。

附子酸性多糖提高免疫低下小鼠免疫功能的实验研究

目的观察附子酸性多糖对环磷酰胺所致免疫低下小鼠免疫功能的影响。方法采用植物化学方法得到附子酸性多糖,以灌胃和腹腔注射2种方式给药,观察免疫低下小鼠的胸腺、脾脏指数,腹腔巨噬细胞吞噬功能,血清溶血素,淋巴细胞转化率,自然杀伤细胞活性以及外周血白细胞计数等多项指标,与对照组比较评价附子酸性多糖对免疫低下小鼠细胞和体液免疫功能的影响。结果附子酸性多糖可显著提高正常小鼠和免疫低下小鼠的脾脏和胸腺指数,提高小鼠的腹腔巨噬细胞吞噬功能和抗体产生能力,促进淋巴细胞增殖,增强自然杀伤细胞活性,并且可以显著提高白细胞数量(P<0.05或P<0.01)。腹腔注射较灌胃给药的效果更为明显(P<0.01)。结论附子酸性多糖可以显著提高免疫低下小鼠体液免疫和细胞免疫功能,并可减轻由于环磷酰胺引起的白细胞降低,具有减轻化疗药的毒副作用。且不同给药途径可影响其疗效。附子酸性多糖具有广阔的开发应用前景。

人工蛹虫草子实体对小鼠免疫功能的影响

目的考察人工蛹虫草子实体对小鼠免疫功能的影响。方法采用蛹虫草子实体微粉（粒径17～20μm）水溶液给小鼠连续灌胃12d，分别观察对小鼠脾淋巴细胞转化、血清溶血素水平和2，4-二硝基氟苯（DNFB）诱导小鼠迟发型变态反应的影响。结果小鼠灌胃给予蛹虫草子实体微粉水溶液10～90mg·kg^-1，可显著促进淋巴细胞的自然增殖作用（与阴性对照组比较，P〈0．05），但对刀豆蛋白（ConA）或脂多糖（LPS）活化后的细胞无协同作用，同时增加血清溶血素水平，能增强DNFB诱导的小鼠迟发型变态反应，但对小鼠胸腺指数和脾脏指数无明显影响。结论人工蛹虫草子实体的微粉具有免疫调节作用。

肺炎合剂免疫、抗菌及抗炎作用的实验研究

目的观察肺炎合剂对免疫功能的影响以及抗菌、抗炎作用。方法采用碳粒廓清法、血清溶血素测定法、小鼠体内诱导法观察本品对机体特异性和非特异性免疫功能的作用;采用试管稀释法测定其对常见致病菌的最低杀菌浓度(MBC);采用毛细血管通透性法、棉球肉芽肿法观察本品对急慢性炎症的作用。结果肺炎合剂能增强小鼠吞噬功能、升高免疫低下小鼠血清中半数溶血值(HC50)及白细胞总数(WBC)、提高T—淋巴细胞转化率;对金黄色葡萄球菌等致病菌有抗菌作用;能明显抑制小鼠毛细血管通透性增高和棉球肉芽肿形成。结论本品具有增强机体免疫功能、抗菌及抗炎作用。

刺薏复方对辐射危害的辅助保护功能研究

目的:研究刺薏复方对辐射危害的辅助保护功能。方法:取昆明种小鼠预防性给予高、中、低剂量刺薏复方14d,以Co60γ射线为辐射源对小鼠进行2～7Gy一次性全身照射,照射后继续给予高、中、低剂量刺薏复方3～14d,同时设生理盐水对照组,观察计数外周血白细胞、骨髓有核细胞、骨髓细胞微核率、血清超氧化物歧化酶(SOD)活性、血清溶血素抗体积数。结果:与生理盐水组比较,刺薏复方高、中剂量组辐射后小鼠外周血白细胞数、骨髓有核细胞数、SOD活性、血清溶血素抗体积数明显升高(P<0.05或P<0.01),刺薏复方高剂量组骨髓细胞微核率明显降低(P<0.01)。结论:刺薏复方对辐射危害有辅助保护功能,其作用与给药剂量存在一定的剂量依赖性。

五味子多糖对正常小鼠免疫功能的影响

目的 :观察五味子多糖对正常小鼠免疫功能的影响。方法 :观察五味子多糖对正常小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能、溶血素形成 ,溶血空斑形成及淋巴细胞转化功能的作用。结果 :五味子多糖可显著提高正常小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬百分率和吞噬指数 ,促进溶血素及溶血空斑形成 ,促进淋巴细胞转化。结论

九头狮子草对小鼠免疫功能的影响

目的:研究九头狮子草对小鼠免疫功能的影响。方法:采用小鼠碳廓清实验和血清溶血素测定法,观察九头狮子草对小鼠单核巨噬细胞吞噬功能、溶血素抗体生成的影响。结果:九头狮子草可激活小鼠网状内皮系统,增加小鼠血清溶血素含量。结论:九头狮子草具有一定增强机体免疫力的作用。

硫酸黄连素对体液免疫功能的影响

为探索小檗碱对体液免疫系统的作用,本试验用硫酸黄连素观察其整体用药后对小鼠血清溶血素和IgG浓度的影响,用~3H—TdR掺入法离体给药观察其对小鼠B淋巴细胞转化的作用。结果表明:硫酸黄连素可明显降低血清溶血素和IgG含量,显著抑制B淋巴细胞转化。提示硫酸黄连素可抑制体液免疫功能。