高分辨率溶解曲线分析技术在大豆Ecotilling中的应用

将高分辨率溶解曲线(High Resolution Melting,HRM)技术运用在大豆Ecotilling中,对256份栽培大豆的大豆异黄酮合酶基因(IFS1)的外显子区域进行SNP筛查,并采用直接测序的方法对HRM检测结果进行验证。结果表明:模板均一化后的检测效果较未均一化的检测效果差异显著,野生型样本与待测样本按1∶1及1∶4比例混样溶解曲线阈值较高,其中1∶4混样适合高通量检测。HRM对IFS1基因外显子区域的检测结果与PCR产物测序的结果比对显示,对IFS1第5段外显子和第7段外显子检测的准确率分别达到91.2%和100%,表明该研究利用HRM技术建立的栽培大豆的Ecotilling技术体系是一种高灵敏度、高通量和低成本检测SNP的新方法。

一管法MLPA荧光探针溶解曲线分析技术检测15种高危型HPV方法的建立

目的：结合多重连接依赖探针扩增（MLPA）和荧光探针溶解曲线分析技术，建立一种一管法同时检测并分辨15种高危型HPV的方法。方法：根据各HPV亚型的特异性序列设计MLPA探针，并在各亚型的ML—PA探针中加入溶解温度（Tm）不同的人工核酸序列作为识别标志；使用特殊的耐高温连接酶和热启动Taq酶，通过温度控制使探针杂交、连接、PCR在一管反应中顺序进行；以各HPV亚型10^2拷贝至10^6拷贝的标准品质粒作为模版进行敏感度实验；将10^2-10^6拷贝的HPV亚型标准品进行两两混合作为模版，检测本方法对混合样本的检测能力；使用本方法和HPV分型试剂盒（导流杂交法）对临床样本进行平行检测，比较2种方法的差异。结果：本方法可在一次反应内顺序完成MLPA探针杂交、连接、扩增3个步骤，扩增结果可通过不同荧光通道不同Tm值的溶解峰分辨不同的HPV亚型；本方法对标准品的检测灵敏度比经典的MLPA3步法反应下降约一个数量级；本方法可同时检测至少2种HPV亚型的混合感染；对临床阳性标本的检出率与导流杂交法结果基本一致。结论：本研究成功建立了一种利用一管法MLPA荧光探针溶解曲线技术检测15种高危型HPV的方法。

高分辨率溶解曲线分析与基因测序检测粪便DNA对大肠癌筛查作用的比较

目的用基因测序评价高分辨率溶解曲线分析(high-resolution melting,HRM)检测粪便DNA的可靠性。方法收集2009年3月～2009年9月在惠州市中心人民医院住院的39例大肠癌患者的新鲜粪便标本约1 g,应用HRM法和基因测序法检测粪便中apc、k-ras、p53基因的突变情况,并对结果进行统计学分析。结果应用HRM在39例大肠癌患者粪便中检出apc基因突变22例,检出率为56.41%(22/39),经测序HRM阳性的22例标本均发现有基因突变,HRM阴性的标本未发现有基因突变者;检出k-ras基因突变14例,检出率为35.90%(14/39),经测序HRM阳性的14例标本均发现有基因突变,HRM阴性的标本末发现有基因突变者;检出p53基因突变24例,检出率为61.54%(24/39),经测序HRM阳性的24例标本均发现有基因突变,HRM阴性的标本未发现有基因突变者。结论 HRM法与基因测序的一致率较高,提示HRM法检测粪便DNA突变筛查大肠癌具有潜在的临床应用价值。

一例弥漫性大B淋巴细胞瘤组织样本T细胞TCR α/β CDR3谱序的初步分析

目的 FQ-PCR溶解曲线法初步分析1例弥漫性大B淋巴细胞瘤患者组织标本中T细胞TRAV和TRBV基因各家族CDR3谱序。方法提取4例淋巴结增生组织和1例弥漫性大B淋巴细胞瘤患者的mRNA,逆转录成cDNA,FQ-PCR扩增32个TRAV基因和24个TRBV基因的CDR3区,利用FQ-PCR技术了解其克隆性,溶解曲线单峰家族基因测序分析CDR3区基因和氨基酸序列。结果该例淋巴瘤患者淋巴结组织T细胞FQ-PCR溶解曲线分别在TRAV10、TRAV18和TRBV6、TRBV24家族中出现单峰表现,其CDR3区氨基酸序列为CAGANFGNEKLTFGTGTCR、CAPSFSGYSTLTFGKGTM、CASSERGQPQHFGDGTCR、CATTPAGEYYGYTFGSGT-CR,4例增生淋巴结组织FQ-PCR溶解曲线均为寡峰和多峰。结论该例淋巴瘤组织中FQ-PCR溶解曲线单峰家族的T细胞可能为高应答T细胞,本实验为进一步研究淋巴溜的免疫应答机制和个体化治疗提供了研究基础。

结直肠癌中EGFR、KRAS基因突变及与hMSH2蛋白表达缺失的关系

应用 HRMA 检测66例结直肠癌组织标本的 EGFR 外显子19～21及 KRAS 外显子2的突变情况并用免疫组化法检测 hMSH2、EGFR 及 KRAS 蛋白表达情况，分析两基因突变分布状态及其与 hMSH2表达缺失的关系。结果显示无组织标本存在 EGFR 基因突变、22例存在 KRAS 基因突变，且位于12和13密码子；hMSH2表达缺失率为34．8％，且与KRAS 基因突变关系不明显。可见结直肠癌中，EGFR 突变少见而 KRAS 突变常见，应用 EGFR 抑制剂治疗结直肠癌患者前，有必要检测其 KRAS 突变情况。

利用Taqman探针熔解曲线技术检测抗高血压药物相关基因多态位点

目的:基于Taqman探针结合熔解曲线技术,建立1种简单、高效的快速检测抗高血压药物相关基因多态位点的基因分型方法,指导临床上抗高血压药物的个性化给药方式,从而有效降低不良反应发生率。方法:随机采集200例原发性高血压患者的口腔粘膜脱落细胞,通过提取口腔粘膜脱落细胞基因组DNA,设计特异性的Taqman探针和不对称扩增引物,在2个反应管中采用多色Taqman探针结合熔解曲线技术对提取的基因组DNA的5个抗高血压药物相关基因多态位点进行基因分型检测,并随机抽取不同基因型的样本进行基因测序验证。结果:Taqman探针结合熔解曲线技术能够对200例抽提的基因组DNA的5个抗高血压药物相关基因多态位点进行准确的分型,分型结果与基因测序结果也完全一致。结论:Taqman探针熔解曲线技术能够有效的对复杂样本类型的基因组DNA进行基因分型,是1种简单、快速、精确的检测方法,可以适用于多种突变类型的检测。