过表达溶质载体家族1成员5和敲低慢病毒载体构建及稳定转染RAW264.7细胞株

背景:溶质载体家族1成员5(solute carrier family 1 member 5,SLC1A5)在多种疾病中发挥了潜在作用,但确切作用机制尚不清楚。构建稳定的SLC1A5过表达和敲低细胞模型可为深入研究SLC1A5在疾病中的确切作用机制以及发现潜在治疗靶点提供有力的实验工具。目的:构建小鼠SLC1A5过表达和敲低的慢病毒载体,以建立稳定转染的RAW264.7细胞株,为深入探讨SLC1A5在炎症中的作用提供实验基础。方法:根据SLC1A5基因序列设计合成引物并使用聚合酶链反应扩增该基因片段。将目的基因定向接入经Age I/Nhe I酶切的载体质粒GV492中构建重组慢病毒质粒,对阳性克隆进一步筛选后测序比对结果;pHelper1.0质粒载体、pHelper2.0质粒载体、目的质粒载体与293T细胞共同培养并转染,获得慢病毒原液进行包装和滴度测定;在此基础上,通过体外培养RAW264.7细胞,确定嘌呤霉素工作质量浓度;不同滴度的慢病毒分别与RAW264.7细胞共同培养,根据荧光强度确定转染效率;用嘌呤霉素挑选出稳定转染细胞,实时荧光定量聚合酶链反应和蛋白免疫印迹方法检测稳定转染细胞株的SLC1A5基因和蛋白表达水平。结果与结论:(1)测序序列与目的序列一致提示重组慢病毒载体构建成功;(2)过表达SLC1A5慢病毒的滴度为1×10~9 TU/mL,敲低SLC1A5慢病毒的滴度为3×10~9 TU/mL;(3)确定RAW264.7细胞嘌呤霉素工作质量浓度为3μg/mL;(4)过表达/敲低SLC1A5慢病毒转染RAW264.7细胞的最佳条件皆为HiTransG P转染增强液且感染复数值等于50;(5)过表达SLC1A5稳转细胞株中SLC1A5基因和蛋白的表达量明显上调,而敲低SLC1A5稳转细胞株中SLC1A5基因和蛋白的表达量显著下调。结果表明,成功构建了小鼠SLC1A5过表达和敲低的慢病毒载体并获得稳定转染的RAW264.7细胞株。

溶质载体家族3成员2表达与双硫死亡、铁死亡及肿瘤关系的研究进展

铁死亡和双硫死亡与多种疾病相关。铁死亡的特征是铁离子和脂质活性氧的异常累积,而双硫死亡则是二硫化物的异常累积。溶质载体家族3成员2(SLC3A2)作为溶质载体家族的一员,不仅参与调控肿瘤细胞的增殖、迁移、侵袭和凋亡,还参与细胞铁死亡和双硫死亡,在肿瘤的发生发展中起关键作用。本文阐述了SLC3A2与双硫死亡、铁死亡和肿瘤关系的研究进展,旨在为癌症靶向治疗提供理论基础。

肿瘤抑制因子p53/溶质载体家族7成员11蛋白调控铁死亡在缺血性脑卒中疾病中的研究进展

缺血性脑卒中是中老年人致残及死亡的主要原因,完善脑卒中的治疗方案并改善患者的生活质量已然成为当今医学研究的热点。铁死亡是最新研究发现的细胞程序性死亡,对脑缺血-再灌注的发病机制有重要的调控作用,肿瘤抑制因子p53(Tumor Suppressor Protein p53,P53)/溶质载体家族7成员11蛋白(Solute Carrier Family 7 Member 11,SLC7A11)是铁死亡过程中的重要信号传导通路,与缺血性脑卒中的生理病理息息相关,但目前关于此通路作用于缺血性脑卒中的机制仍需更多的循证医学证据。中药作为公认的多靶点治疗手段,是治疗缺血性脑卒中细胞铁死亡的一种手段,也对P53/SLC7A11信号传导通路发挥了关键的调控作用。但目前铁死亡参与缺血性脑卒中的作用机制未完全阐明,中药如何调控铁死亡相关信号通路尚处于探索阶段,随着相关研究的深入,中药作用于铁死亡信号通路的机制会更加清晰,中药复合提取物与中药活性物质可能是缺血性脑卒中铁死亡未来的研究方向和治疗前景。目前P53/SLC7A11信号传导通路研究以基础研究为主,随着研究的进展,应将基础研究与临床研究相结合,以期开展新药研发,为缺血性脑卒中提供新的治疗手段和途径。文章对P53/SLC7A11信号传导通路在缺血性脑卒中疾病中的调控过程以及中药对此信号传导通路所产生的效力进行综合性叙述,以期为缺血性脑卒中的临床治疗及预防提供新的策略。

胆绿素还原酶A rs699512和肝细胞溶质载体有机阴离子转运蛋白家族成员1B1 rs4149015位点基因多态性与新生儿不明原因高胆红素血症易感性相关性研究

目的:分析胆绿素还原酶A(BLVRA)rs699512和肝细胞溶质载体有机阴离子转运蛋白家族成员1B1(SLCO1B1)rs4149015位点基因多态性与新生儿不明原因高胆红素血症(HB)易感性的相关性。方法:选取不明原因HB新生儿90例为HB组,另选取同期健康新生儿90例为对照组。比较两组临床资料以及BLVRA rs699512、SLCO1B1 rs4149015位点基因型分布和等位基因频率。比较不同BLVRA rs699512、BLVRA rs699512基因型患儿血清胆红素水平。分析BLVRA rs699512、SLCO1B1 rs4149015位点基因多态性与HB易感性的关系。结果:HB组患儿总胆红素和结合胆红素水平明显高于对照组(均P<0.05)。两组BLVRA rs699512、SLCO1B1 rs4149015位点基因型分布比较差异有统计学意义(均P<0.05)。HB组患儿BLVRA rs699512位点GG基因型分布高于对照组,AA基因型分布低于对照组,G等位基因频率高于对照组(均P<0.05)。HB组患儿SLCO1B1 rs4149015位点AA基因型分布高于对照组,GG基因型分布低于对照组,A等位基因频率高于对照组(均P<0.05)。BLVRA rs699512中GG基因型总胆红素和结合胆红素水平高于AA基因型(均P<0.05)。SLCO1B1 rs4149015中AA基因型总胆红素和结合胆红素水平均高于GG基因型(均P<0.05)。BLVRA rs699512位点GG基因型与HB发生呈正相关,AA基因型与HB发生呈负相关(r=0.671、-0.608,均P<0.05)。SLCO1B1 rs4149015位点AA基因型与HB发生呈正相关,GG基因型与HB发生呈负相关(r=0.695、-0.633,均P<0.05)。结论:不明原因HB新生儿BLVRA rs699512位点GG基因型与SLCO1B1 rs4149015位点AA基因型会增加易感性,临床可建立早期防治体系以改善患儿预后。

溶质载体家族7成员11对MYCN基因扩增高危神经母细胞瘤细胞增殖的影响

目的分析溶质载体家族7成员11(SLC7A11)在有无MYCN基因扩增的神经母细胞瘤(NB)细胞系和临床样本中的表达及其与患儿预后相关性,研究SLC7A11对MYCN扩增高危NB增殖的影响。方法利用GEO数据库GSE49710数据集、TARGET数据库和R2数据库GSE45547数据集分析NB临床样本中SLC7A11 mRNA水平与MYCN基因扩增状态和NB患儿预后相关性。应用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测MYCN扩增NB细胞系SK-N-BE(2)和IMR32细胞以及MYCN非扩增NB细胞系CHLA-255和SH-SY5Y细胞中SLC7A11 mRNA水平。在MYCN扩增NB细胞系SK-N-BE(2)细胞中,利用2条不同序列小干扰RNA瞬时敲低SLC7A11 mRNA,应用RT-qPCR和Western印迹法检测SLC7A11 mRNA和SLC7A11表达及MYCN mRNA和N-MYC表达,采用结晶紫染色和实时无标记细胞分析(RTCA)技术观察NB细胞增殖情况。免疫荧光法检测增殖标记物Ki-67表达情况。利用短发夹RNA慢病毒感染方法构建稳定敲低SLC7A11的SK-N-BE(2)细胞,RT-qPCR和Western印迹法检测SLC7A11的稳定敲低效果和MYCN水平,采用克隆形成实验观察NB细胞克隆形成能力。结果分析NB临床样本GSE49710和GSE45547数据集发现,在MYCN扩增NB中,SLC7A11 mRNA水平显著高于非MYCN扩增NB(P<0.05,P<0.01),且TARGET数据库和R2数据库GSE45547数据集分析表明SLC7A11 mRNA水平与NB患儿生存率呈负相关(P<0.05,P<0.01)。SLC7A11在MYCN扩增NB细胞系SK-N-BE(2)和IMR32中的表达均显著高于非扩增细胞系CHLA-255和SH-SY5Y(P<0.01)。与对照敲低组相比,瞬时敲低SLC7A11导致MYCN扩增NB细胞增殖显著减慢(P<0.01),Ki-67阳性细胞比例明显减少(P<0.05);稳定敲低SLC7A11显著减少了NB细胞克隆形成数(P<0.01)。瞬时和稳定敲低SLC7A11对MYCN mRNA和N-MYC蛋白水平均未见明显影响。结论SLC7A11在MYCN扩增NB细胞系和临床样本中高表达,且其表达水平与患儿预后呈负相关,敲低SLC7A11显著抑制SK-N-BE(2)细胞的增殖和克隆形成能力。

溶质载体家族1成员5及谷氨酰胺酶2对人甲状腺癌细胞体外恶性行为的影响及机制研究

目的:探讨谷氨酰胺(Gln)代谢酶溶质载体家族1成员5(SLC1A5)及谷氨酰胺酶2(GLS2)对人甲状腺癌细胞体外恶性行为的影响及机制。方法:敲减人甲状腺癌细胞系8505C和8305C细胞中SLC1A5及GLS2 mRNA表达。通过噻唑蓝(MTT)、平板克隆形成及Transwell实验评估SLC1A5和GLS2对人甲状腺癌细胞体外恶性行为的影响。观察SLC1A5、GLS2抑制剂对甲状腺癌细胞体外增殖能力及c-myc蛋白表达的影响。结果:敲减人甲状腺癌8505C和8305C细胞中SLC1A5、GLS2 mRNA表达后,细胞体外增殖、克隆形成及迁移能力较对照组明显降低(均P<0.05)。8505C、8305C细胞分别加入抑制剂GPNA和CB-839处理后,与未加抑制剂细胞比较,细胞体外增殖能力和c-myc蛋白表达明显降低(均P<0.05)。结论:下调SLC1A5和GLS2表达可有效抑制甲状腺癌8505C、8305C细胞的体外增殖、克隆形成及迁移能力。SLC1A5、GLS2靶向抑制剂可通过下调c-myc癌基因发挥其抗甲状腺癌细胞生物活性的作用。靶向Gln代谢可能成为甲状腺癌的潜在治疗策略。

溶质载体家族22成员14和精子相关抗原6在特发性弱精子症患者精子中的表达

目的:探讨溶质载体家族22成员14(SLC22A14)和精子相关抗原6(SPAG6),在特发性弱精子症患者精子中的表达情况。方法:收集精子库合格捐精者(正常对照组)和特发性弱精子症患者(弱精子症组)各50例精子样本,采用非连续密度梯度离心纯化精子,分别用RT-PCR和Western印迹检测SLC22A14、SPAG6 mRNA及蛋白的表达。结果:RT-PCR检测结果显示,弱精子症组的SLC22A14、SPAG6 mRNA表达均显著低于正常对照组(SLC22A14:0.53±0.10 vs 0.77±0.08,t=12.834,P<0.01;SPAG6:0.52±0.10 vs 0.77±0.06,t=13.755,P<0.01),Western印迹检测结果显示,弱精子症组的SLC22A14和SPAG6蛋白表达量同样均显著低于正常对照组,分别为(SLC22A14:0.55±0.10 vs 0.80±0.09,t=12.884,P<0.01;SPAG6:0.56±0.09 vs 0.78±0.09,t=12.257,P<0.01)。结论:在特发性弱精子症患者中SLC22A14和SPAG6表达降低可能是导致弱精子症的重要原因之一。

溶质载体家族30成员8基因rs13266634C/T多态性与甘肃东乡族、汉族2型糖尿病的关系

目的探讨溶质载体家族30成员8(SLC30A8)基因rs13266634C/T单核苷酸多态性在甘肃东乡族、汉族人群中的分布及其与2型糖尿病(T_2DM)的关系。方法应用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)法检测甘肃东乡族、汉族T_2DM患者组(T_2DM组)和体检对照者组(对照组)SLC30A8基因rs13266634C/T多态性。结果 rs13266634C/T的CC基因型频率、C等位甚因的频率在东乡族和汉族T_2DM组高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。东乡族C等位基因携带者患T_2DM的风险是T等位基因的1.62倍;汉族C等位基因携带者患T_2DM的风险是T等位基因的1.54倍。结论甘肃东乡族和汉族人群均存在SLC30A8基因rs13266634C/T位点变异,C等位基因是其风险等位基因,SLC30A8基因可能是甘肃东乡族和汉族人群T_2DM的易感基因。

甘肃汉族人群溶质载体家族30成员8基因多态性与2型糖尿病的相关性

目的探讨甘肃汉族人群溶质载体家族30成员8(SLC30A8)基因多态性与2型糖尿病的相关性。方法采用聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性分析法,随机选取甘肃116例2型糖尿病患者(2型糖尿病组)及80例体检者(对照组)进行SLC30A8基因rs13266634C/T单核苷酸多态性检测,比较两组间基因型频率和等位基因频率及相关性;以稳态模型胰岛B细胞分泌功能指数评估胰岛B细胞功能,胰岛素抵抗指数评估胰岛素抵抗。结果 2型糖尿病组CC基因型频率明显高于对照组,而TT基因型频率低于对照组。2型糖尿病组CC基因型频率与TT基因型频率比较,有显著性差异(P<0.01);C风险等位基因患2型糖尿病的风险是T等位基因者的2.40倍,有显著性差异(P<0.01);CC基因型的胰岛B细胞分泌功能指数、空腹胰岛素显著低于TT基因型,差异有统计学意义P<0.05)。CC、CT、TT3种基因型的胰岛素抵抗指数,差异无统计学意义。结论甘肃汉族人群存在SLC30A8基因rs13266634多态性,rs13266634多态性与甘肃汉族2型糖尿病的发生相关;SLC30A8基因rs13266634的C等位基因可能是2型糖尿病的风险等位基因。SLC30A8基因增加2型糖尿病的易感性可能与胰岛B细胞功能下降有关,与胰岛素抵抗无明显相关性。

miR-27a通过抑制溶质载体家族7成员11(SLC7A11)诱导铁死亡引起大鼠脑缺血再灌注损伤

目的 探讨miR-27a在脑缺血再灌注损伤中的作用及分子机制。方法 雄性SD大鼠,随机分为对照组、假手术组、大脑中动脉阻塞再灌注(MCAO/R)模型组(依据再灌注时间又分为缺血2 h后再灌注3 h、 6 h、 12 h、 24 h组)以及阴性对照空载体组、 miR-27a激动剂(agomiR-27a)组、 miR-27a抑制剂(antagomiR-27a)组。采用Zea-Longa线栓法建立大鼠MCAO模型。实时荧光定量PCR检测脑组织中miR-27a和溶质载体家族7成员11(SLC7A11)水平,Zea-Longa评分法进行神经功能评分,2, 3, 5三苯氯化四氮唑(TTC)染色检测脑梗死面积,Western blot法检测谷胱甘肽过氧化物酶4(GPx4)、 SLC7A11蛋白水平,分别用谷胱甘肽(GSH)、丙二醛(MDA)、铁(Fe)检测试剂盒检测脑组织中GSH、 MDA、 Fe含量。通过荧光素酶报告基因验证miR-27a下游靶基因。结果 脑缺血再灌注后脑组织miR-27a水平上调,SLC7A11水平降低。抑制miR-27a表达后可显著减轻脑缺血再灌注后的神经功能障碍和脑梗死面积,抑制铁死亡。miR-27a直接靶向SLC7A11的3′-非翻译区(3′-UTR)区域,降低SLC7A11 mRNA表达。结论 脑缺血再灌注过程中上调的miR-27a可能是通过抑制靶基因SLC7A11水平,诱导铁死亡,从而引起脑组织损伤。

溶质载体家族6成员1通过调节PI3K/Akt信号通路磷酸化促进乳腺癌细胞的迁移和侵袭

目的探讨溶质载体家族6成员1(SLC6A1)对乳腺癌细胞迁移和侵袭的影响及分子机制。方法下载并综合分析数据集GSE125989和GSE100534,筛选差异基因;通过STRING数据库和Cytoscape 3.6.1软件构建差异基因的蛋白相互作用网络,并筛选hub基因;通过Ualcan和GEPIA数据库检测hub基因SLC6A1在乳腺癌中的表达及其对预后的影响;转染SLC6A1-siRNA干扰乳腺癌细胞MDA-MB-231中SLC6A1的表达;细胞划痕实验和Transwell实验检测乳腺癌细胞迁移和侵袭能力的变化;基因集富集分析和Western blotting检测SLC6A1在乳腺癌中发挥作用的机制;采用SC79激活Akt通路并检测细胞迁移和侵袭能力的变化。结果共筛选出92个乳腺癌原位癌与转移瘤的差异基因,并确定Ⅰ型胶原蛋白α1(COL1A1)、血管内皮生长因子A(VEGFA)、SLC6A1等20个hub基因;SLC6A1在乳腺癌组织中高表达(P<0.001),且与患者预后相关(P=0.01);SLC6A1表达被干扰后,乳腺癌细胞迁移和侵袭能力显著下降(P<0.05);SLC6A1表达降低可抑制PI3K/Akt信号通路的磷酸化(P<0.05);激活PI3K/Akt通路后SLC6A1-siRNA对乳腺癌细胞迁移和侵袭的抑制作用消失(P<0.05)。结论SLC6A1通过调节PI3K/Akt信号通路促进乳腺癌的侵袭和转移。

槲皮素通过抑制溶质载体家族7成员11表达诱导前列腺癌细胞铁死亡的临床研究

目的 探讨槲皮素对溶质载体家族7成员11(SLC7A11)的调节作用,分析其对前列腺癌(PC)细胞铁死亡的影响。方法 将对数期LNCaP细胞株随机分为对照组、槲皮素低剂量组、槲皮素高剂量组、槲皮素高剂量+SLC7A11阴性转染组、槲皮素高剂量+SLC7A11过表达组。细胞计数试剂盒-8(CCK-8)法检测各组LNCaP细胞的增殖情况;流式细胞仪检测各组LNCaP细胞凋亡情况;免疫印迹法检测SLC7A11、谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)、p53相关蛋白表达情况;试剂盒法检测丙二醛(MDA)含量情况。结果 与对照组比较,槲皮素低剂量组、槲皮素高剂量组LNCaP细胞增殖抑制率、凋亡率、MDA、p53蛋白升高(P<0.05),SLC7A11、GPX4相关蛋白表达水平降低(P<0.05),且槲皮素低剂量组、槲皮素高剂量组间上述各项指标比较,差异具有统计学意义(P<0.05);与槲皮素高剂量组、槲皮素高剂量+SLC7A11阴性转染组比较,槲皮素高剂量+SLC7A11过表达组LNCaP细胞增殖抑制率、凋亡率、MDA、p53降低(P<0.05),SLC7A11、GPX4相关蛋白表达水平升高(P<0.05)。结论 槲皮素可能通过抑制SLC7A11表达诱导PC细胞铁死亡。

微小RNA-148a-3p与溶质载体家族7成员11在肺癌组织中表达及对肿瘤细胞铁死亡的影响

目的观察微小RNA(miRNA,miR)-148a-3p与溶质载体家族7成员11(SLC7A11)在肺癌组织的表达及其对肿瘤细胞铁死亡的影响。方法选取河南省人民医院胸外科2020年6月至2023年6月收治的肺癌临床样本作为研究对象,癌旁组织作为对照研究对象。采用荧光定量聚合酶链反应(PCR)和蛋白质免疫印迹计数分析miR-148a-3p与SLC7A11的表达水平。人非小细胞肺癌细胞H1299分为miRNA对照组和miR-148a-3p组,采用慢病毒感染构建细胞系。采用细胞计数试剂盒(CCK-8)和克隆形成实验分析两组细胞的增殖能力;采用体外移植瘤分析两组细胞在裸鼠体内的体积和重量;采用蛋白质免疫印迹分析铁死亡相关蛋白谷胱甘肽过氧化物酶4表达水平;生物信息学和双荧光素酶报告基因分析miR-148a-3p靶基因,并分析靶基因表达水平。组间计量数据比较采用t检验。结果癌旁组织中miR-148a-3p表达水平(1.02±0.19)明显高于肺癌组织(0.54±0.19),差异有统计学意义(t=14.790,P<0.05)。癌旁组织中SLC7A11信使RNA(mRNA)表达水平(0.66±0.13)明显低于肺癌组织(1.48±0.17),差异有统计学意义(t=27.180,P<0.05)。miRNA对照组细胞吸光度(A)值(1.98±0.11)明显高于miR-148a-3p组细胞(1.48±0.19),差异有统计学意义(t=5.674,P<0.05)。miRNA对照组细胞克隆形成率[(85.07±4.50)%]明显高于miR-148a-3p组细胞[(53.68±8.89)%],差异有统计学意义(t=7.714,P<0.05)。miRNA对照组细胞肿瘤体积[(888.40±90.22)mm^(3)]明显高于miR-148a-3p组细胞[(609.78±102.92)mm^(3)],差异有统计学意义(t=6.438,P<0.05)。miRNA对照组细胞肿瘤重量[(5.34±0.75)g]明显高于miR-148a-3p组细胞[(2.28±0.71)g],差异有统计学意义(t=9.379,P<0.05)。SLC7A11是miR-148a-3p的靶基因。miRNA对照组细胞SLC7A11(0.78±0.07)明显高于miR-148a-3p组细胞(0.48±0.09),差异有统计学意义(t=7.580,P<0.05)。miRNA对照组细胞谷胱甘肽过氧化物酶4(1.09±0.09)明显高于miR-148a-3p组细胞(0.39±0.09),差异有统计学意义(t=15.480,P<0.05)。结论miR-148a-3p在肺癌组织中表达显著下调,通过SLC7A11调节肺癌细胞铁死亡,进而影响肺癌的生长和发展。

茯苓酸通过Nrf2/SLC7A11/GPX4信号通路调控铁死亡改善阿尔茨海默病大鼠认知障碍的研究

背景阿尔茨海默病(AD)是一种常见且不可逆转的神经退行性脑疾病,严重影响患者的生活品质和生存质量,目前仍缺乏有效的治疗方法延缓或阻止疾病进展。中药及其活性成分在防治AD方面具有重要潜力。目的探讨茯苓酸(PA)对AD大鼠认知障碍及核因子E2相关因子2(Nrf2)/溶质载体家族7A11(SLC7A11)/谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)信号通路的影响。方法2022年1—9月将75只6~8周龄雄性SPF级SD大鼠依据随机数字表法分为对照组(Control组)、AD模型组(Model组)、PA治疗组(PA组),PA+Nrf2抑制剂组(PA+ML385组),除Control组外制备AD大鼠模型。造模成功后,PA组腹腔注射50 mg/kg PA,PA+ML385组腹腔注射50 mg/kg PA+30 mg/kg Nrf2抑制剂ML385,Control组与Model组腹腔注射等量0.9%氯化钠溶液。末次给药24 h后进行Morris水迷宫实验,第2、4、6天进行定位航行实验,记录大鼠到达平台的时间(逃避潜伏期),第7天移走平台,记录大鼠在120 s内滞留平台时间和穿越平台次数。Nissl染色后观察各组大鼠海马神经元病理变化,普鲁士蓝染色检测海马组织铁沉积,免疫荧光染色检测海马神经元GPX4表达,检测海马组织谷胱甘肽(GSH)、丙二醛(MDA)、Fe2+含量,蛋白质印迹法(Western blotting)检测大鼠海马组织Nrf2、SLC7A11、GPX4蛋白表达。结果末次给药第2、4、6天Model组逃避潜伏期高于Control组、PA组,PA+ML385组高于PA组,差异有统计学意义(P<0.05);Model组平台停留时间、穿越平台次数低于Control组、PA组,PA+ML385组低于PA组,差异有统计学意义(P<0.05)。Nissl染色结果示Model组神经元坏死严重,细胞核皱缩,尼氏体数目减少;PA组神经元坏死减少,排列紧密且尼氏体增多;PA+ML385组神经元损伤明显加重,尼氏体数目减少。普鲁士蓝染色结果示Model组铁沉积较Control组增加,与Model组比较,PA组铁沉积减少,PA+ML385组较PA组铁沉积增多。免疫荧光染色结果示Model组绿色荧光减弱,GPX4阳性细胞减少,PA组细胞绿色荧光较Model组增强,GPX4阳性细胞增多,PA+ML385组较PA组GPX4阳性细胞减少。Model组GSH低于Control组、PA组,PA+ML385组低于PA组,差异有统计学意义(P<0.05);Model组MDA、Fe2+高于Control组、PA组,PA+ML385组高于PA组,差异均有统计学意义(P<0.05)。Model组Nrf2、SLC7A11、GPX4蛋白相对表达量低于Control组、PA组,PA+ML385组低于PA组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论PA可改善AD大鼠认知障碍,其机制可能与通过激活Nrf2/SLC7A11/GPX4信号通路抑制铁死亡有关。

肿瘤睾丸抗原CT45-5基因小干扰RNA表达载体的构建及干扰效果鉴定

目的:构建肿瘤睾丸抗原CT45家族中5号成员基因(CT45-5)的小干扰RNA(siRNA),并检测其对HeLa及HeLa/Fhit细胞内源性CT45-5基因及外源脆性组氨酸三联体(Fhit)基因表达的干扰效果。方法:根据CT45-5基因序列,通过生物信息学方法对靶向CT45-5基因的siRNA进行预测,从中筛选出2对合理的CT45-5-siRNA,将其克隆到siRNA表达载体pSilencer 2.1-U6 Hygro中,转化大肠杆菌DH5α,挑取阳性克隆进行测序鉴定;将构建的CT45-5-siRNA重组载体转染人宫颈癌细胞HeLa及HeLa/Fhit细胞,Western印迹检测siRNA对HeLa及HeLa/Fhit细胞内源性CT45-5及外源Fhit基因表达的干扰效果。结果:构建了2个CT45-5-siRNA重组质粒,其中一条对CT45-5基因具有明显的干扰作用,并且Fhit基因表达也被抑制。结论:构建的CT45-5-siRNA为与CT45-5功能相关的基因研究奠定了基础。

miR-924、SLC1A5在肺癌组织中的表达及其在预后评估中的价值

目的 探讨miR-924和溶质载体家族1成员5(SLC1A5)在肺癌患者预后评估中的价值。方法 选取2018年2月—2019年2月南阳市中心医院肺癌患者97例,收集所有患者的临床资料,并收集癌组织和癌旁组织(距肿瘤边缘>2 cm),检测miR-924、SLC1A5 mRNA和SLC1A5蛋白表达。采用Pearson相关分析评估miR-924与SLC1A5 mRNA的相关性。采用Kaplan-Meier生存曲线评估肺癌患者的生存情况。采用Cox回归分析评估肺癌患者预后不良的危险因素。结果 与癌旁组织比较,癌组织miR-924相对表达量降低(P<0.001),SLC1A5mRNA相对表达量升高(P<0.001)。癌组织SLC1A5蛋白阳性率显著高于癌旁组织(P<0.001)。癌组织miR-924表达与SLC1A5 mRNA表达呈负相关(r=-0.843,P<0.05)。根据癌组织miR-924相对表达量均值或SLC1A5蛋白的表达情况分别分为高表达组、低表达组和阳性组、阴性组。miR-924低表达组与高表达组之间、SLC1A5阳性组与阴性组之间分化程度、临床分期差异均有统计学意义(P<0.05)。Kaplan-Meier生存曲线分析结果显示,miR-924高表达组累积生存率高于低表达组(Log-rankχ^(2)=5.453,P<0.05);SLC1A5阳性组累积生存率低于阴性组(Log-rankχ^(2)=9.259,P<0.05)。多因素Cox回归分析结果显示,临床分期Ⅲ期、miR-924低表达、SLC1A5蛋白表达阳性均是肺癌患者预后不良的危险因素(P<0.05)。结论 肺癌患者癌组织mi R-924和SLC1A5均呈异常表达,或可作为肺癌预后评估的生物标志物。

鼻咽癌组织中GPX4和SLC7A11的表达及临床意义

目的探讨鼻咽癌(NPC)组织中谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)、溶质载体家族7成员11(SLC7A11)的表达及临床意义。方法将2016年3月至2017年3月于本院诊治的98例NPC患者纳入研究作为NPC组,同期因鼻中隔偏曲接受手术治疗的患者作为对照组。采用免疫组化检测NPC组织和正常鼻黏膜组织中GPX4、SLC7A11的表达情况。采用Spearman秩相关分析癌组织中GPX4、SLC7A11表达的相关性。比较不同NPC临床参数患者之间GPX4、SLC7A11表达阳性率。采用Kaplan-Meier法分析GPX4、SLC7A11表达对NPC患者生存预后的影响。采用单因素及多因素Cox回归分析NPC患者生存预后的影响因素。结果NPC组织中GPX4、SLC7A11表达阳性率分别为75.51%(74/98)、73.47%(72/98),分别高于正常鼻黏膜组织中的11.67%(7/60)、13.33%(8/60),差异均有统计学意义(P<0.001)。NPC组织中GPX4与SLC7A11表达呈正相关(r=0.724,P<0.001)。不同临床分期、肿瘤分化程度、淋巴结转移情况及放疗敏感性NPC患者癌组织中GPX4、SLC7A11表达阳性率比较,差异均有统计学意义(P<0.05)。GPX4阳性及阴性表达组的5年总体生存率分别为66.22%(49/74)、91.67%(22/24);GPX4阳性表达组累积生存明显低于阴性表达组(Log-rankχ^(2)=5.822,P<0.001)。SLC7A11阳性及阴性表达组5年总体生存率分别为66.67%(48/72)、88.46%(23/26);SLC7A11阳性表达组累积生存明显低于阴性表达组(Log-rankχ^(2)=5.041,P=0.012)。临床分期Ⅲ~Ⅳ期(HR=1.608,95%CI:1.225~2.112)、淋巴结转移(HR=1.917,95%CI:1.319~2.799)、GPX4阳性(HR=1.839,95%CI:1.228~2.753)、SLC7A11阳性(HR=1.738,95%CI:1.246~2.426)是影响NPC患者生存预后的独立危险因素。结论NPC中GPX4、SLC7A11表达水平升高,两者与不良临床病理特征有关,是NPC患者预后评估的潜在标志物。

LPIN1/PPARA通过抑制SLC47A1介导的神经元铁死亡缓解帕金森病模型大鼠病情进展的机制研究

目的探究脂蛋白1(lipin1,LPIN1)对帕金森病(Parkinson’s disease,PD)模型大鼠病情进展的影响及其调控的可能分子机制。方法采用6-羟基多巴胺(6-hydroxydopamine hydrobromide,6-OHDA)注射大鼠单侧的内侧前脑束构建PD大鼠模型,并稳定转染LPIN1过表达腺病毒,评估大鼠行为学变化;检测大鼠脑组织中Fe^(2+)和还原型谷胱甘肽(glutathione,GSH)含量及酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase,TH)蛋白水平;HE染色观察大鼠脑组织病理变化。构建体外PD细胞模型,检测细胞中TH,α-突触核蛋白(α-synuclein,α-syn),LPIN1蛋白水平及细胞活力;转染LPIN1小干扰siRNA序列和过表达载体及过氧化物酶增殖物激活受体A(peroxisome proliferator-activated receptor A,PPARA)小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)和过表达载体,或用铁死亡诱导剂Erastin处理细胞24 h,后用6-OHDA处理细胞48 h。检测各组细胞中Fe^(2+)含量、活性氧(reactive oxygen species,ROS)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)、GSH和炎症因子水平以评估铁死亡;CCK-8检测细胞增殖活力,Western blot法检测铁死亡相关蛋白表达。通过STRING数据库预测LPIN1的互作蛋白PPARA,利用Co-IP分析进行验证;JASPAR生物信息学网站预测PPARA与溶质载体蛋白家族47成员A1(solute carrier family 47 member 1,SLC47A1)启动子的结合位点,利用Ch-IP分析进行验证。结果模型组大鼠皮毛悚立,表现出身体持续震颤、动作迟缓、活动能力减弱等PD症状;LPIN1组大鼠运动行为及PD症状较模型组改善/减轻。与假手术组相比,模型组大鼠运动总路程缩短、平均速度降低、步长减小、总静止时间延长、步宽增宽、步态变异率增大,差异具有统计学意义(t=6.816,7.026,26.556,7.454,8.503,7.971,均P<0.05);模型组大鼠脑组织中Fe^(2+)含量升高,GSH含量及TH蛋白表达降低,差异具有统计学意义(t=8.305,13.305,7.709,均P<0.05)。LPIN1组大鼠行为学评估、各指标水平及脑组织病理改变较模型组明显改善/减轻。6-OHDA呈剂量依赖性降低PC-12细胞活力及TH,LPIN1蛋白水平,升高α-syn蛋白水平,差异具有统计学意义(F=31.023,7.350,9.124,15.841,均P<0.05)。沉默LPIN1加剧了6-OHDA对PC-12细胞活力的抑制作用(t=2.209,P<0.05),过表达LPIN1则可抵消6-OHDA的作用(t=4.989,P<0.05)。过表达LPIN1降低IL-1β,IL-6分泌,升高SLC47A1和GPX4蛋白水平,降低Fe^(2+),MDA含量和ROS水平,升高GSH含量(t=3.013~11.639,均P<0.05);Erastin可逆转LPIN1过表达对铁死亡的抑制作用,降低PC-12细胞活力(t=3.087~7.581,均P<0.05)。LPIN1与PPARA蛋白互作并促进PPARA表达,PPARA与SLC47A1启动子结合并促进SLC47A1转录激活。过表达PPARA可抵消LPIN1沉默对PC-12细胞的影响。结论过表达LPIN1可能通过抑制PPARA/SLC47A1轴介导的铁死亡,减少神经元细胞凋亡,进而缓解PD模型大鼠的病情进展。

茯苓酸通过调节Nrf2/SLC7A11/GPX4信号通路抑制氧糖剥夺/复氧诱导的心肌细胞铁死亡

目的:探究茯苓酸通过调节核因子E2相关因子2(Nrf2)/溶质载体家族7成员11(SLC7A11)/谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)信号通路抑制氧糖剥夺/复氧(OGD/R)诱导的心肌细胞铁死亡的机制。方法:体外培养大鼠心肌细胞H9c2,诱导建立细胞OGD/R模型后以0、1.0、2.5、5.0、10.0、20.0μmol/L茯苓酸处理24 h,通过细胞计数试剂盒-8(CCK-8)法检测各处理组细胞活力后筛选出合适的茯苓酸作用浓度。将H9c2细胞随机分为对照组、模型组、茯苓酸组、ML385组(Nrf2抑制剂组)、茯苓酸+ML385组,除对照组外其余各组建立细胞OGD/R模型后以茯苓酸、ML385分组处理,采用CCK-8法与流式细胞实验分别检测各组H9c2细胞活力、凋亡率;采用试剂盒检测各组H9c2细胞培养基上清中乳酸脱氢酶(LDH)、促炎因子[前列腺素E2(PGE2)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)]、抗炎因子白细胞介素(IL)-10水平及细胞抗氧化因子[过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽(GSH)]、铁死亡相关指标[铁含量、丙二醛(MDA)]水平;采用免疫印迹实验检测各组H9c2细胞凋亡及Nrf2/SLC7A11/GPX4信号通路相关蛋白表达。结果:与对照组比较,模型组细胞凋亡率、LDH释放量、细胞培养基上清中PGE2及TNF-α水平、细胞铁含量、MDA水平及Bax、Caspase-3蛋白表达均升高(P<0.05),细胞活力、细胞培养基上清中IL-10水平、细胞CAT及GSH水平、Bcl-2及Nrf2、SLC7A11、GPX4蛋白表达降低(P<0.05)。与模型组比较,茯苓酸组细胞凋亡率、LDH释放量、细胞培养基上清中PGE2及TNF-α水平、细胞铁含量、MDA水平及Bax、Caspase-3蛋白表达均降低(P<0.05),细胞活力、细胞培养基上清中IL-10水平、细胞CAT及GSH水平、Bcl-2及Nrf2、SLC7A11、GPX4蛋白表达升高(P<0.05);ML385组细胞凋亡率、LDH释放量、细胞培养基上清中PGE2及TNF-α水平、细胞铁含量、MDA水平及Bax、Caspase-3蛋白表达均升高(P<0.05),细胞活力、细胞培养基上清中IL-10水平、细胞CAT及GSH水平、Bcl-2及Nrf2、SLC7A11、GPX4蛋白表达降低(P<0.05)。与茯苓酸组比较,茯苓酸+ML385组细胞凋亡率、LDH释放量、细胞培养基上清中PGE2及TNF-α水平、细胞铁含量、MDA水平及Bax、Caspase-3蛋白表达均升高(P<0.05),细胞活力、细胞培养基上清中IL-10水平、细胞CAT及GSH水平、Bcl-2及Nrf2、SLC7A11、GPX4蛋白表达降低(P<0.05)。结论:茯苓酸可通过激活Nrf2/SLC7A11/GPX4信号而抑制OGD/R诱导的心肌细胞炎症、脂质过氧化与铁死亡,增强其抗氧化活性及细胞活力,最终减轻其细胞凋亡损伤。

SMAD家族成员4 shRNA干扰慢病毒构建与分析

目的制备shRNA干扰人SMAD家族成员4(SMAD4)的慢病毒载体(shRNA-SMAD4),为深入研究BMPs/SMAD信号通路奠定基础。方法利用在线干扰设计网页进行干扰引物设计,根据小干扰RNA的设计原则,选取3对针对SMAD4特异性干扰引物而合成。合成的片段连接到慢病毒载体质粒pSIH1-H1,形成pSIH1-H1-shRNA-SMAD4质粒。用PCR及测序对其鉴定,然后与慢病毒包装质粒混匀,由脂质体转染至HEK293T细胞进行包装,产生慢病毒shRNA-SMAD4,并收集上清液感染乳腺癌MDA-MB-231细胞,通过RT-PCR及Western Blot鉴定重组慢病毒干扰效果。结果(1)shRNA干扰SMAD4特异性引物的获得。(2)pSIH1-H1-shRNA SMAD4质粒经PCR验证和测序后,证实构建成功。(3)shRNA-SMAD4在HEK293T中重组成慢病毒,并成功感染MDA-MB-231。(4)shRNA-SMAD4感染乳腺癌MDA-MB-231细胞后SMAD4的表达降低。结论成功构建shRNA-SMAD4慢病毒载体,并能有效抑制SMAD4表达。