蜂毒溶血肽作用机理研究进展

该文系统归纳了蜂毒溶血肽的生物学功能,分子结构与性质,溶解血细胞的机理,以及溶血和抑菌活性与结构的关系,并结合本实验室研究着重综述了近年来国内外对蜂毒溶血肽作用机理的研究。提出今后研究应该向定量化方向发展,应用计算技术深入阐明蜂毒肽作用的动力学过程及结构与功能的关系,为今后指导分子设计打下一定的理论基础。

蜂毒溶血肽对鸡红细胞及膜的生化作用

本文采用荧光分光光度、薄层层析、原子吸收、荧光显微图像等多种生化技术,系统研究了蜂毒肽作用于鸡红细胞及膜的生化机理。结果表明:蜂毒肽影响红细胞膜上及胞内两种酶的功能。它抑制膜Na+-K+-ATPase活性,导致胞内外离子转运异常,K+浓度失衡;它也抑制细胞内葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活性,其正电区域干扰胞内带负电小分子的作用,影响红细胞正常代谢。蜂毒肽干扰膜中阴离子通道的转运功能,使细胞渗透压改变,引起膨胀而溶血。蜂毒肽对有核红细胞核内DNA没有作用,与其他抗微生物多肽作用的靶向不同。据此认为,抗菌蛋白类抗生素对细菌作用的生化机理与传统抗生素不同,这是细菌对其不易产生耐药性的重要原因。

4种胡蜂前溶血肽原基因的克隆与序列比较

从雌性亚非马蜂、额斑黄胡蜂、墨胸胡蜂、大胡蜂毒腺中抽提总RNA ,通过RT PCR方法扩增得到 4种胡蜂蜂毒前溶血肽原的cDNA ,再将扩增产物克隆到pGEM Teasyvector上。测序结果表明 :扩增得到的片段长度均为2 13bp ,系蜂毒前溶血肽原编码区的cDNA。经序列比较 ,4种胡蜂蜂毒前溶血肽原之间的氨基酸序列同源性都超过95 %。亚非马蜂、额斑黄胡蜂、墨胸胡蜂、大胡蜂各自与意大利蜜蜂蜂毒前溶血肽原氨基酸序列的同源性分别为95 8%、10 0 %、97 2 %、97 2 %。结果表明 :蜂毒前溶血肽原一级结构序列具有很高的保守性 ,尽管胡蜂和蜜蜂属于膜翅目不同的总科 。

蜂毒溶血肽基因的定点诱变及其在大肠杆菌中的表达

从蜜蜂毒腺中提取总ＲＮＡ，通过ＲＴ－ＰＣＲ方法扩增得到了蜂毒溶血肽前体蛋白的ｃＤＮＡ，再进一步通过定点诱变在蜂毒溶血肽序列前引入了羟胺裂解位点，构建了与β－半乳糖苷酶部分序列相融合的蜂毒溶血肽诱变蛋白表达载体，序列分析结果表明，成功地引入了目的密码子且与β－半乳糖苷酶部分序列构成正确的读码框，并在大肠杆菌中表达了诱变蛋白，为基因工程生产蜂毒溶血肽提供了新途径。

蜂毒溶血肽前体蛋白cDNA的克隆及其融合蛋白的表达

从蜜蜂毒腺中提取总RNA ,通过RT PCR扩增得到了蜂毒溶血肽前体蛋白的cDNA ,将扩增产物克隆到 pT7Blu T载体上 ,再进一步将插入片段酶切并连接到 pUC1 1 8载体上 ,构建了重组质粒pUMP。DNA序列分析结果表明 ,克隆得到的cDNA序列与所发表序列完全相同 ,且与 β 半乳糖苷酶部分序列构成正确的读码框。含重组质粒 pUMP的大肠杆菌DH5α表达了与β

少棘蜈蚣毒液溶血肽的分离纯化

采用超滤和HPLC(包括凝胶过滤层析、阳离子交换层析和反相HPLC)等技术对少棘蜈蚣毒液进行分离纯化,最终获得一个多肽;运用基质辅助激光解吸附飞行时间质谱测定其分子量为4484Da,测得其对小鼠红细胞半数溶血剂量HD50=14.69μg/ml。

中华蜜蜂和意大利蜜蜂蜂毒前溶血肽原蛋白cDNA的克隆与序列分析

分别从中华蜜蜂Apisceranacerana和意大利蜜蜂Apismellifera工蜂毒腺中抽提总RNA ,通过RT PCR方法扩增 ,各得到了蜂毒前溶血肽原蛋白的cDNA ,再将扩增产物克隆到pGEM Teasy载体上 ,进行测序和序列分析。结果表明 ,所扩增到的这两个片段长度均为 2 13bp ,均为编码蜂毒前溶血肽原的cDNA ,并分别推导出两者所编码的氨基酸序列。经序列比较 ,中华蜜蜂前溶血肽原与意大利蜜蜂、印度蜜蜂Apisceranaindica前溶血肽原的同源性都为 97%。所报道的中华蜜蜂蜂毒前溶血肽原的核苷酸序列的GenBank登录号为AF48790 7。

蜂毒溶血肽的研究进展

目的 了解蜂毒溶血肽的结构、功能和其分子生物学研究进展。方法 综述蜂毒溶血肽的结构和功能特点 ,在医疗、农业及生物膜研究中的应用 ,分离纯化中所存在的问题 ,分子生物学研究进展。结果 蜂毒溶血肽是蜜蜂毒腺产生的一种强碱性有毒多肽 ,其分子立体结构呈短棒状 ,具抗炎、抗辐射作用 ,可在生物膜中形成离子通道 ,从蜂毒中分离的蜂毒溶血肽常被磷脂酶A2 污染 ,蜂毒溶血肽cDNA已被克隆得到。

蜂毒溶血肽的研究进展

蜂毒溶血肽 (melittin)是蜜蜂毒液的主要组分 ,由 2 6个氨基酸残基组成 ,具有两亲性和种的特异性。它的cDNA已经被克隆 ,并以融合蛋白的形式在大肠杆菌Escherichiacoli中进行表达。蜂毒溶血肽的作用机制主要包括脂酶的激活 ,产生第二信使 ,调节一些酶及离子通道 ;Ca2 +的水平调节 ,影响骨骼肌和心肌的收缩 ;作为脂类代谢的探针。由于蜂毒溶血肽结构简单 ,且抑制病毒复制 ,因此可将其用于癌症的基因治疗及爱滋病的防治。此外 ,蜂毒溶血肽还可作为对一些作用机理进行研究的模型肽。

蜂毒溶血肽类似物定量构效关系计算分析

采用HyperChem7.0结构分析软件,对蜂毒溶血肽类似物的分子体积等结构参数进行了计算分析.分别利用多元线性回归、BP-神经网络计算法进行统计分析,获得两个相关性好的QSAR(quantitative struc-ture-function relationship)模型.结果显示,蜂毒肽溶血活性与生成热、键合能、表面积、分子体积、极化能、醇水分配系数、水合能相关.为降低溶血作用,指出在设计蜂毒肽结构时应尽量避免螺旋状结构,少用疏水性氨基酸.

蜂毒溶血肽(Melittin)cDNA的克隆及序列分析

为了克隆得到正确序列的蜂毒溶血肽 c DNA,对蜂毒中的蜂毒溶血肽进行了研究。实验从蜜蜂毒腺中提取总 RNA,通过 RT- PCR方法扩增得到了蜂毒溶血肽的 c DNA,扩增产物克隆到p T7Blu- T载体 ,转化大肠杆菌 JM1 0 9,DNA序列分析结果表明克隆得到的蜂毒溶血肽 c

二种胡蜂前溶血肽原基因在昆虫杆状病毒系统中的表达

构建亚非马蜂和额斑黄胡蜂前溶血肽原基因的重组供体质粒pBacHT-PhPPM和pBacHT-VmPPM,转化到穿梭载体Bacmid的受体菌DH10Bac中,得重组穿梭载体Bacmid-PhPPM和Bacmid-VmPPM,再用Lipofectin介导其DNA转染粉纹夜蛾细胞系Tn-5B1-4,最后观察细胞表达时相动态.经ELISA法证实,胞内表达产物具有良好的抗原性,证明二种重组病毒Bacmid-PhPPM和Bacmid-VmPPM已在昆虫细胞中得到了表达.

中华蜜蜂溶血肽基因在杆状病毒系统中的表达

构建含中华蜜蜂溶血肽基因的重组转移载体pBacHT_GFPTAccM,转化受体菌DH10Bac,得重组穿梭载体Bacmid_GFPTAccM,Lipofectin介导其基因组DNA转染粉纹夜蛾细胞系Tn_5B1_4。SDS_PAGE分析表明,感染重组杆状病毒Bacmid_GFPTAccM的细胞表达产物在约为34kD处出现特异性条带,其表达量约占细胞总蛋白的3%。Westernblotting和细胞表达时相动态分析证明中华蜜蜂溶血肽基因已在粉纹夜蛾细胞系Tn_5B1_4中进行了成功的表达。

蜂毒溶血肽改善非酒精性脂肪肝大鼠肝组织脂肪沉积作用及其机制研究

目的探讨蜂毒溶血肽对非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)大鼠肝脂肪变性的保护作用及其机制。方法随机将40只SD大鼠分成对照组、模型组、小剂量蜂毒溶血肽处理组和大剂量蜂毒溶血肽处理组。采用高脂饲料喂养建立NAFLD模型,再分别给予蜂毒溶血肽10μg·kg^-1·d^-1和100μg·kg^-1·d^-1或生理盐水皮下注射,连续12w。采用Westernblot法检测核转录因子E2相关因子2(Nrf2)和血红素加氧酶-1(HO-1)表达。结果大剂量蜂毒溶血肽处理组大鼠体质量和肝质量分别为(380.2±20.8)g和(10.4±1.3)g,显著低于模型组【分别为(435.2±22.1)g和(14.3±1.4)g,P<0.05】,血清AST和ALT水平分别为(88.0±10.4)U/L和(49.3±6.2)U/L,显著低于模型组【分别为(159.7±18.9)U/L和(77.7±6.8)U/L,P<0.05】,血糖、TC、TG和LDL-C水平分别为(8.7±1.8)mmol/L、(1.6±0.2)mmol/L、(0.8±0.1)mmol/L和(0.3±0.1)mmol/L,显著低于模型组【分别为(18.3±2.4)mmol/L、(2.8±0.3)mmol/L、(1.5±0.2)mmol/L和(0.5±0.1)mmol/L,P<0.05】,血清超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)和谷胱甘肽(GSH)水平分别为(82.1±6.6)U/L、(6.3±0.8)nmol/mL和(8.7±0.9)mmol/L,与模型组的(30.4±5.3)U/L、(13.1±1.6)nmol/mL和(2.3±0.5)mmol/L比,差异显著(P<0.05),肝组织Nrf2和HO-1表达分别为(1.4±0.2)和(1.2±0.1),显著高于模型组【分别为(0.3±0.1)和(0.3±0.1),P<0.05】。结论蜂毒溶血肽可以调节NAFLD大鼠血糖和血脂代谢,减轻肝脂肪变程度,改善肝功能,其机制可能与调控Nrf2和HO-1表达,缓解氧化应激损伤有关。

蜂毒前溶血肽原基因的改造及其原核表达

为进一步探讨利用基因工程技术生产蜂毒肽的方法,根据大肠杆菌密码子偏好性、基因GC含量、合成蛋白加工需求等对蜂毒前溶血肽原基因序列进行改造,并利用人工化学合成方法完成改造后全基因的合成。构建蜂毒前溶血肽原与GST融合表达重组质粒pGEX-4T-1/PPMel,转化大肠杆菌BL21感受态细胞后分别在20、37℃条件下经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,并利用SDS-PAGE和Western Blot对产物进行检测。结果表明,表达体系成功表达了目的融合蛋白,在20℃条件下可获得可溶性表达产物,为进一步分离纯化目的蛋白及获得蜂毒肽提供了基础。

蜂毒前溶血肽原及其加工产物生物信息学比较分析

为了深度了解蜂毒前溶血肽原及其加工产物的结构与功能的关系,利用生物信息学工具对其理化性质、保守性、信号肽、跨膜区域及酶切位点等进行了分析。结果表明,蜂毒前溶血肽原种间结构保守,理化性质种间差异不大但与加工成的蜂毒肽有明显区别;蜂毒前溶血肽原具有明显的信号肽序列和跨膜区域;有多种肽酶在蜂毒肽结构域没有酶切位点。为研究其结构改造以便利用基因工程合成蜂毒前溶血肽原并进行加工提供了理论依据。

蜂毒前溶血肽原重组质粒pET-28a(+)-PPMel的构建及分析

为了探讨利用基因工程技术生产蜂毒肽的方法,对重组质粒pGEX-4T-1/PPMel中的蜂毒前溶血肽原基因进行了更换载体处理,并重新构建了蜂毒前溶血肽原重组质粒pET-28a(+)-PPMel,为进一步转化大肠杆菌感受态细胞并进行蜂毒前溶血肽原基因的表达提供了材料。相关序列的生物信息学分析表明,新的重组质粒可表达含有106个氨基酸残基的融合蛋白,其中包括His标签。该融合蛋白没有信号肽序列,但存在跨膜区域,其在大肠杆菌中的表达需进一步探讨。

蜂毒肽高效液相色谱测定

本文应用高效液相色谱对蜂毒中多肽溶血毒进行了定量测定。标准偏差<1.28％。平均回收率>96％。

蜂螫过敏机理探讨及对策

蜂毒的化学成分非常复杂，有酶类：透明质酸酶、磷脂酶A2、酸性磷酸酶等；肽类：蜂毒肽（蜂毒溶血肽）、蜂毒神经肽、肥大细胞脱粒肽（MCD肽）、阿度拉平、心脏肽、普鲁卡胺；生物活性胺类：组织胺、多巴胺、去甲肾上腺素等；还含有少量的易挥发成分。蜜蜂及其产品引起的过敏反应，主要通过4条途径：一是蜜蜂虫体碎屑吸入变态反应，表现为每当进入蜂场或清理蜂箱时出现鼻眼发痒、打喷嚏、流清鼻涕、鼻塞、流泪，严重者可出现哮喘，

蜂毒的美容作用及其安全性

蜂毒是工蜂的毒腺和副腺分泌出的具有芳香气味的一种透明毒液,贮存在毒囊中,蜇刺时由蜇针排出.蜂毒主要的有效成分为蜂毒溶血肽、蜂毒神经肽、磷酯酶A、透明质酸酶、多巴胺和组织胺等.由于蜂毒中含有多种有很强生物活性的物质,因而具有十分显著的亲神经特性、抗凝血和溶血作用、抗炎免疫活性、抑菌等生物学活性.在临床上,自古以来,蜂毒就被认为是关节炎和风湿症的天然治疗剂,对过敏性疾病、胶原病、神经痛和神经炎、心血管疾病等都有良好的疗效.